重组人源白细胞介素-24联合重组人源核心蛋白聚糖对人类肝细胞癌HepG2细胞增殖抑制和凋亡诱导协同效应的研究

目的 观察外源基因重组人源白细胞介素（IL）-24（rhIL-24）联合重组人源核心蛋白聚糖（rhDCN）对人类肝细胞癌HepG2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法 采用脂质体瞬时转染法将pcDNA3.1（＋）-IL-24和pcDNA3.1（＋）-DCN质粒转染至HepG2细胞,48 h后倒置显微镜下观察细胞生长状况、形态学改变.分别在转染后24h、48 h和72 h,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察IL-24和DCN单独及联合转染对HepG2细胞的增殖抑制效应.转染后48 h流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况,并进行细胞周期阻滞分析.结果 与对照组相比,转染目的基因48 h后显微镜下可见细胞生长不同程度地被抑制,并可见典型的凋亡细胞形态改变,以联合转染组改变更为明显.MTT结果显示转染后48 h和72 h,双基因联合转染组的抑制率分别是（31.88±6.57）％和（36.83±3.76）％,与对照组和单独转染组比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）.流式细胞术结果显示,单独转染IL-24和DCN基因可诱导HepG2细胞出现不同程度凋亡,而双基因联合转染组细胞凋亡率可达（32.56±0.90）％,与空质粒转染组的（2.98±0.72）％、空白细胞对照组的（3.50±0.92）％、IL-24组的（20.01±1.08）％和DCN组的（22.20±0.91）％比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）.细胞周期分析结果表明,与对照组相比,IL-24基因转染组的G2/M期和DCN基因转染组的G0/G1期细胞比例明显增高分别为（11.24±0.35）％、（77.93±0.67）％,而双基因联合转染组G0/G1期和G2/M期细胞比例同时增高,分别是（71.36±0.60）％和（10.39±0.67）％,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 联合转染IL-24和DCN基因可以协同发挥较单独应用更强的抑制HepG2细胞增殖和诱导HepG2细胞凋亡的作用.IL-24可使HepG2细胞发生G2/M期阻滞,DCN可使HepG2细胞发生G0/G1期阻滞,双基因联合使HepG2细胞同时发生G2/M期和G0/G1期阻滞,是IL-24和DCN对HepG2细     

苯乙酸钠增强肿瘤细胞表面HLA分子的表达

以分化绣导剂苯乙酸钠处理肿瘤细胞,以ELISA检测肿瘤细胞表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子表达的变化。结果发现MCF-7、MDA-453、MKN-45以及Hela细胞表面HLA Ⅰ类分子表达较低,而MKN-28和3AO细胞表面HLA Ⅰ类分子高表达。MDA-453、MKN-28、MKN-45、Hela以及3AO细胞表面亦表达HLA Ⅱ类分子,而MCF-7细胞表面缺乏HLA Ⅱ类分子。苯乙酸钠能够诱导MCF-7细胞表面表达HLA Ⅱ类分子;增强MCF-7细胞表面HLA Ⅰ类分子,MDA-453、MKN-28、MKN-45、Hela以及3AO细胞表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达。并且肿瘤细胞表面HLA Ⅰ类分子的表达与苯乙酸钠的作用时间和剂量呈正相关。     

肝癌细胞凋亡相关蛋白Bax的表达及意义

主要组织相容复合体 (ＭＨＣ)Ⅱ类分子主要分布在抗原递呈细胞 (ＡＰＣ)表面 ,如Ｂ细胞、单核巨噬细胞及树突状细胞等[1] ,通过激活辅助Ｔ细胞间接活化细胞毒Ｔ细胞 ,在抗肿瘤免疫中发挥重要的作用。一般肿瘤细胞不表达ＭＨＣⅡ类分子 ,若利用基因转移技术 ,促使其在肿瘤细胞中表达 ,可将肿瘤细胞修饰为一种可以递呈自身抗原的抗原递呈细胞 ,增强其免疫原性。体外研究表明 ,ＭＨＣⅡ类分子递呈内源性抗原的作用由于其在胞内与分子伴侣———不变链 (Ⅱ链 )结合而受到抑制。若使ＭＨＣⅡ类分子表达的同时 ,Ⅱ链不表达 ,使胞内ＭＨＣⅡ分子的…     

MHCⅠ类分子-抗原肽单链三聚体的制备及其应用

主要组织相容性复合物（MHC）Ⅰ类分子-抗原肽单链三聚体（SCT）由MHCⅠ类分子的重链、β2微球蛋白及抗原肽分子用接头相连接折叠形成。SCT能有效地维持其共价结构，并稳定地在细胞表面表达，能更有效地激活抗原特异性的CD8^＋细胞毒性T淋巴细胞，从而能更有效地清除病原体感染和恶性肿瘤细胞。     

pcDNA3.1(+)-Hsp70144-517As重组质粒构建及其转染Bcap-37细胞后细胞凋亡的研究

目的构建人反义Hsp70重组质粒[pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As]并观察其对乳腺癌Bcap-37细胞凋亡特性的影响。方法依照人hsp70mRNA全长序列，通过计算机分析，设计一对引物，在上游引物中带有1个BamHⅠ位点，经RT—PCR扩增、电泳、回收和纯化hsp70144—517片段，通过T—A克隆到pGEM—TEasy原核表达质粒中，经DNA测序和EcoRⅠ酶切图谱鉴定；EcoRⅠ酶切产物回收后亚克隆到pcDNA3．1（＋）质粒中EcoRⅠ位点之间，利用BamHⅠ酶切图谱筛选反向插入重组质粒，经DNA测序得到pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As重组质粒。以脂质体介导法将pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As转染列乳腺癌Bcap-37细胞中并克隆培养建株得到AsHsp—Bcap细胞。以DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞周期分析观察转染细胞的凋亡特性。结果本研究成功构建人反义hsp70重组质粒[pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As]；转染到乳腺癌Bcap-37细胞后在DNA琼脂糖凝胶电泳上观察到细胞凋亡特征性DNA Ladder及流式细胞周期分析发现G1峰前有1个特征性Ap峰（亚二倍体峰）。结论构建人反义重组质粒pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As对乳腺癌Bcap-37细胞有促进细胞凋亡的作用。     

肝细胞癌患者外周血性激素受体和糖皮质激素受体的含量

动物实验证实协同刺激分子CD80(B7-1)是促进抗肿瘤免疫应答的重要分子.本文应用RT-PCR,FACS技术检测了人肿瘤细胞系及EBV转化的B细胞CD80的表达,结果表明除Raji细胞、EBV转化的B细胞CD80阳性外,3AO、MCF-7、MDA-453、MKN-45、Hela细胞均为阴性.用我室建立的CD80逆转录病毒载体转染包装细胞PA317,筛选高滴度病毒上情感染人肿瘤细胞,得到CD80阳性表达的肿瘤细胞克隆.利用转染前后的人乳腺癌细胞系MDA-453作ICAM-I、HLA class Ⅰ、classⅡ分子表达的分析,结果表明转染有CD80基因的MDA-453细胞ICAM-Ⅰ、HLA classⅠ分子表达上调,class Ⅱ分子的表达未见改变.     

NOR1基因对HepG2细胞E-选择素的影响及机制探讨

目的探讨NOR1基因对HepG2细胞E-选择素表达水平的影响及NF—kB通路是否参与了NOR1基因对HepG2的E-选择素的影响。方法将NOR1基因通过脂质体转染入HepG2细胞．分别设立HepG2细胞对照组、HepG2／pcDNA3．1（＋）空白质粒细胞组、HepG2／pcDNA3．1（＋）／NOR1转染阳性克隆细胞组、PDTC处理的HepG2／pcDNA3．1（＋）／NOR1转染阳性克隆细胞组（后简称PDTC处理组）,分别检测4组细胞E-选择素的mRNA水平和蛋白水平：结果基因芯片筛选转染NOR1基因的HepG2细胞E-选择素表达水平上调（cy3／cy5〉2．0）;RT—PCR结果显示转染阳性克隆细胞组E-选择素mRNA的表达水平明显高于空白组、对照组和PDTC处理组（P〈0．01）,ELISA结果显示转染阳性克隆细胞组E-选择素表达水平明显高于空白组、对照组和PDTC处理组（P〈0．01）。结论NOR1基因诱导HepG2细胞E-选择素表达水平增高,NF—kB通路参与了NOR1基因对HepG2细胞E-选择素的影响.     

B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤诱导带瘤宿主抗瘤效应的体内研究

本文研究了IL-2、IL-4、IL-6基因转染后B16黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类抗原及ICAM-1的表达水平,并探讨了其在CTL诱导过程中的作用.结果表明,IL-2、IL-4、IL-6基因转染的B16黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类抗原及ICAM-1表达均高于野生型B16黑色素瘤细胞及转染对照质粒的B16黑色素瘤细胞.体内接种后,小鼠脾脏CTL活性明显增强,CTL培养体系中IFN-γ、TNF-α的分泌水平也增高.在CTL诱导体系中加入抗ICAM-1单抗可以抑制CTL的活化,加入抗MHCⅠ类分子单抗后可使CTL的活化完全阻断.这提示细胞因子基因转染可能通过使肿瘤细胞表面MHCⅠ类抗原、ICAM-1的表达增加,从而增强瘤苗的免疫原性.     

骨桥蛋白通过激活AKT信号通路促进肝癌细胞的侵袭转移

目的观察骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）对AKT信号通路及肝癌细胞生物学行为的影响。方法人肝癌细胞系HepG2细胞分别转染对照质粒pCDNA3．1和重组质粒pCDNA3．1-OPN,Western blot检测细胞中OPN、AKT、AKT—P、MMP2和uPA的表达水平,CyQUANT法和Matrigel侵袭实验观察OPN上调对细胞粘附和细胞侵袭的影响。结果OPN激活AKT信号通路,与转染对照质粒的HepG2细胞相比,转染OPN重组质粒的细胞MMP2和uPA表达增加,其细胞粘附百分比是56．084±2．0,大于对照组的49．93±1．74（P〈0．05）;穿过基底膜细胞数目是（25．2±2．08）个,大于对照组的（17．4±1．45）个（P〈0．05）。结论OPN可通过激活AKT信号通路,上调MMP2和uPA表达,促进HepG2细胞侵袭转移。     

重组人类核心蛋白聚糖对白血病K562细胞增殖的影响

 【摘要】　目的　观察重组人类核心蛋白聚糖（rhDCN）对白血病 K562细胞生长抑制、凋亡的影响,并探讨可能的作用机制。方法　通过Lipofectamine 2000脂质体介导转染对数生长期的白血病K562细胞,实验分组为0.9 % NaCl溶液组、pcDNA3.1（+）／K562组、pcDNA3.1（+）-DCN／K562组和脂质体组。经瑞特染色观察转染后细胞形态的改变,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白bcl-xl、Mcl-1及Bax的表达。结果　pcDNA3.1（+）-DCN／K562组瑞特染色呈现典型的凋亡形态学改变。MTT结果显示,pcDNA3.1（+）-DCN／K562组转染24 h细胞增殖抑制率为（16.14±1.08）%,转染48 h为（14.07±1.01）%,转染72 h为（20.29±1.19）%,明显高于对应时间点其他组增殖抑制率,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。FCM检测结果显示,pcDNA3.1（+）-DCN／K562组凋亡率为（20.15±1.31）%、细胞的G0／G1期细胞百分率为（51.15±0.57）%,与其他各组比较增加明显,差异有统计学意义（均P＜0.05）。Western blot结果显示,pcDNA3.1（+）-DCN／K562组与其他各组比较bcl-xl、Mcl-1蛋白表达减低,Bax蛋白表达升高。结论　rhDCN重组质粒可有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,rhDCN对细胞周期及凋亡相关蛋白bcl-xl、Mcl-1、Bax的影响可能是其发挥作用的机制。     

重组人核心蛋白聚糖基因增强多柔比星对白血病 K562细胞抑制作用的实验研究

 目的　探讨重组人核心蛋白聚糖（rhDCN）基因增强多柔比星（ADM）对人类白血病 K562细胞的作用。方法　取对数生长期的K562细胞分为0.9 % NaCl溶液组、pcDNA3.1(+)-DCN／K562组、ADM／K562组、pcDNA3.1(+)-DCN加ADM／K562组。瑞特染色观察细胞形态改变,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡,RT-PCR分析各组TGF-β1 mRNA含量。结果　pcDNA3.1(+)-DCN加ADM／K562组细胞比单独DCN和ADM组细胞,染色呈现更显著的凋亡形态学改变;MTT法结果显示联合组细胞增殖抑制率为（61±1.32）%,明显高于单独干预组[DCN组（20±1.90）%;ADM组（47±1.04）%]（P＜0.05）;FCM检测结果显示联合组细胞凋亡指数为（61.30±0.9）%,较单独干预组[DCN组（28.25±1.3）%及ADM组（31.85±1.5）%]明显增加（P＜0.05）;RT-PCR结果显示,联合组细胞TGF-β1 mRNA的转录减少。结论　rhDCN可以明显增强ADM对K562细胞的杀伤作用,提高肿瘤细胞的凋亡率。rhDCN可能通过下调TGF-β1 mRNA的转录发挥其作用,其具体机制有待进一步研究。     

核心蛋白聚糖基因对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响及抗肿瘤作用

目的 探讨核心蛋白聚糖(DCN)基因对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响及其抗肿瘤作用.方法 昆明小鼠24只,每组8只,建立S180实体移植瘤模型,随机分为生理盐水组(阴性对照组)、pcDNA3.1(+)空载体组、pcDNA3.1(+)-DCN转基因治疗组,于接种瘤细胞第2天瘤内注射用药,第5天起隔天测量小鼠肿瘤体积,并采用MTF法检测T淋巴细胞转化能力、RT-PCR检测TGF-β mRNA转录水平、ELISA测定血清VEGF的变化.结果 与前两组相比,重组载体组肿瘤体积缩小为(2.219±0.105)cm3(P＜0.001);淋巴细胞增生率提高为(67.21±6.32)%(P＜0.01,P＜0.05);同时使TGF-β表达降低,条带变淡;VEGF表达也明显下调,其A值降为2.6175±0.099(P＜0.01,P＜0.05).结论 肿瘤组织内DCN能够显著抑制肿瘤细胞生长,提高荷瘤小鼠免疫系统的活性.     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建分泌型核心蛋白聚糖(decorin)真核表达载体,并在肝癌细胞HepG2中表达,为研究核心蛋白聚糖的抗肿瘤作用奠定基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术扩增核心蛋白聚糖全长基因cDNA片段,与pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot检测其表达。结果获得了约1080bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型核心蛋白聚糖cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞decorin蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染decorin的HepG2细胞株。     

过表达 PTEN 增强肝癌 HepG2细胞对吉非替尼的敏感性

目的：探索过表达 PTEN 增强 HepG2细胞对吉非替尼敏感性的分子机制。方法：脂质体法转染获得稳定表达野生型 PTEN、磷酸酶缺失 PTEN 和空质粒 pcDNA3.1的肝癌 HepG2细胞株,MTT 法检测各组转染细胞对吉非替尼的药物敏感性,流式细胞仪检测吉非替尼诱导各组转染细胞的凋亡情况,Western blot 分析各组转染细胞 PTEN、Akt、pAkt 和 Caspase -3表达情况。结果：与转染 pcDNA3.1的对照组细胞相比,稳定转染PTEN 的 HepG2细胞对吉非替尼的敏感性显著增加（ P <0.05）。吉非替尼作用48h 后,稳定转染 PTEN 的HepG2细胞凋亡率明显高于对照组（P <0.05）。过表达 PTEN 可以抑制 Akt 磷酸化,促进 Caspase -3表达。而转染磷酸酶缺失 PTEN 的 HepG2细胞丧失上述生物学行为。结论：PTEN 可能通过抑制 Akt 信号通路、诱导细胞凋亡来增强细胞对吉非替尼的敏感性。     

AEG1通过激活NF-κB和AP-1诱导肝癌HepG2细胞COX-2表达(英文)

Objective:The aim of this study was to investigate whether astrocyte elevated gene 1 (AEG1) regulates COX-2 expression in human hepatoma HepG2 cells and related pathways involved in this process. Methods:Human hepatoma HepG2 cells were transfected with pcDNA3.1(-)-AEG1 plasmid or psilencer2.0-AEG1-shRNA1 plasmid to up/down-regulate AEG1 expression, pcDNA3.1(-) and psilencer 2.0 empty vector plasmids were transfected respectively as control. Real-time RT-PCR was carried out to measure the expression levels of AEG1 and COX-2 mRNA. The expression levels of AEG1 and COX-2 protein were detected by Western blot. NF-κB signaling was blocked by PDTC, and AP-1 signaling was blocked by curcumin. Results:AEG1 mRNA and protein levels were increased after pcDNA3.1(-)-AEG1 transfection, and decreased after psilencer2.0-AEG1-shRNAs transfection. COX-2 mRNA and protein levels were increased in AEG1-overexpressing cells and decreased in AEG1-knockdown cells. Phosphorylations of p65 and c-jun were up-regulated in AEG1-overexpressing cells. Both PDTC and curcumin reduced COX-2 expression in HepG2 cells with AEG1 overexpression. Conclusion:AEG1-overexpressing and-knockdown HepG2 cells are established successfully. AEG1 could induce COX-2 expression though activating NF-κB and AP-1 in human hepatoma HepG2 cells.     

RASSF1A Suppresses Proliferation of Cervical Cancer Cells

Background: This study aimed to explore the effects of ras association domain family 1 A (RASSF1A) onproliferation and apoptosis of human cervical cancer cell line Hela cells. Materials and Methods: RASSF1Awas cloned into the pcDNA3.1(+) vector to generate pcDNA3.1(+)-RASSF1A plasmid for transfection into Helacells. Changes in the proliferation and apoptosis of cultured Hela cells were examined by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium chloride assay and flow cytometry. A protein array was used to analyzethe expression of apoptotic factors. Results: Plasmid pcDNA3.1(+)-RASSF1A was generated and transfectedinto Hela cells to stably express RASSF1A in Hela cells. RASSF1A transfection was effective in inhibiting theproliferation of Hela cells up to 52.4%, as compared to cells transfected with an empty plasmid. RASSF1Aexpression also successfully induced apoptosis in human cervical cells with an apoptosis rate of 20.5%. Moreimportantly, protein array results showed that RASSF1 A transfection induced overexpression of p21 and caspase8, while decreasing the expression of survivin in Hela cells. Conclusions: RASSF1A expression was effective insuppressing the proliferation and increasing apoptosis of Hela cells, and may be a potential therapy for cervicalcancer in clinic.     

Effect of Bcl-2 on Apoptosis and Transcription Factor NF-kB Activation Induced by Adriamycin in Bladder Carcinoma BIU87 Cells

Resistance to apoptosis is a major obstacle preventing effective therapy for malignancies. Bcl-2 plays asignificant role in inhibiting apoptosis. We reconstructed a stable human Bcl-2 transfected cell line, BIU87-Bcl-2, that was derived from the transfection of human bladder carcinoma cell line BIU87 with a plasmid vectorcontaining recombinant Bcl-2 [pcDNA3.1(+)-Bcl-2]. A cell line transfected with the plasmid alone [pcDNA3.1(+)-neo] was also established as a control. BIU87 and BIU87-neo proved sensitive to adriamycin induced apoptosis,while BIU87-Bcl-2 was more resistant. In view of the growing evidence that NF-κB may play an important rolein regulating apoptosis, we determined whether Bcl-2 could modulate the activity of NF-κB in bladder carcinomacells. Stimulation of BIU87, BIU87-neo and BIU87-Bcl-2 with ADR resulted in an increase expression of NF-κB(p<0.001). The expression of NF-κB in BIU87-Bcl-2 was higher than in the other two cases, with a concomitantreduction in the IκBκ protein level. These results suggest that the overexpression of Bcl-2 renders human bladdercarcinoma cells resistant to adriamycin -induced cytotoxicity and there is a link between Bcl-2 and the NF-κBsignaling pathway in the suppression of apoptosis.