抗肿瘤核酶的研究进展

20世纪 8 0年代初 ,由美国科学家Ｃｅｃｈ和Ａｌｔ ｍａｎ发现了核酶 (Ｒｉｂｏｚｙｍｅ) ,它是一类具有生物催化活性的ＲＮＡ分子 ,可通过碱基配对特异性地与靶ＲＮＡ底物结合 ,定点切割ｍＲＮＡ靶分子 ,是一类很有希望的基因功能阻断剂 ,被形象地称为“分子剪刀”。它在抗病毒、抗肿瘤等领域的应用研究是目前基因治疗中的一个热点。本文简述核酶在抗肿瘤应用中的研究进展。1　核酶抗ｒａｓ基因ｒａｓ癌基因在细胞发育和肿瘤发生中起重要作用。ｒａｓ基因家族有Ｈ -ｒａｓ、Ｎ -ｒａｓ和Ｋ -ｒａｓ ,它们编码的蛋白质参与信号传导途径。肿…     

脱氧核酶的研究进展

自发现groupⅠ内含子的自我切割和连接活性以来,已进行了大量关于核酸催化活性的研究.通过体外筛选技术又发现一些短的单链DNA具有化学催化活性,这些人工合成的DNA核酶,或称脱氧核酶,具有高效的催化活性和结构识别能力.迄今为止已发现了几十种脱氧核酶,至少能催化7种化学反应.其中最特别的是一种能特异切割RNA的高效通用的脱氧核酶--10-23 DNA核酶.它包括一个催化结构域和两翼的识别结构域.迄今为止在脱氧核酶的应用方面,特别是作为基因表达抑制剂在基因治疗方面,取得了较大的进展.     

核酶抗病毒、抗肿瘤作用的研究进展

核酶 ( Ribozyme)是一类独特的 RNA分子 ,具有自我剪切和催化性质 ,人们已成功地设计、合成了核酶 ,将其应用于抗病毒、抗肿瘤研究 ,并取得了很大的进展。现将核酶在这一方面的研究应用作一简要概述。核酶在肿瘤治疗中的作用1　核酶与癌基因　核酶独特的切割目的基因的方式有可能阻断癌基因的表达 ,从而逆转肿瘤细胞恶性增殖 ,并诱导其分化和凋亡。早在 1 992年 ,Kashami等采用核酶技术应用于人膀胱癌细胞系中 ,发现该肿瘤细胞的致病性和转移性均降低[1 ] 。近几年 ,国内一些机构也先后开展了这方面的工作。范毓东等研究发现切割 bcl-2m …     

核酶抗病毒和抗肿瘤作用的研究进展

核酶是一类具有酶活性的RNA分子，可序列特异性定点地切割靶RNA，从而在分子水平实现对失控基因或有害基因表达的有效阻断。文章就近几年来核酶在抗病毒、抗肿瘤治疗中的应用进行简要介绍。     

10-23 脱氧核酶的生物催化功能研究进展

10-23脱氧核酶是利用体外筛选技术得到的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平上抑制基因表达,具有潜在的治疗应用价值。     

“10～23”型脱氧核酶的研究进展

脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有酶活性的单链DNA分子。迄今为止，利用该技术已筛选出多种具有催化功能的脱氧核酶分子，其中研究最多的是具有RNA切割活性的脱氧核酶，尤其是10～23型脱氧核酶，该酶能催化RNA特定部位的切割反应，从mRNA水平使基因灭活，从而调控蛋白质的表达，在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广阔的应用前景。     

核酶与抗病毒基因治疗

<正>核酶是1981年由Cech和Alfman在研究四膜虫mRNA前体的剪接中首先发现的。此二人由此获得1989年的诺贝尔奖。核酶是一类具有酶催化活性的RNA分子,它可与相应的特异序列的RNA底物结合,行使其切割功能。核酶切割RNA不仅是其自身的主要功能特点,也是其用于阻断基因表达和抗病毒治疗的主要依据。目前,研究人员多以人工手段合成具有催化     

核酶及突变核酶在体外对HBV mRNA的切割作用

目的：探讨多位点核酶对乙型肝炎病毒（HBV）信使核糖核酸（mRNA)的切割作用，以及保守碱基突变后对切割活性的影响。方法：利用计算机辅助设计针对HBV C区基因的多位点核酶及保守碱基突变的双位点核酶，构建多位点核酶及双位点突变核酶的自剪切载体（pGEMRz123,pGEMmRz12)，观察核酶及突变核酶对RNA的切割作用。结果：构建后的多位点串联核酶及突变核酶的自剪切转录载体在体外转录后，其顺式核酶可发生自剪切，并可将目的的核酶释放出来。多位点核酶对HBV mRNA有明确的切割作用，而保守碱基突变后对HBV mRNA则无切割作用。结果 ：抗HBV多位点酶在体外可明确切割HBV靶RNA，突变后的核酶无切割活性，保守碱基为核酶保持活性所必需。     

核酶在肿瘤基因治疗中的应用

核酶(ribozyme)是一类具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地与靶RNA序列结合并加以切割，人工设计合适的核酶可实现对失控基因或有害基因表达的有效阻断，从而对疾病进行基因治疗。本文对核酶的结构与作用原理及核酶在肿瘤基因治疗中的应用作一综述。     

脱氧核酶及其基因治疗应用进展

脱氧核酶是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，由一个碱基环和两条单链侧臂构成。具有高效的催化活性和结构识别能力。1987年Cech等首次发现了RNA具有酶的催化效应。称为核酶（ribozymes），这一发现突破了“酶都是蛋白质”的传统概念。1994年Breaker等发现单链DNA分子同样具有酶活性，这些具有催化功能的DNA分子称为脱氧核酶（DNAzyme），又称酶性DNA。脱氧核酶的发现进一步延伸了酶的概念，是当今分子生物学及基因治疗研究的热点之一，正广泛应用于病毒感染性疾病、肿瘤、某些遗传病等基因治疗方面的研究。本文就脱氧核酶的种类、结构、特性及其在基因治疗应用方面的进展做一综述。     

脱氧核酶及锁核酸核酶对2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg表达的抑制作用

目的：观察针对HBV前C/C区的脱氧核酶（DNAzyme）及锁核酸核酶（LNAzyme）对2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg表达的抑制作用。方法：设计合成针对HBV前C/C区2031位点的10-23DNAzyme、点硫代修饰的10-23DNAzyme及LNAzyme。本实验设对照组和10-23DNAzyme组、点硫代修饰的10-23DNAzyme组、LNAzyme实验组。对照组包括空白对照组、单纯脂质体对照组、单纯10-23DNAzyme对照组、无关10-23DNAzyme对照组。观察在0.16、0.64、1.28、1.60及1.92 μmol·L^-1浓度下及12、24、36、48、60、72、84及96 h时间段对2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg表达的抑制效应。结果：10-23DNAzyme及LNAzyme作用于2.2.15细胞后,可明显抑制HBsAg、HBeAg的表达,且抑制率LNAzyme明显高于点硫代修饰的10-23DNAzyme,而后者又明显高于未进行任何修饰的10-23DNAzyme组。LNAzyme及点硫代修饰的10-23DNAzyme对HBsAg的最高抑制率分别是(91.6±8.4)％和(78.4±2.0)％,对HBeAg的最高抑制率分别是(90.1±5.2)％和(76.4±4.8)％;在给药后12 h就表现出抑制效应,48 h达高峰,LNAzymes、点硫代修饰的10-23DNAzyme有效抑制时间分别是为84及72 h。其对2.2.15细胞未见明显的细胞毒性作用。结论：10-23DNAzyme及LNAzyme对2.2.15细胞具有明显的高效阻断HBV的HBsAg、HBeAg表达的作用,且LNAzyme优于DNAzyme,是一类特异的高效的抗HBV治疗剂。     

TIMP-1特异性核酶的计算机设计

目的：设计特异性切割TIMP-1 mRNA的核酶，并嵌入U6snRNA中以提高其稳定性。方法：根据Symons的“锤头结构”，计算机辅助确定最佳切点。结果：针对第123、299和353位设计了3个核酶，嵌入U6snRNA后，结合能量变化不大。结论：计算机辅助设计是研究核酶过程中不可或缺的重要步骤，嵌入U6snRAN是解决核酶降解问题的较好途径。     

抗HPV16E6核酶和抗HPV18E6核酶的设计与表达

以核酶的锤头结构为模型，采用计算机软件针对ＨＰＶ１６Ｒ６、ＨＰＶ１６Ｅ６基因，设计了相应的ｒｉｂｏｚｙｍｅ。体外合成ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因后，克隆于带自身修剪功能的原核质粒ＰＲＧ５２４中，构建成质粒ｐＲＧ１６ＨＲ、ｐＧＲ１８ＨＲ，为下一步研究抗１６ＨＲ，抗１８ＨＲ的体外活性效应，从而为探索以ｒｉｂｏｚｙｍｅ治疗ＨＰＶ相关性肿瘤的途径打下基础。     

核酶在抗病毒基因治疗中的设计策略

核酶 (ribozyme)是一类具有催化活性的RNA分子 ,可通过碱基配对特异地与相应的RNA底物结合 ,并在特定的位点切割底物RNA分子。自美国科学家Cech和Altman等发现核酶至今的 2 0多年来 ,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点 ,通过设计合适的核酶阻断特定基因的表达 ,已相     

定点诱变自我剪接Ⅰ型内含子核酶

目的 验证嗜热四膜虫核酶自我剪接功能,定点诱变Ⅰ型内含子核酶及检测其自我剪接功能.方法 PCR扩增嗜热四膜虫核酶基因连入pGEM-T载体,通过重组PCR获得3个非发夹区域定点诱变的Ⅰ型内含子核酶基因,连入pG-EM-T载体,分别进行体外转录.结果 嗜热四膜虫核酶及诱变的3个核酶自我剪接功能完全.结论 非发夹区诱变的核酶不改变其自我剪接的功能,为以后反式剪接核酶的设计构建提供了更多的选择基础.     

核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

脱氧核酶对人食管癌细胞增殖的影响

目的 :探讨针对增殖细胞核抗原 (PCNA)基因起始密码AUG的脱氧核酶 (DNAzyme)对人食管癌细胞(EC970 6 )增殖的影响。方法 :设计合成DNAzyme ,应用脂质体转染法将其转入体外培养的hEC。采用流式细胞仪测细胞周期 ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法分析hEC增殖活性。采用免疫组化 (SABC法 )检测PCNA蛋白表达。结果 :2 .0 μmol/LDNAzyme干预EC970 6 3d后 ,MTT比色吸光度值低于对照组 (P <0 .0 1)和反义寡聚核苷酸 (ASODN)组 (P<0 .0 5 )。DNAzyme和ASODN对吸光度值的抑制呈剂量依赖性。细胞干预 2d后 ,DNAzyme和ASODN均减少细胞核中棕黄色颗粒的表达 ;DNAzyme、ASODN和对照组的G0 /G1期细胞的比率分别为 72 .5 %、6 6 .8%和 5 6 .7%。结论 :针对PCNA的DNAzyme能调控细胞周期 ,有效抑制EC970 6的体外增殖。     

原癌基因K-ras mRNA的体外核酶定点切割

目的：确定人工设计的梅核Ｒｘ１９９对原癌基因Ｋ－ｒａｓ ｍＲＮＡ的体外切割活性，为Ｋ－ｒａｓ特异性核酶的体内应用提供依据。方法：利用ＤＮＡ重组技术构建Ｋ－ｒａｓ外显子１及核酶Ｒｚ１９９的体外转录质粒，以Ｔ７ＲＮＡ聚合酶进行转录获得核酶Ｒｚ１９９对其靶ＲＮＡ分子进行切割。结果：Ｋ－ｒａｓ体外转录体为２５４ｎｔ的ＲＮＡ分子，能被核酶Ｒｚ１９９切割成大小分别为９０，１６４ｎｔ的２个片段。结论：梅核Ｒａ１