骨髓间质干细胞和脱细胞基质构建组织工程血管的动物实验

目的以骨髓细胞作为种子细胞,血管脱细胞组织基质作为支架、构建组织工程血管。方法分离小猪骨髓单个核细胞,分别置于内皮细胞培养液和平滑肌细胞培养液中培养,观察分化细胞的抗原标志;多步骤法制备犬血管脱细胞组织基质,将未经分化的骨髓单个核细胞种植于脱细胞基质构建组织工程血管,移植至骨髓供体小猪,代替部分肺动脉血管。结果小猪骨髓细胞经内皮细胞培养液或平滑肌细胞培养液培养后,分别出现成熟内皮细胞或平滑肌细胞的形态学改变,并分别表达内皮细胞或平滑肌细胞的特异性抗原;组织工程血管移植100d后管腔通畅,无血栓、钙化或动脉瘤形成,内皮细胞和平滑肌细胞分化、增殖良好;移植血管的最大负载为2．76N,最大伸长度为20．31mm。结论骨髓单个核细胞复合脱细胞基质可成功构建组织工程血管。     

新西兰兔骨髓基质细胞构建组织工程膀胱的实验研究

目的：研究骨髓基质细胞(MSCs)在兔组织工程膀胱中的应用．方法：按献改进方法制作膀胱无细胞基质(BAMG)，从兔胫骨中分离出MSCs，体外扩增后接种于BAMG外表面，在低糖DMEM(LG—DMEM)培养12h，与BAMG复合成组织工程膀胱，对同一兔实施膀胱次全切术，用组织工程膀胱替代．20只兔实施了保留三角区的膀胱次全切术．实验随机分为3组．A组6只直接缝闭三角区；B组7只用膀胱形状的BAMG进行重建；C组7只用复合自体MSCs的组织工程膀胱进行替代手术．术前术后分别记录膀胱测压和放射线造影资料．12wk时无痛处死动物，进行大体解剖和组织染色分析．结果：体外扩增时间平均为21d．A，B和C组膀胱容积分别为术前的22％，85％和95％，顺应性分别为术前的11％，104％和107％．大体解剖显示A组仅有很小的储水能力，而B，C组具有正常膀胱形态，组织染色分析A，B组显示上皮层正常，粘膜下纤维组织增生而肌层较薄；C组则显示了与自体膀胱相似的正常的3层组织结构．结论：膀胱次全切除后原位缝合膀胱容积和顺应性均不能恢复，单纯应用BAMG膀胱容积和顺应性能够恢复正常，但逼尿肌层较薄，应用BAMG复合自体ASCs或MSCs的组织工程膀胱替代，术后12wk膀胱容积和顺应性能够恢复正常，膀胱壁组织结构与正常膀胱相似．提示膀胱次全切除后应用BAMG复合自体MSCs的组织工程膀胱替代可以获得良好功能和组织结构．     

利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

目的 探讨利用犬的间充质干细胞诱导分化种子细胞,以异种脱细胞血管基质为基础体外构建小口径血管移植物.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养的方法从犬骨髓中分离出间充质干细胞并体外培养,诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞;采用非离子型去垢剂和胰蛋白酶去除猪颈动脉血管壁结构细胞,对脱细胞基质进行组织学、力学检测及孔隙率评估.在生物反应器内采用旋转种植的方法将犬骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞种植到脱细胞基质上,体外构建小口径组织工程血管.结果 犬的骨髓间充质干细胞体外能够定向诱导分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,可以作为血管组织工程的种子细胞.经过脱细胞处理后,光镜和电镜观察证实血管壁的细胞成分完全去除.具有良好的孔径和孔隙率.支架在生物力学、孔隙率等方面符合构建组织工程血管支架的要求.在生物反应器内剪切力条件下可以初步构建出组织工程血管.结论 小口径血管移植物可以将间充质干细胞诱导种子细胞,以异种脱细胞血管支架作为基质,在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建.     

脱细胞真皮基质组织补片修复口腔黏膜组织缺损的初步应用

[目的]评价脱细胞真皮基质组织补片修复口腔黏膜组织缺损的初步临床疗效.[方法]本组共收治18例患者口腔病变切除术后组织缺损,年龄18～74岁,平均48.5岁.单纯应用脱细胞真皮基质组织补片修复口腔黏膜组织缺损13例,脱细胞真皮基质组织补片与组织瓣复合修复5例.[结果]89%病例(16/18)脱细胞真皮基质组织补片成活,并逐渐上皮化,组织补片有轻微挛缩但无明显压痛.[结论]脱细胞真皮基质组织补片可用于口腔黏膜组织缺损的修复,亦可与各类皮瓣复合修复复杂的口腔组织缺损,是种安全有效的口腔黏膜组织缺损的修复材料.     

脱细胞技术在气管组织工程构建中的应用展望

近年来,脱细胞技术在气管组织工程的研究与应用已经成为当前的热点,并取得了一些进展。但是如何更好地将脱细胞气管基质应用于临床仍需要深入的研究。本文将对气管组织工程中不同脱细胞技术的优缺点及在长段气管损伤中的应用进行综述,并对未来的研究进行展望。     

去细胞组织工程同种心脏瓣膜的构建

目的 全面评价去细胞组织工程同种心脏瓣膜的生物学、生物力学及免疫学特性。方法采用低渗液-去污剂[0.5％去氧胆酸(DOA),1％DOA,1％Triton]-核酸酶去细胞法,测定了,47例去细胞同种心脏瓣膜去细胞前后组织学、免疫学、组织厚度、组织含水量、热皱缩温度、组织基因组DNA含量、胶原蛋白含量、应力应变曲线、破坏强度及组织伸长比变化。结果组织学检查1％DOA 24 h组完整地去除了同种心脏瓣膜、管壁及肌肉组织中所有的细胞成分,保留了完整的细胞外基质;免疫组织化学证实白细胞DR(HLA-DR)抗原表达明显下降;组织基因组DNA含量显著下降(瓣叶下降91.14％,管壁下降91.53％);与去细胞前相比,只有管壁组织的含水量(去细胞前75.4±1.8,去细胞后82.0±0.7,P<0.05)明显增加,组织厚度、瓣叶组织含水量、热皱缩温度、应力应变曲线、破坏强度及组织伸长比差异无显著意义。结论低渗液-去污剂(1％DOA)-核酸酶去细胞法方便有效,去细胞组织工程同种心脏瓣膜的生物学及生物力学特性稳定,免疫性显著下降,符合机体的要求,为受体细胞化组织工程心脏瓣膜的研制提供了可靠的天然的纤维支架材料。     

脱细胞生物基质组织相容性评价研究

目的:研究不同脱细胞生物基质及猪皮的组织相容性。方法:将以不同脱细胞生物基质及猪皮注射法植入家兔脊柱旁肌肉内,观察植入后不同时间样品周围组织反应程度,以评价样品对组织的刺激性和相容性。阴性对照用SGBT硅橡胶。结果:猪皮、S0.55'、S0.520'和S0.560'四种样品4周时炎细胞反应程度为Ⅱ级,纤维囊腔形成程度为Ⅱ～Ⅳ级。胰酶处理后的样品和SDS处理后的样品4周时炎细胞反应程度为Ⅲ级,纤维囊腔形成程度为Ⅲ～Ⅳ级。结论:猪皮、S0.55'、S0.520'和S0.560'四种样品短期肌肉植入试验合格。表明其对组织无明显的刺激性,组织相容性良好。胰酶处理后的样品和SDS处理后的样品短期肌肉植入试验不合格表明其对组织有刺激性,组织相容性差。     

脱细胞生物基质组织相容性评价研究

目的研究不同脱细胞生物基质及猪皮的组织相容性.方法将以不同脱细胞生物基质及猪皮注射法植入家兔脊柱旁肌肉内,观察植入后不同时间样品周围组织反应程度,以评价样品对组织的刺激性和相容性.阴性对照用SGBT硅橡胶.结果猪皮、S0.55′、S 0.5 20′和S 0.5 60′四种样品4周时炎细胞反应程度为Ⅱ级,纤维囊腔形成程度为Ⅱ～Ⅳ级.胰酶处理后的样品和SDS处理后的样品4周时炎细胞反应程度为Ⅲ级,纤维囊腔形成程度为Ⅲ～Ⅳ级.结论猪皮、S0.55′、S 0.520′和S 0.560′四种样品短期肌肉植入试验合格.表明其对组织无明显的刺激性,组织相容性良好.胰酶处理后的样品和SDS处理后的样品短期肌肉植入试验不合格表明其对组织有刺激性,组织相容性差.     

以表皮细胞及脱细胞真皮构建组织工程皮肤

目的 体外扩增培养表皮细胞，复合脱细胞真皮构建组织工程皮肤，以促进其进一步临床应用。方法 将人表皮细胞进行体外培养扩增后，以生长良好的表皮细胞接种于制备好的异种（猪）无细胞真皮支架上，行气液界面联合体外培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及复合皮结构。结果 培养的表皮细胞扩增良好，脱细胞真皮支架去细胞完全，表皮细胞在脱细胞真皮上可以生长，可体外构建复合皮肤。结论 利用体外扩增的表皮细胞及制备的脱细胞真皮可体外联合构建具有复层结构的组织工程皮肤。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

组织工程气管细胞-支架复合体构建策略的研究进展

如何构建合适的组织工程气管并移植入受体内,正逐渐成为组织工程领域研究的热点.近年来,已有团队成功地将组织工程气管移植应用于临床试验,并取得了较好的临床效果.组织工程气管构建过程中的核心部分是种子细胞与支架材料的复合培养.旋转式生物反应器内的三维动态培养是近年来种子细胞和支架材料的主要复合培养方式.最近,体内组织工程气管和体内生物反应器新概念的提出给组织工程气管的构建带来了新的思路,使组织工程气管大规模的临床使用成为可能.     

脂肪干细胞和自体富血小板血浆载体复合物体内构建血管化组织工程脂肪的可行性及疗效分析

目的 分析脂肪干细胞以及自体富血小板血浆作为载体复合物在体内进行血管化组织工程脂肪构建的可行性以及应用效果.方法 取吸脂术后健康成人的脂肪组织,并分离出脂肪干细胞,进行原代以及传代培养,以BrdU标记第3代脂肪干细胞,并进行定向诱导,配置细胞悬液,取细胞悬液5 mL+富血小板浆工作液100 μL(实验组,n=10)或DMEM培养基100 μL(对照组,n=10)+纤维蛋白胶0.5 mL,分别移植于裸鼠的背部皮下.结果 人脂肪干细胞的形态表现较好,免疫荧光阳性标记率在90％以上;实验组新生组织湿重为(0.1525±0.0142)g,脂肪组织微血管数为(45.9±5.4)支,对照组分别为(0.0858±0.0104)g、(18.2±3.7)支,实验组均显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);两组新生组织经免疫荧光染色显示,细胞和以及部分微血管的内皮细胞核均呈现出绿色荧光.结论 脂肪干细胞、自体富血小板血浆以及纤维蛋白胶载体在机体内能够促进形成血管化组织工程脂肪,且自体富血小板血浆能够促进组织工程构建物重建血运,从而提高种子细胞的成活率.     

间充质干细胞与其诱导血管内皮细胞联合种植构筑血管化组织工程骨修复兔大段骨缺损

目的 研究间充质干细胞(MSC)与其诱导的血管内皮细胞(EC)联合种植于多孔β-磷酸三钙(β-TCP)构筑血管化组织工程骨修复大段骨缺损的作用.方法 制备兔双侧尺骨1.5 cm骨缺损共64侧,分4组修复(n=16),A空白未治疗组,B单纯材料组(植入β-TCP),C组织工程骨组(植入MSC+β-TCP),D血管化组织工程骨组(植入MSC+EC+β-TCP),各组交叉配对.术后4、8、12、16周行x线片、放射性核素骨显像、大体解剖、组织切片、生物力学等检查,观察各组骨缺损修复效能及移植物血管化情况.结果 D血管化组织工程骨组完美修复骨缺损,且修复效能及血管化情况优于C组织工程骨组,C组织工程骨组优于B单纯材料组,A空白组未能修复骨缺损.各组结果差异有统计学意义(均P＜0.05).结论 MSC与其诱导EC联合种植构筑的血管化组织工程骨能促进成骨过程和新生骨的血管化,显著提高组织工程骨修复大段骨缺损的能力.     

间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的形态学观察

目的探讨以间充质干细胞(MSC)与同种异体脱钙骨复合培养法构建组织工程化生物衍生骨的可行性。方法预先制备同种异体脱钙骨,取健康成人骨髓,用单核细胞分离液分离MSC,间充质干细胞基础培养基原代和传代培养。倒置显微镜下观察细胞生物学特性,用FITC标记的抗CD105对第3代细胞进行流式细胞鉴定,并与同种异体脱钙骨复合培养1周后行扫描电镜观察。结果原代及传代培养的MSC增殖迅速,第3代CD105阳性细胞占64.1%,复合同种异体脱钙骨培养1周后细胞生长状态良好,增殖迅速,在材料表面形成细胞层。结论未诱导的MSC是骨组织工程适宜的种子细胞,与同种异体脱钙骨复合可作为骨组织工程的载体。     

多发性骨髓瘤患者自然杀伤细胞体外扩增及其抗自体骨髓瘤作用

目的探讨体外高效扩增多发性骨髓瘤(MM)患者自身自然杀伤细胞(NK细胞)的方法,研究扩增前和扩增后NK细胞对骨髓瘤细胞株U266和自体骨髓瘤细胞的杀伤作用。方法 10例MM患者的外周血单个核细胞与K562转基因细胞株在含不同浓度白细胞介素(IL)-2的培养液中共育14d,应用流式细胞仪,采用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法和铬51释放法等方法,研究NK细胞的扩增情况、增殖能力、免疫表型和抗骨髓瘤作用。结果 300U/mLIL-2共培养体系扩增NK细胞的扩增倍数为196.4±12.8,扩增后NK细胞存活率>95%,IL-2能增强共培养体系中NK细胞的增殖能力。在效靶比为10∶1时,扩增后NK细胞对自体骨髓瘤细胞的平均杀伤率为(38.1±6.2)%,显著高于扩增前的(3.9±1.7)%(P<0.01)。结论 K562转基因细胞株能特异性刺激骨髓瘤患者NK细胞扩增,扩增后NK细胞抗自体骨髓瘤的作用显著增强,扩增并活化的NK细胞将有望作为临床治疗MM的免疫治疗方法。     

早期贴壁分离并机械刮除纯化法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系

①目的探讨早期（60-80分钟）贴壁分离法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系，对细胞贴壁分离的时机以及传代后的形态变化的影响。②方法采用早期贴壁分离方法及机械刮除纯化法纯化问充质细胞，并用钙钴法染色检测细胞的ALP表达情况、使用成骨诱导荆诱导间充质细胞。用茜素红染色观察矿化结节的形成。③结果第一代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性；经条件培养基定向培养5天的细胞呈集落生长，并形成钙结节，茜素红染色阳性。④结论采用早期贴壁分离法可以短期内得到大量较纯的免间充质干细胞。在诱导剂作用下可成功分化成为成骨细胞，是培养骨组织工程用途的种子细胞的理想方法。     

组织工程猪膀胱无细胞基质的制备

目的探讨猪膀胱无细胞基质制备的方法及其作为生物支架材料应用于组织工程膀胱构建的可行性。方法分别采用酶消化法和去污剂洗涤法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理并进行HE染色及电镜检查。应用MTT法进行细胞毒性测定。对5只新西兰兔行大部分膀胱切除术后,采用异种膀胱无细胞基质修补,6周后取材观察修复组织再生情况。结果两种方法均能去除膀胱中细胞成分,光镜及电镜观察无细胞成分残留,细胞毒性测定为1级,细胞相容性好。兔膀胱修补后6周支架材料上有移行上皮及肌肉组织生长。结论经脱细胞处理的猪膀胱无细胞基质具有良好的组织相容性,有作为组织工程膀胱支架材料的应用前景。     

共培养大鼠内皮祖细胞对白体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）与自体骨髓基质细胞（BMSCs）共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离、培养大鼠BMSCs和EPCs,培养细胞分为四组：A组（BMSCs组）、B组（EPCs组）、C组（BMSCs成骨诱导组）及D组（BMSCs和EPCs联合培养组）。通过观察细胞克隆形态、免疫细胞化学、细胞增殖、碱性磷酸酶活性,从酶学、组织学及生化等不同方面观察EPCs对BMSCs成骨活性及生长情况的影响。结果免疫细胞化学染色证实C组培养的细胞具有晚期EPCs的特性。倒置相差显微镜、HE染色均证实共培养的BMSCs和EPCs生长良好,并能够形成与单纯成骨诱导培养的BMSCs相似的钙结节。MTr检测结果：各组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）。碱性磷酸酶活性检测结果：C、D组显著高于A、B组（P〈0．05）。结论EPCs和BMSCs联合培养具有良好的细胞相容性,EPCs能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力。