新鲜制备及中长期保存的羊膜细胞外基质结构特征

目的：制备并保存羊膜细胞外基质，观察新鲜制备及中长期保存的羊膜细胞外基质的结构特点。方法：实验于2004-01／12在赣南医学院科研中心完成。（里）采用目前国际公认的羊膜制备与保存方法，制备并保存羊膜细胞外基质。②取新鲜制备的羊膜细胞外基质、中期保存的羊膜细胞外基质（4℃恒温冰箱储存备用1周）、长期保存的羊膜细胞外基质（-80℃超低温冰箱中储存备用3个月），通过大体、光镜、透射电镜和扫描电镜观察其形态及结构特点。结果：①羊膜细胞外基质大体观察：新鲜制备及中、长期保存的羊膜细胞外基质均为透明、无色、有一定韧性生物膜，其厚度约0．02～0．4mm。②光镜观察结果：新鲜制备和经中、长期保存的羊膜细胞外基质可见2层结构：基底膜厚薄不均，无细胞结构；致密层由结缔组织组成。新鲜羊膜与中期保存的羊膜细胞外基质致密层较长期保存的羊膜细胞外基质略厚；新鲜羊膜细胞外基质可见少量成纤维细胞，而中、长期保存羊膜细胞外基质的成纤维细胞较少见。③透射及扫描电镜观察结果：新鲜制备与中期保存的羊膜细胞外基质两者的基底膜厚约0．1～0．2μm，致密层厚约30～400μm，其主要结构由胶原纤维、网状纤维和基质组成，偶见成纤维细胞；长期保存的羊膜细胞外基质的基底膜厚约0．2-0．3μm，致密层厚约20-400μm，其中致密层的主要成分为胶原纤维和网状纤维、无细胞结构；三者的胶原原纤维结构完全一致。结论：羊膜经过组织工程技术处理后去除其上皮细胞或使上皮细胞失活．保留基底膜与致密层，形成羊膜细胞外基质。羊膜细胞外基质主要成分是胶原纤维和网状纤维，因其免疫原性低于羊膜并具有抗炎性，是一种特殊的细胞外基质，作为一种细胞黏附的基膜和生物支架，具有广阔的研究和应用前景。因此羊膜细胞外基质可作为体外细胞培养的生物载体而应用于基础研究。     

羊膜与羊膜细胞外基质在组织工程中的应用

目的:从羊膜和羊膜细胞外基质结构特征、两者在组织工程中作为细胞支撑物负载细胞在实验研究、临床应用及羊膜上皮细胞可能是组织工程技术一种新的细胞来源等方面对该领域的研究现状进行综述,并分析了目前存在的问题及未来应用前景。资料来源:应用计算机检索Medline 2000-01/2007-03相关羊膜与羊膜细胞外基质在组织工程中应用方面的文献,检索词"amniotic membrane,tissue engineering",限定文献语言种类为English;同时检索中国期刊全文数据库、万方数据库2000-01/2007-03相关文献,检索词"羊膜,组织工程",限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选取符合研究要求的有关文章找全文。纳入标准:①有关羊膜与羊膜细胞外基质结构特征的研究。②羊膜与羊膜细胞外基质作为组织工程支架材料的研究性论文。③有关羊膜细胞作为组织工程种子细胞的研究。排除标准:相关度不大的文章,重复性的文章。资料提炼:共检索到90篇关于羊膜与羊膜细胞外基质在组织工程中应用的文献,最终纳入30篇符合标准的文献。资料综合:①羊膜与羊膜细胞外基质结构特征:正常人羊膜组织结构分为上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维细胞层及海绵层。上皮细胞层含有羊膜上皮细胞和由羊膜上皮细胞分泌的多种生长因子。羊膜细胞外基质:新鲜制备的羊膜细胞外基质与中、长期保存羊膜细胞外基质致密层结构均相似。②羊膜与羊膜细胞外基质作为组织工程支架材料的应用:羊膜与羊膜细胞外基质可以作为构建周围神经组织工程、皮肤组织工程、角膜组织工程、肌腱组织工程及骨组织工程的修复材料。③羊膜细胞作为组织工程种子细胞的应用:羊膜细胞成分有羊膜上皮细胞,成纤维细胞及未分化的间充质细胞。④分析了羊膜与羊膜细胞外基质在组织工程中应用目前存在的问题及未来应用前景。结论:人羊膜与羊膜细胞外基质作为一种生物材料,其取材、保存和使用需遵循严格的医学标准,但目前尚无统一检测标准。随着生物学技术和其他相关技术的发展,羊膜与羊膜细胞外基质在组织工程中的应用潜能必将得到不断的展现。     

液氮保存时间对脱细胞血管基质支架材料组织形态及力学特性的影响

背景:血管脱细胞组织基质作为天然生物支架材料的制备与临床应用具有一定的时差,保存条件对其影响逐渐收到人们重视.目的:拟观察不同液氮保存时间对脱细胞血管基质支架材料组织形态及力学特性的影响.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2007-08/2008-05在青岛市市立医院心脏外科实验室完成.材料:健康新西兰兔10只,体质量550～600 g,用于制备脱细胞血管基质.方法:采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂法处理兔胸主动脉制备脱细胞血管基质.根据液氮保存时间的不同将制取的血管随机分为液氮1月组,液氮2月组和液氮3月组;另设新鲜组:未用液氮保存而作为对照.主要观察指标:苏木精-伊红染色、扫描电镜观察各组脱细胞血管基质形态变化,并作力学测试,包括Lagrange应变、Lagrange应力、伸长比和极限应力.结果:苏木精-伊红染色可见新鲜组血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维保持原来的形态和结构,呈网状排列,细胞已基本去除.液氮保存组光镜下见与新鲜组无明显差异.扫描电镜见新鲜组血管脱细胞组织基质的纤维结构完整,胶原纤维无断裂,为网状和多孔状,孔径为(100～150)×(10～20)μ m.液氮保存组胶原纤维结构完整,呈网状捧列,胶原纤维无断裂现象,孔径与新鲜组无明显差异.各组力学指标相比,差异无显著性意义(P>0.05).结论:不同液氮保存时间对脱细胞血管基质的形态学、组织学以及力学特性方面没有明显影响.     

组织工程血管基质的制备及保存

背景:为构建全生物化组织工程血管,制备及保存脱细胞血管基质.目的:制备组织工程血管基质,观察其保存于液氮中的可行性.方法:采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂法处理兔胸主动脉来制备组织工程血管基质,标本作大体、光镜及扫描电镜、透射电镜观察,并将制备的血管基质放入液氮中保存,3个月后取出作扫描电镜观察.结果与结论:经该法处理的兔血管细胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂,细胞外基质保持完好,液氮保存3个月后扫描电镜观察与新鲜基质无明显差别.提示酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法是制备组织工程血管基质的较好方法,制备的血管基质可放入液氮中进行短期保存.     

异种去细胞真皮基质在体内转归的初步研究

目的 初步研究异种（猪）去细胞真皮基质在体内的转归。方法 经曲通（Triton）X-100、胰蛋白酶处理得到异种（猪）去细胞真皮基质后，将其包埋于SD大鼠皮下，于术后1、2、4、6、8、12、16、20和30周观察异种（猪）去细胞真皮基质的大体形态及组织学变化。结果 制备的异种（猪）去细胞真皮基质去细胞成分，胶原纤维排列有序，基底膜结构完整。大体观察异种（猪）去细胞真皮基质原始形态随时间延长而逐渐模糊．组织学观察异种（猪）去细胞真皮基质1周以炎性细胞浸润为主，以后成纤维细胞、毛细血管逐渐增多，真皮胶原排列逐渐规则、致密。结论 异种（猪）去细胞真皮基质可在体内作为支架长期存在，并可诱导自身成纤维细胞及毛细血管有序长入。     

猪主动脉脱细胞血管基质制备及保存

目的探讨脱细胞血管基质的制备和保存方法。方法采用酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理猪胸主动脉制备脱细胞血管基质,标本行苏木精-伊红染色,大体、光镜及扫描电镜、透射电镜观察。并将标本放入液氮中保存,于保存1、2、3月分别取标本用20g/L戊二醛固定,扫描电镜观察。结果经该法处理的猪血管细胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂,细胞外基质保持完好。液氮保存后1、2、3月扫描电镜观察与新鲜标本无明显差别。结论酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法是制备脱细胞血管基质的较好方法,制得的脱细胞血管基质可放入液氮中保存。     

脱细胞猪角膜表面基底膜成分的检测

背景:前期实验显示脱细胞猪角膜具有良好的组织相容性,可以支持角膜细胞和皮肤上皮细胞的生长。目的:检测脱细胞猪角膜是否保存了利于角膜上皮细胞生长的重要组织结构—基底膜。方法:利用荧光抗体对脱细胞猪角膜表面的基底膜成分(层粘蛋白和Ⅳ型胶原)进行免疫组织化学检测,荧光显微镜下观察脱细胞猪角膜表面是否保存了基底膜成分。结果与结论:免疫荧光染色显示脱细胞猪角膜前基质表面层粘蛋白和Ⅳ型胶原呈阳性表达,与新鲜猪角膜表面基底膜的荧光表达相同,表明脱细胞猪角膜保存了利于角膜上皮细胞生长的基底膜。     

新鲜与保存羊膜移植与小梁切除后的瘢痕组织增生

背景:目前新鲜羊膜在眼表疾病方面得到了广泛应用,并且取得了抗纤维组织增生、抑制新生血管形成及减轻炎症反映等方面的满意疗效,但在青光眼方面的应用还未见报道.目的:观察新鲜羊膜移植对小梁切除术后瘢痕组织的抑制作用,并与保存羊膜对比.方法:将36只新西兰大白兔按随机数字表法分为3组,新鲜羊膜组和保存羊膜组分别进行新鲜羊膜移植、保存羊膜移植联合小梁切除术,空白组行单纯小粱切除术.分别于移植后1,2,3,4周检查滤过泡的形态和功能,用链酶亲和素免疫组织化学法检测滤过泡周围组织中血小板衍生生长因子的含量.结果与结论:新鲜羊膜组和保存羊膜组移植后滤过泡轻微隆起,有较好的滤过功能:观察病理组织切片表明滤过道内成纤维细胞增生较少,瘢痕组织也比较疏松.空白组滤过道破增生的纤维组织代替,成纤维细胞比较多.免疫组化结果显示,新鲜羊膜组和保存羊膜组的血小板衍生生长因子的表达少于空白组,新鲜羊膜组的表达少于保存羊膜组.提示新鲜羊膜和保存羊膜能改善滤过泡功能,减少搬痕形成,维持滤过道的通畅,并且新鲜羊膜的作用效果优于保存羊膜.     

无细胞真皮支架与同种细胞相容性的动态观察

背景：无细胞真皮作为真皮替代材料已广泛应用于临床皮肤缺损的修复,能否将其应用范围扩展使其作为真皮支架用于组织工程皮肤的构建呢？目前国内外对这一方面都在进行着大量的研究。目的：动态评价同种无细胞真皮基质的细胞相容性,验证其作为皮肤组织工程支架材料的可行性。设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-10/2008-03在中国辐射防护研究院组织工程实验室完成。材料：试验中皮肤样品源自武警山西总队医院行包皮环切术的健康儿童切除的包皮。方法：采用高渗盐-SDS-胰蛋白酶法制备同种无细胞真皮,组织块贴壁法培养人成纤维细胞,使其接种于支架材料上,通过苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察成纤维细胞在支架材料上的贴附、生长、增殖以及迁移情况。主要观察指标：①同种无细胞真皮基质的形态结构。②无细胞真皮基质的细胞相容性。结果：同种无细胞真皮基质肉眼观察为乳白色,柔韧有弹性,苏木精-伊红染色和扫描电镜显示表皮以及真皮乳头层和网状层细胞以及细胞成分已经完全去除,且真皮的胶原网状支架保留完整;接种该支架材料上的成纤维细胞生物学行为活跃,不仅能够在其表面贴附、生长、增殖,并沿细胞间隙向真皮内部浸润生长,穿过乳头层达到网状层,而且分泌细胞外基质,填充细胞间隙形成膜片样结构。结论：通过高渗盐-SDS-胰蛋白酶法制备的无细胞真皮具有良好的细胞相容性,可作为真皮支架材料用于组织工程皮肤的构建。     

人羊膜与成纤维细胞的共培养在组织工程中的应用

目的通过人羊膜与成纤维细胞的共培养,来观察成纤维细胞在 HA上的生长特性,以及胶原原纤维产生情况,为使人羊膜成为组织工程皮肤的载体打下基础.方法 将不同浓度的成纤维细胞种植于人羊膜上进行共培养,观察细胞在人羊膜细胞外基质(HA-ECM)的生长、排列以及细胞的粘附和胶原原纤维产生情况.结果 梭形的成纤维细胞在 HA-ECM上生长良好,放射状或平行排列;组织切片发现 HA-ECM上有较多梭形细胞附着,细胞排列紧密;电镜下见成纤维细胞胞膜基底部向 HA-ECM内伸出数个突起,细胞与羊膜基质粘附相当牢固,胞外有较多胶原原纤维堆积.结论 种植于 HA-ECM的成纤维细胞有一个最适宜的细胞浓度 3.5× 109L-1; HA-ECM具有支架和渗透作用,成纤维细胞在其上生长、粘附良好,胶原合成、分泌旺盛, HA-ECM是一种较理想的成纤维细胞载体.