一种核酸适配体高敏检测方法的建立及应用评价

本文建立一种基于免疫印迹的核酸适配体高敏定量分析的检测方法,并探讨其在适配体药物靶向性研究中的应用价值。首先用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行核酸适配体的分离,然后利用电转的方法将凝胶上的核酸适配体转移至PVDF膜上,先后孵育Rabbit Anti-Biotin和HRP-Streptavidin抗体,最后利用化学发光仪进行成像。结果显示核酸适配体可以通过该方法进行定量检测分析,且该方法检测灵敏度高,能够识别荧光染料法检测不到的浓度范围。此外,该方法只识别被生物素修饰的核酸适配体,特异性强。结果提示,核酸免疫印记法可以作为核酸适配体药物靶向性研究的一个定量检测手段。     

基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的 利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法.方法 利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测.考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光...     

核酸适配体对岩沙海葵毒素细胞毒性保护作用

目的 核酸适配体（Aptamer）是利用指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选得到的单链DNA或RNA片段,能高亲和、高特异性地与靶标分子结合。岩沙海葵毒素（Palytoxin,PLTX）是目前已知的最具毒性的非蛋白质类天然海洋毒素之一。基于核酸适配体对PLTX的特异性靶向功能,探究核酸适配体对细胞毒性的保护作用。方法 采用细胞毒性实验分别检测比较了PLTX对NIH-3T3、CHO-K1、HACAT三种不同细胞的毒性作用,以及适配体拮抗PLTX的细胞毒作用。采用红细胞溶血实验检测PLTX对人红细胞的溶血作用,以及适配体抑制PLTX的溶血活性作用。结果 三种细胞毒性曲线结果显示,HACAT细胞的ID50约为3.42ng/ml,CHO-K1细胞的ID50约为1.06×10-2ng/ml,NIH-3T3细胞的ID50约为1.39×10-2ng/ml。在不同浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对HACAT细胞的毒性作用（P<0.05）。在50nM PLTX浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对人红细胞溶血活性作用（P<0.05）。结论 实验结果表明HACAT细胞对2.5×10-3~2.5×102ng/ml浓度范围的PLTX毒性作用较敏感;核酸适配体对HACAT细胞具有细胞毒性保护作用。在50nM PLTX浓度下,相应浓度适配体能够有效抑制PLTX对人红细胞的溶血活性,起到显著细胞保护作用。     

海洋生物毒素检测技术研究进展

海洋生物毒素具有分布广、毒性强及解毒难等特性,对我国公共安全和人民健康造成极大的威胁.为了保护我国的公共安全,保障人民健康,对海洋生物毒素检测的研究已经越来越多.目前,海洋生物毒素的检测方法有生物检测法、免疫分析法、液相色谱法、酶活力抑制分析法、细胞毒性试验等.本文将对海洋生物毒素检测技术的研究进展作一综述.     

核酸适配体在肿瘤液体活检中的应用

肿瘤的液体活检（CTCs、ctDNA和外泌体）可以提供全面、动态的病理信息,对肿瘤的早期诊疗、疗效监测和复发监控有重要作用,但在检测的灵敏度和特异性方面需要改进。而核酸适配体具有独特的空间构象,易于合成,能够进行特定的修饰与组装,能够放大检测信号,因此核酸适配体在肿瘤液体活检的应用中具有广阔的前景。本文对核酸适配体在肿瘤液体活检中的应用作一综述。     

靶向乳腺癌的核酸适配体应用研究进展

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,实现乳腺癌的早期诊断和早期治疗意义重大.核酸适配体是经过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选得到的寡核苷酸序列,在肿瘤诊断及治疗方面拥有良好的应用前景.本文对靶向乳腺癌的核酸适配体及适配体作为载体和探针在乳腺癌诊疗中的作用进行综述.     

以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体.方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体.利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构.结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析.一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致.二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础.根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高.结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础.     

高特异性心肌肌钙蛋白Ⅰ适配体的ePCR技术筛选及其表征

目的 筛选出与心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)具有高亲和力和高特异性的核酸适配体,为诊断急性心肌梗死(AMI)提供实验基础.方法 采用基于乳液PCR(ePCR)的SELEX技术筛选出能与cTnI特异性结合的3个适配体,并对ePCR条件进行优化,对适配体进行亲和力(Kd值)测定并与市售cTnI抗体进行比较,选出Kd值最小的适配...     

非标记型适配体传感器对石房蛤毒素的高灵敏度检测

目的 建立了一种基于荧光染料噻唑橙(thiazole orange,TO)和核酸适配体的非标记型适配体传感器,可快速、灵敏地检测石房蛤毒素(saxitoxin,STX)。方法 本研究中使用经过变形处理的直链适配体 45e-1能够特异性识别并结合STX,形成了稳定的G-四链体复合物。TO自身以游离态存在于水溶液中时几乎没有荧光发射,但通过与G-四链体的小凹槽结合产生荧光。因此,TO可作为荧光探针,用于指示45e-1与STX结合后产生的构象变化从而达到定量检测STX的目的。 结果 在最佳实验条件下,荧光信号强度变化与STX浓度呈正相关关系,拟合线性方程为Y = 3639.8lgCon_STX + 2341.5(R₂ = 0.9725),检测限为0.67 nmol/L,对其他常见海洋毒素的交叉反应可以忽略。在海水中,该方法的加标回收率为90.7%–108.7%,RSD为7.1%–10.9%。结论 本研究建立的非标记型适配体传感器可以实现对STX的定量检测,并且具有良好的特异性和重现性,为准确、快速检测其他海洋毒素提供思路。     

TLS9a核酸适配体对小鼠肝癌细胞的靶向作用研究

目的 探讨TLS9a核酸适配体对小鼠肝癌细胞的靶向作用.方法 制备马来酰亚胺修饰的装载阿霉素的脂质体(liposome),合成FITC荧光及巯基修饰的TLS9a核酸适配体,并将其耦联到脂质体表面.紫外分光光度法检测阿霉素包封率.动态光散射法(DLS)测纳米粒子粒径大小及电位分布,倒置荧光显微镜观察小鼠肝癌细胞对阿霉素摄入及用流式细胞技术检测平均荧光强度,评估小鼠肝癌细胞对药物摄入量.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性.结果 流式细胞术检测TLS9a核酸适配体与BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌细胞结合率为54.1％,TLS9a耦联的脂质体平均粒径分布在(116.0±5.0)nm.TLS9a-liposome/DOX在pH 5.0的环境中可以快速释放化疗药物DOX,72 h药物释放量超过70％.TLS9a-liposome/DOX在体外能够有效抑制小鼠肝癌细胞BN L.1ME.A.7R.1生长.结论 TLS9a核酸适配体可以特异性与小鼠肝癌细胞BNL.1ME.A.7R.1结合,可用于检测小鼠肝癌细胞.     

癌胚抗原特异性寡核苷酸适配子的体外筛选及其意义

目的:通过体外筛选获得癌胚抗原(CEA)特异性适配子,为高表达CEA肿瘤的靶向奠定基础。方法:构建长度为81 bp的随机ssDNA文库,体外筛选、富集CEA特异性适配子,通过配体介导的靶蛋白纯化实验检测经筛选的适配子与纯化蛋白结合;提取LS174T细胞总蛋白,免疫共沉淀检测经筛选的适配子与细胞总蛋白的结合。结果:经体外7轮筛选富集及筛选条件的优化,配体介导的靶标分离实验证实了筛选出的适配子与纯化CEA蛋白的结合;免疫沉淀及Westem blot证实了其识别并特异性结合天然状态的CEA。结论:经过体外7轮筛选,证实了所获得的CEA适配子可特异性地与纯化CEA和天然状态的CEA蛋白结合,为后续高表达的CEA肿瘤的靶向诊断和治疗奠定了初步的实验基础。     

适配体传感器在病原菌检测中的研究进展

病原菌是各种感染性疾病的病原体之一,传统细菌培养鉴定方法耗时、操作繁琐,急需开发新的检测方法。基于纳米材料构建的适配体传感器具有灵敏度高、特异性好、操作简便、价格低廉等优势,有望用于病原菌检测。本文介绍了适配体传感器常用的纳米材料的特性和优势,以及不同检测方法适配体传感器检测各种病原菌的研究进展。     

雌激素受体核酸适配体在乳腺癌免疫组织化学检测中的应用

  目的  筛选出能应用于乳腺癌免疫组织化学检测的雌激素受体（ER）核酸。  方法  制备ER蛋白,用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术筛选出对ER具有高亲和力和特异性的核酸适配体。采用配体－受体相互反应实验来测定合成的ER适配体复合物的亲和力,用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗对105例乳腺癌组织进行免疫组化染色,以检测合成的ER适配体在癌组织中的特异性表达。用Kappa检验进行一致性检验。  结果  线性回归法计算获得生物素化适配体与ER复合物的解离常数Kd值为（0.34±0.05）nmol/L (n=3, r=0.989),最大结合力（B_max）为769.23 fmol/(mg prot·nmol-1·L-1)。实验结果表明,分别用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗进行免疫组化染色的结果具有高度一致性。其中ER阳性和阴性样本n=105,kappa值=0.943,95%可信区间=0.879~1.006,P<0.05;而ER弱阳性和中度/强表达样本n=75,kappa值=0.805,95%可信区间=0.642~0.967,P<0.05。进一步观察发现,ER适配体和ER抗体能使乳腺癌组织同一部位出现阳性表达,而阴性对照组均无表达。2例子宫内膜癌用生物素化ER适配体检测,癌细胞ER表达均为阳性。  结论  我们合成的ER适配体在体外能高度结合ER,ER适配体和ER抗体都能检测乳腺癌组织中ER的特异性表达。     

基于SCI的适配子研究文献计量分析

以科学引文索引（SCI）数据库1995-2012年收录的适配子研究文献为统计源,采用文献计量分析方法,定量分析了适配子研究文献的年代、国家（地区）、作者、学科、来源出版物以及高引频次论文的分布特点,并通过对中国作者论文的关键词词频的分析,揭示了当前国内适配子研究领域的热点。     

偶联 CD133 核酸适体的载紫杉醇 PLGA-PEG 纳米载体靶向清除CD133阳性肺癌干细胞

目的 构建偶联CD133核酸适体载紫杉醇的聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇（PLGA-PEG）纳米载体（N-Pac-CD133）拟清除肺癌干细胞。方法 采用乳液/溶剂蒸发的方法制备 N-Pac-CD133,同时对 N-Pac-CD133 进行表征,利用磁珠分离法分离出CD133+ 肺癌干细胞后并对该群体的肺癌干细胞特异性进行检测,同时对肺癌细胞的靶向性和杀伤活性进行检测。小鼠体内接种A549肿瘤后,肿瘤治疗分组：生理盐水,空纳米载体链接CD133核酸适体（N-CD133）,紫杉醇,负载紫杉醇的纳米载体（N-Pac）和N-Pac-CD133,8只/组,5 mg/kg紫杉醇,分别于第10、15和20天进行注射。在第40天时,处死小鼠后,对肿瘤进行摘除并称重,同时测量小鼠的体质量。结果 N-Pac-CD133的粒径为100 nm左右,包封率>80%,载药量>8%,在48 h内都显示出持续的药物释放。肺癌细胞的CD133+细胞群体表现出肺癌干细胞的特征：更快的肺癌生长速度（30 d,P=0.001）和更高的肿瘤干细胞基因表达：OV6（P<0.001）、CD133（P=0.001）、OCT3/4（P=0.002）、EpCAM（P=0.04）、NANOG（P=0.005）和 CD44（P=0.02）。与非靶向 N-Pac 和紫杉醇相比,N-Pac-CD133 对肺癌干细胞的靶向性（P<0.001）和细胞毒性作用显著增强。另外,N-Pac-CD133可显著减少肿瘤球的形成（P<0.001）。在治疗终点时,取小鼠肿瘤并对肿瘤进行称量,N-Pac-CD133治疗组和其他治疗组相比,肿瘤体质量显著减小（P<0.001）。结论 CD133核酸适体可以促进紫杉醇纳米载体靶向递送至CD133+肺癌干细胞并杀伤肺癌干细胞。N-Pac-CD133可能是一种有效的靶向肺癌干细胞的治疗手段。     

麻黄碱壳聚糖修饰脂质体凝胶剂的制备及体外透皮研究

目的 制备麻黄碱壳聚糖修饰脂质体凝胶剂,考察其粒径分布、包封率及体外透皮特性。方法 采用薄膜蒸发法制备麻黄碱脂质体混悬液,在麻黄碱脂质体混悬液中缓慢滴加pH值为5～6的0.35%壳聚糖溶液,制成麻黄碱壳聚糖修饰脂质体凝胶剂。激光粒度仪测定修饰脂质体的粒径分布,反透析法测定包封率,Franz扩散装置考察其体外透皮特性。结果 麻黄碱壳聚糖修饰脂质体的平均粒径在1 400～1 900 nm;平均包封率达（41±0.94）%;修饰脂质体中麻黄碱能缓慢透过大鼠皮肤,与普通剂型相比累积透过量随时间变化差异较明显,缓释效果显著。结论 该制剂制备工艺简单,性质稳定,药物包封率较高,定量测定方法简便、准确;药物透皮速率缓慢,释药稳定。     

核酸适体（aptamer）：一种具有潜力的肿瘤药物“靶向配基”

核酸适体（aptamer）可描述为化学抗体,是用配体指数富集法系统进化（SELEX）技术筛选获得的单链DNA或RNA,借其自身形成的空间结构与靶标分子特异性识别,具有靶分子广、亲和力高、特异性强、易改造修饰等特点。本文简述核酸适体作为肿瘤药物＂靶向配基＂的应用研究。