利用RNA干扰阻抑膀胱癌细胞Survivin基因表达和诱导凋亡

目的 探讨RNA干扰下调Survivin基因表达后膀胱癌细胞生物学行为变化及Survivin基因抗凋亡机制。方法设计、合成一对Survivin编码基因序列特异的小分子干扰RNA（siRNA），用脂质体包裹转染T24膀胱癌细胞，分不同的浓度组（50～200nmol／L）。噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长情况，流式细胞仪测定细胞凋亡率，实时定量聚合酶链反应（PCR）检测Survivin基因和Caspase-3基因mRNA表达。结果 Survivin编码基因序列特异性siRNA能有效下调Survivin基因表达水平，并呈剂量和时间依赖性，最大效应浓度为100nmol／L，此时与对照比较Survivin表达水平下调75．91％，并显著的抑制了细胞生长，抑制率达55．29％，差异有统计学意义（P＜0．05）。同时，Caspase-3 mRNA表达水平明显上升达239．80％，细胞凋亡率亦增加至45．70％，与对照相比差异有统计学意义（P＜0．05）。结论RNA干扰显著下调Survivin基因表达后，能明显促进T24膀胱癌细胞凋亡并抑制其增殖；Survivin基因可能是通过下调Caspase-3表达来抑制凋亡。     

小RNA干扰技术沉默Smoothened(Smo)基因表达对胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的影响

目的观察Smo基因在胃癌MGC803细胞中的表达，及其对胃癌MGC803细胞增殖与凋亡的作用。方法半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测胃癌MGC803细胞中Smo基因的表达；化学合成3条针对Smo mRNA的小干扰RNA（siRNA），阳性脂质体介导转染胃癌MGC803细胞，半定量RT-PCR筛选出降解胃癌MGC803细胞Smo mRNA最有效的siRNA；噻唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测胃癌MGC803细胞Smo mRNA被降解后，对细胞增殖和凋亡率的影响。结果胃癌MGC803细胞内有Smo蛋白及Smo mRNA的强表达，siRNA-1、siRNA-2对胃癌MGC803细胞Smo基因表达均有降解作用，siRNA-1降解作用最明显，达61．7％，与隐性对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。siRNA-1转染胃癌MGC803细胞24h后，细胞增殖水平较隐性对照组明显下降（P〈0．05）；转染48h后，细胞凋亡率较隐性对照组明显上升（P〈0．05）。结论胃癌MGCS03细胞内存在Smo基因的高表达，降低Smo基因表达可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，Smo基因具有调控胃癌细胞增殖和凋亡的作用。     

RNA干扰靶向抑制表皮生长因子受体表达对大肠癌细胞增殖的影响

目的观察RNA干扰（RN加）技术能否有效抑制大肠癌LoVo细胞株表皮生长因子受体（EGFR）的表达以及对细胞增殖的影响。方法构建质粒表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2；脂质体瞬时转染后24、48、72、96、144h实时荧光定量PCR（Real Time PCR）和Western blot检测EGFR表达，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，并绘制细胞生长曲线；分5组：A组：Lov0细胞组；B组：Lipofectamine2000组；C组：对照载体HK组；D组：pU6-EGFR-shRNA-1组；E组：pU6-EGFR-shRNA-2组。结果D组E组细胞转染shRNA后mRNA和蛋白表达降低，G0～G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞凋亡率增加，对数生长期延迟，以48h效果最显著，和A组B组C组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；但随着时间的推移其干扰作用降低。结论两条EGFR-shRNA均可有效抑制大肠癌LoVo细胞EGFR表达，阻滞更多的细胞位于Go～G1期，促进细胞凋亡而抑制细胞增殖。     

RNA干扰沉默血管内皮生长因子对人膀胱癌细胞株T24增殖和凋亡的影响

目的 观察RNA干扰沉默血管内皮生长因子(VEGF)对膀胱癌细胞株T24增殖和凋亡的影响.方法 构建了4个针对VEGF的小干扰RNA(siRNA)表达质粒pGC-siVEGF1-4,脂质体法稳定转染T24细胞.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(EUSA)检测转染细胞VEGF mRNA和蛋白表达,噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡情况.结果 4个VEGF siRNA表达质粒均能明显抑制转染细胞的VEGF mRNA和蛋白表达,使细胞增殖减慢,其中以pGC-siVEGF3最为明显,细胞增殖受抑达38.9%(t=18.49,P《0.01).且该组出现了最大程度G0/G1细胞阻滞(59.8±1.4),明显大于空质粒组(48.5 ±1.5),差异有统计学意义(P《0.01),该组的细胞凋亡率也最高(17.4%).结论 VEGF siRNA表达质粒可下调T24细胞VEGF表达,抑制膀胱癌细胞生长并促进其凋亡.     

Smo小干扰RNA对人食管癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响

目的 通过Smoothened (Smo)基因位点阻断Hh信号通路抑制食管癌细胞增殖,并诱导其凋亡.方法 运用Smo小干扰RNA(siRNA)转染食管癌EC9706细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测各组细胞Smo和Glil mRNA及蛋白表达,并以噻唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测SmosiRNA对细胞增殖及凋亡的影响.结果 (1)Smo siRNA转染细胞24、48和72 h后,Smo mRNA相对表达量分别为4.20±1.10、2.80±1.10和1.00±0.71;GlilmRNA相对表达量分别为4.60±1.34、3.00±0.71和1.20 ±1.10,与各对照组比较均明显降低(P＜0.05);(2) Smo siRNA转染细胞72 h后,Smo和Glil蛋白相对表达水平分别为0.330±0.016和0.324±0.021,与各对照组比较均明显下降(P＜0.05);(3)SmosiRNA转染细胞72 h后,细胞生长抑制率为(88.06±7.56)％,明显高于各对照组,并随转染时间延长抑制率升高(P＜0.05);(4)SmosiRNA转染细胞72h后,早期凋亡细胞所占的比例均明显增高.结论 Smo基因具有调控食管癌细胞增殖和凋亡的作用.     

RNA干扰双位点抑制Survivin基因诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的研究采用RNA干扰技术抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中Survivin 基因的表达对PC-3细胞增殖及凋亡的影响。方法设计2条靶向Survivin mRNA的Survivin shRNA,克隆至同一质粒载体,并鉴定分析;质粒转染PC-3细胞,绘制细胞生长曲线;并于转染48 h 后进行Survivin基因蛋白表达及细胞凋亡检测。结果酶切鉴定、测序分析证实负载双片段Sur- vivin shRNA的质粒载体构建成功。转染PC-3细胞后,细胞生长曲线示实验组PC-3细胞增殖明显受抑制;转染后48 h．实验组、阴性对照组、空白对照组Survivin蛋白表达强度分别为(4．62± O．84)％、(38．83±7．96)％和(40．98±3．83)％,实验组与两对照组相比差异均有显著性意义(P< 0．05);转染48 h后PC-3细胞凋亡率开始增加。结论负载双片段Survivin shRNA的质粒载体转染PC-3细胞后能明显抑制PC-3细胞增殖,抑制PC-3细胞Survivin蛋白表达,并能诱导PC-3细胞凋亡。但诱导PC-3细胞凋亡最明显的时机需要进一步观察。     

电穿孔法介导雄激素受体基因沉默抑制裸鼠膀胱癌移植瘤生长的研究

目的 观察电穿孔法转染靶向雄激素受体(AR)的小干扰RNA(siRNA)对裸鼠人膀胱癌移植瘤生长的影响.方法 建立人膀胱癌细胞124的荷瘤裸鼠模型,于肿瘤直径0.5 cm大小时,瘤体接受AR-siRNA的电转染治疗,转染无效序列siRNA为阴性对照组,瘤体未受电穿击为空白对照组.观察裸鼠肿瘤生长;4周后处死,绘制肿瘤生长曲线;肿瘤组织石蜡包埋,常规切片,TUNEL法检测移植瘤凋亡.结果 电转染AR-siRNA后瘤体组织AR基因的表达显著被抑制,也能明显抑制裸鼠移植瘤的生长;TUNEL检测凋亡率为(13.1±6.9)%,显著高于阴性对照组(P＜0.01).结论 电穿孔法靶向AR的siRNA可有效阻断种植瘤内AR表达,阻断雄激素受体途经信号传导,进而诱导细胞凋亡,能明显抑制人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的生长.

Abstract：

Objective To investigate the antitumor efficacy of small interfering RNA (siRNA)mediated inhibition of androgen receptor (AR) gene expression in T24 bladder tumor xenografts using electroporation. Methods Athymic mouse human bladder cancer transplantation tumor model was established by injecting T24 cells subcutaneously. When tumor diameter was exceeded 0. 5 cm, AR-siRNA was deliered into tumor xenografts by electroporation. The cells with nonspecific siRNA delivery and un-treatment served as control groups. Tumor volumes were measured weekly. The animals were sacrificed after the treatments, and the histological changes of xenografts were observed by Hematoxylin and Eosin ( HE) staining and TUNEL assay. Results The athymic mouse exnograft tumor model was established successfully.After AR-siRNA treatment, tumor growth was inhibited as compared with the controls. The number of TUNEL-positive cells was significantly increased in AR-siRNA group as compared with the nonspecific siRNA group ( P ＜ 0. 01). Conclusion siRNA targeting AR gene could inhibit obviously the growth of athymic mouse human T24 bladder carcinoma transplantation tumor by inducing apoptosis.     

靶向RNA干扰Survivin对结肠癌细胞HT-29增殖凋亡的影响

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒（Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP）介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白表达及对HT-29增殖凋亡的影响。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29（以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照），用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化，用噻唑蓝（MTT）法、吖啶橙／溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE／7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。结果与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较，转染Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP后，HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低，其细胞死亡率和凋亡率显著提高（P〈0．05）。结论Ad-deIE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP介导的RNA干扰较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率，且能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

小分子干扰RNA降低蛋白激酶Cι表达抑制HeLa细胞增殖

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默蛋白激酶Cι (PKCι)表达对HeLa增殖与凋亡的影响.方法 实验分为转染组、阴性对照和空白对照组.将PKCι基因的siRNA转染HeLa细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测3组细胞第1～5天的吸光度;培养细胞于第21天计数细胞克隆数;流式细胞仪检测沉默PKCι基因72h的细胞凋亡及细胞周期分布.结果 转染组细胞增殖率低于两个对照组.转染组的平板集落形成率(64.00±4.54)%低于阴性(87.00±1.22)%和空白组(82.00±2.10)%(P<0.05).转染组细胞凋亡率(9.54±0.55)%明显高于阴性对照组(1.31±0.10)%和空白对照组(2.75±0.24)%.瞬时转染PKCι siRNA 72h后,G1期细胞增多,G2+S期细胞减少.结论 沉默PKCι可抑制宫颈癌细胞增殖,促进细胞凋亡.

Abstract：

Objective To explore the effect of RNA interference (RNAi) targeting protein kinase C iota (PKCι) on proliferation and apoptosis of cervical carcinoma cell line HeLa. Methods Stable cell lines which were transfected with PKCι shRNA or vector-mock plasmids were established. The cell lines, psi-PKCiota-HeLa, psi-mock-HeLa and HeLa, were used to detect methyl thiazol tetrazolium (MTT) absorbance at 1st-5th day. The cells were cultured in 6-well plates and stained by crystal violent at 21st day, and the stained cells colonies were counted. Flow cytometry was used to detect apoptosis and cell cycle distribution after HeLa cells were transiently transfected with PKC iota shRNA at 72nd h. Results Compared with the psi-mock and blank controls, the transfected cells stably expressing PKCι shRNA showed markedly decrease of proliferation assayed by MTT and plate colony formation. The apoptosis rate of cells transiently transfected with PKCι shRNA (9.54±0.55)% was higher than that of cells transiently transfected with psi-mock (1.31±0.10)% or HeLa blank control cells (2.75±0.24)% (P<0.05). The cells transiently transfected by PKCι shRNA were arrested in G0/G1 phase. Conclusion PKCι is essential for maintaining of HeLa cell proliferation. Silencing PKCι can inhibit the growth of HeLa cells and induce apoptosis.     

小分子干扰RNA抑制肺癌细胞Survivin表达对凋亡和顺铂耐药性的影响

目的 观察应用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制肺癌A549细胞中Survivin表达对细胞凋亡和顺铂耐药性的影响.方法 设计、合成特异性抑制Survivin表达的siRNA,转染肺癌A549细胞48 h后,检测Survivin基因mRNA表达量以及肺癌细胞凋亡率和对顺铂耐药性变化.结果 A549细胞转染Survivin特异siRNA后,Survivin/β-actin基因mRNA表达比例1.17±0.25下降至0.41±0.18,抑制率65.10%;细胞凋亡率由2.67%上升至32.33%;顺铂半数抑制浓度(ICSO)由6.37 ms/L降低至2.42 ms/L.结论 通过siRNA特异性抑制肺癌A549细胞中Survivin基因表达可增加凋亡,逆转顺铂耐药.     

RNAi技术沉默Bcl-2基因对人膀胱癌细胞株T24增殖影响的研究

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bcl-2基因表达对人膀胱癌细胞株T24增殖的影响。方法针对Bcl-2 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,转染T24细胞。采用Western blot检测重组质粒对Bcl-2蛋白表达的影响,MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用,Annexin-V-PI双染法流式细胞术(FCM)检测转染重组质粒后细胞的凋亡状况。结果成功构建了pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,并成功转染T24细胞。重组质粒抑制Bcl-2基因的表达接近70%;转染重组质粒后,T24细胞的活力降低为(66.9±5.6)%;重组质粒组的T24细胞凋亡率为34.55%～45.39%。结论pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒明显下调Bcl-2在膀胱癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞生长,促进其凋亡。     

siRNA沉默高迁移率蛋白A2基因对人膀胱移行细胞癌细胞T24增殖凋亡的影响

目的 观察siRNA靶向沉默HMGA2基因在人膀胱移行细胞癌T24细胞中表达的变化,探讨抑制HMGA2基因对T24细胞增殖、周期和凋亡的影响.方法 针对人HMGA2基因构建siRNA干扰片段,瞬时转染T24细胞后,采用Western-blot方法检测转染siRNA干扰片段48h后T24细胞蛋白表达量的变化,CCK-8法检测T24细胞增殖和流式细胞仪（FCM）检测T24细胞周期和凋亡情况.结果 转染后48h的T24细胞HMGA2蛋白表达水平较空白对照组（CON）和阴性对照组（NC）显著下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,转染HMGA2-siRNA的实验组抑制T24细胞增殖,T24细胞S期细胞比例（35.47±0.23）％高于CON组和NC组（P＜0.05）,实验组T24细胞凋亡率为（17.25±0.24）％,明显高于CON组和NC组（P＜0.05）.结论 HMGA2基因的特异性siRNA可以抑制T24细胞增殖,细胞周期阻滞在S期,并促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

siRNA靶向沉默B7-H4基因对人前列腺癌DU145细胞增值和凋亡的影响

目的研究siRNA沉默B7-H4基因对人前列腺癌DUl45细胞增殖和凋亡的影响。方法以脂质体Lipofeclami-ne“2000（Lipo）为载体转染siRNA-B7-H4至DUl45细胞,应用RT-PCR和WesternBlot检测B7-H4表达水平,CCK-8法检测细胞增殖的变化,Annexinv／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与空白组和阴性对照组（NC）相比,转染B7-H4-siRNA的细胞B7-H4mRNA和蛋白表达明显减少（P〈0．05）,DUl45转染B7-H4siRNA后,增殖能力减弱,凋亡显著。结论通过B7-H4-siRNA抑制DUl45细胞B7-H4的表达,可以抑制细胞增殖,促进其凋亡,表明B7-4在前列腺癌的发生发展中发挥重要作用。     

VEGF-C对膀胱癌T24细胞增殖与丝裂霉素诱导T24细胞凋亡影响的研究

目的:探讨VEGF-C对膀胱癌T24细胞增殖及抑制丝裂霉素(MMC)诱导T24细胞凋亡的影响。方法:采用MTT及流式细胞术(FCM)等方法观察不同浓度(0、50、100、200μg/L)VEGF-C对T24细胞生长及MMC诱导的T24细胞凋亡的影响。所有实验重复3次。结果:随着预处理VEGF-C浓度的增加,T24细胞的增长率由27.3%上升到65.0%;MMC诱导的T24细胞凋亡率由29.5%下降至14.0%。结论:VEGF-C促进膀胱癌T24细胞的增殖和抑制MMC诱导的细胞凋亡;抑制VEGF-C作用通路可能防治膀胱癌复发。     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌细胞Ki67基因表达及其增殖的抑制作用

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞增殖基因Ki67表达及其增殖、凋亡的影响。方法将Ki67 siRNA(100 nmol/L)转染人肾癌786-0细胞。采用RT-PCR、免疫印迹、免疫组化技术检测Ki67 mRNA及蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果Ki67 siRNA处理组786-0细胞Ki67 mRNA表达(37．6±1．9)%、Ki67蛋白表达(46．4±0．9)%、免疫组化Ki67表达吸光度(A)值52．5±2．3,阴性siRNA对照组分别为(97．3±0．9)%、(95．3±0．9)%、114．5±4．9,2组比较差异均有统计学意义(P＜0．01)。Ki67 siRNA处理组细胞增殖抑制率(63．6±1．6)%、凋亡细胞阳性率(41．7±0．6)%,阴性siRNA对照组分别为(2．8±0．2)%、(10．3±1．4)%,2组比较差异有统计学意义(P＜0．01)。结论肿瘤增殖基因Ki67 siRNA能抑制人肾癌786-0细胞Ki67基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。     

膀胱癌细胞凋亡检测方法的比较研究

目的 比较几种检测羟基喜树碱（ＨＰＴ）诱导的膀胱癌细胞凋亡的方法。方法 通过流式细胞分析观察ＨＰＴ诱导Ｔ２４膀胱癌细胞凋亡的量效关系;通过荧光染色对凋亡细胞的形态特征进行分析;直接使用苏木素染色进行细胞凋亡的检测;应用ＤＮＡ分析进行ＤＮＡｌａｄｄｅｒ检测。结果 （０．０１￣１０）μｇ／ｍｌ的ＨＰＴ在体外能够诱导Ｔ２４细胞凋亡,其最佳诱导时间在３小时以后。流式细胞（０．０１￣１０）μｇ／ｍｌ的ＨＰ