双反义腺病毒载体Ad—ODC—AdoMetDOas对食管癌细胞凋亡及抑制细胞生长影响的研究

目的：探讨双反义腺病毒载体（Ad—ODC—AdoMetDCas）对食管癌Eca109细胞凋亡作用及抑制细胞生长的影响。方法：应用M1Tr法测定不同MOI的腺病毒对肺癌Eca109细胞的基因转染效率，观察Ad—ODC—AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响；采用Western印迹和HPLC的方法分别检测腺病毒载体对食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺含量的抑制作用，采用流式细胞术检测腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶反义RNA（Ad—ODCas）和Ad—ODC—AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞周期分布的影响，同时应用原位末端标记（TUNEL）法观察Ad—ODC—AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞凋亡作用的影响。结果：MTT法实验表明，Ad—ODC—AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖有显著抑制作用（P〈0．05）。以Ad—ODC—AdoMetDCas感染食管癌Eca109细胞，可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC基因表达（P〈0．05）。流式细胞术结果显示感染了Ad—ODC—AdoMetDCas的食管癌Eca109细胞周期阻滞在G。期。HPLC结果显示，食管癌Eca109细胞感染Ad—ODC—AdoMetDCas后，细胞内3种多胺含量均明显降低（P〈0．05）。TUNEL标记检测结果显示，Ad—ODC—AdoMet—DCas可明显引起食管癌Eca109细胞凋亡（P〈0．05）。结论：Ad—ODC—AdoMetDCas能显著抑制食管癌细胞生长，促进细胞凋亡，为探讨食管癌基因治疗的可行性提供实验依据。     

鸟氨酸脱羧酶和S-甲硫氨酸脱羧酶双反义RNA腺病毒抑制食管癌细胞的增殖和侵袭

目的:探讨鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC) 和 S-甲硫氨酸脱羧酶(s-adenosylmethionine decarboxylase,AdoMetDC)的双反义RNA腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCas)对食管癌Eca109细胞增殖和侵袭的抑制作用.方法:重组腺病毒载体Ad-ODC-AdoMetDCas感染食管癌Eca109细胞,应用Western blotting和HPLC分别检测双反义RNA腺病毒对食管癌细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺合成的抑制作用.采用活细胞计数法观察其对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响,采用Matrigel侵袭实验检测重组腺病毒载体感染对食管癌Eca109细胞侵袭活性的影响.同时应用裸鼠皮下移植瘤模型观察Ad-ODC-AdoMetDCas对移植食管癌生长增殖的抑制作用.结果:Western bloting证实Ad-ODC-AdoMetDCas可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白的表达,HPLC结果显示食管癌Eca109细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后细胞内腐胺、精胺、精脒等3种多胺含量都明显降低(P<0.01).活细胞计数法表明Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖有明显抑制作用(P<0.01),Matrigel侵袭实验结果显示Ad-ODC-AdoMetDCas可显著降低食管癌Eca109细胞的体外侵袭能力(P<0.01).体内实验显示,双反义RNA腺病毒载体对已形成的裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01).结论:ODC和AdoMetDC双反义RNA重组腺病毒能显著抑制食管癌细胞的增殖和侵袭,具有食管癌基因治疗临床应用的潜在价值.     

ODC反义寡核苷酸对K562细胞生长抑制作用

鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)是催化多胺生物合成的限速酶.过去的研究表明多胺在维持肿瘤恶性表型中起着重要作用.用ODC不可逆抑制剂抑制多胺生物合成不仅能抑制肿瘤细胞的增殖而且还诱导细胞分化.近年我们采用反义技术,以ODC反义RNA转染肿瘤细胞,通过对ODC表达的封闭,成功地使其恶性表型得到了逆转.提示抑制肿瘤细胞的多胺合成可能是抗癌的有效途径.本文用ODC反义寡核苷酸控制肿瘤细胞的多胺生物合成,观察了其对K562细胞生长特性的影响,以期为ODC反义寡核苷酸在肿瘤临床的应用提供实验依据.     

ODC反义RNA转染细胞的肿瘤相关基因表达及其致瘤性

鸟氨酸脱羧酶(ODC)是多胺生物合成途径中的限速酶，其活性的异常升高和继之引起的多胺堆积与肿瘤的发生、发展及转移密切相关。我们曾自行构建人ODC反义RNA真核表达质粒，并转染人肺鳞癌细胞，观察到稳定转染细胞株的生长速度减慢；大分子生物合成受到抑制；ODC mRNA表达减少和ODC活性降低等。     

反义CⅡTA基因对鼠异位气管移植慢性免疫排斥反应的抑制作用

目的:构建携带鼠MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC classⅡmolecule transactivator,CⅡTA)反义RNA的腺病毒载体,观察腺病毒介导该基因对小鼠异位气管移植慢性免疫排斥反应的抑制作用。方法:设计鼠CⅡTA mRNA为模板的反义片段,构建可表达反义片段的腺病毒载体(AdEasy-1系统),经HEK293细胞包装产生含反义片段重组腺病毒Ad-asCⅡTA,扩增、纯化。建立小鼠异位气管移植模型,用包装后的腺病毒注射并感染移植体周围,观察其对免疫排斥反应的抑制作用。结果:成功包装出含CⅡTA反义基因的重组腺病毒;重组腺病毒可感染气管移植体,Ad-asCⅡTA感染组移植气管组织炎症反应和纤毛上皮变性坏死等较对照组明显减轻。结论:重组腺病毒表达的小鼠反义CⅡTA基因能通过对MHCⅡ类分子的抑制而抑制异位气管移植的慢性免疫排斥反应。这为气管移植治疗气管肿瘤和气管狭窄等疾病奠定了一定的实验基础。     

ODC反义寡核苷酸对K562细胞的抑瘤作用

鸟氨酸脱羧酶(ODC)是催化多胺生物合成的限速酶.多胺在维持肿瘤恶性表型中起着重要作用,本室多年的研究表明,控制多胺生物合成可以抑制肿瘤细胞生长,诱导分化,增强对化疗药物的敏感性.近年,我们以ODC为靶基因构建了ODC反义RNA表达载体,以此转染人肺鳞癌细胞,成功地使其恶性表型得到了逆转.进一步说明抑制多胺生物合成     

双反义腺病毒载体Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌细胞凋亡及抑制细胞生长影响的研究

目的:探讨双反义腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCas)对食管癌Eca109细胞凋亡作用及抑制细胞生长的影响.方法:应用MTT法测定不同MOI的腺病毒对肺癌Eca109细胞的基因转染效率,观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响;采用Western印迹和HPLC的方法分别检测腺病毒载体对食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达以及胞内多胺含量的抑制作用,采用流式细胞术检测腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶反义RNA(Ad-ODCas)和Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞周期分布的影响,同时应用原位末端标记(TUNEL)法观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞凋亡作用的影响.结果:MTY法实验表明,Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖有显著抑制作用(P<0.05).以Ad-ODC-AdoMetDCas感染食管癌Eca109细胞,可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC基因表达(P<0.05).流式细胞术结果显示感染了Ad-ODC-AdoMetDCas的食管癌Eca109细胞周期阻滞在G1期.HPLC结果显示,食管癌Eca109细胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后,细胞内3种多胺含量均明显降低(P<0.05).TUNEL标记检测结果显示.Ad-ODC-AdoMet-DCas可明显引起食管癌Eca109细胞凋亡(P<0.05).结论:Ad-ODC-AdoMetDCas能显著抑制食管癌细胞生长,促进细胞凋亡,为探讨食管癌基因治疗的可行性提供实验依据.     

表皮生长因子受体反义重组腺病毒联合放射线对乳腺癌细胞的作用

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)反义重组腺病毒联合放射线对乳腺癌细胞的作用。方法人EGFR的cDNA片段被反向亚克隆入E1／E3缺失的5型腺病毒载体中而得到AdE5，EGFR反义RNA的表达由CMV启动子控制。进而研究其联合γ射线对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231成克隆能力及细胞周期分布的影响。结果MDA-MB-231细胞被AdE5感染后，EGFR蛋白质的表达被强烈地抑制。AdE5感染后以γ射线照射细胞，成克隆能力被抑制。且这种作用与病毒量和照射剂量相关联。进而流式细胞仪分析显示，300pfu／细胞的AdE5感染可使MDA-MB-231细胞摆脱对放射线抗拒的G0 G1期，进入对放射线敏感的G2 M期，从而使AdE5联合放射线表现为协同效应。结论以腺病毒载体介导的EGFR反义RNA转导可有效地用于针对EGFR的反义治疗策略，提高放射线对乳腺癌细胞杀灭作用。     

ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体抑制人食管癌Eca109细胞增殖和侵袭的研究

背景与目的:食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一,对人民的生命和健康危害极大.有研究发现,在食管癌细胞和肿瘤组织中多胺的含量和生物合成明显增高.本研究中我们探讨ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体(Ad-ODC-AdoMetDCaa)对人食管癌Eca109细胞多胺合成、细胞增殖和侵袭的抑制作用.方法:采用活细胞计数法和BrdU掺入实验观察Ad-ODC-AdoMetDCas对Eca109细胞增殖的影响;应用Western blot法和HPLC法分别检测腺病毒对Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达的影响,以及胞内多胺合成的抑制作用,采用Matrigel侵袭实验分析腺病毒载体对Eca109细胞侵袭活性的影响,同时检测Ad-ODC-AdoMetDCas对Eca109细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用.结果:活细胞计数法和BrdU掺入实验表明,Ad-ODC-AdoMetDCas对Eea109细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05).Westem blot证实Ad-ODC-AdoMetDCas可明显抑制Eea109细胞中ODC和AdoMetDC基因表达.HPLC结果显示,感染Ad-ODC-AdoMetDCas后,Eca109细胞内三种多胺腐胺、精脒、精胺含量均明显降低(P<0.05).Matrigel侵袭实验结果显示.Ad-ODC-AdoMetDCas可显著降低Eca109细胞的体外侵袭能力(P<0.05).同时发现,与Ad-GFP相比,Ad-ODC-AdoMetDCas对裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制作用.结论:ODC和AdoMetDC双反义腺病毒载体具有显著抑制Eca109细胞增殖和侵袭的作用.     

反义核酸对肿瘤的治疗作用

鸟氮酸脱羧酶（ODC）是多胺生物合成途径中的限速酶．其活性的异常升高及多胺堆积与恶性肿瘤的发生、发展及转移密切相关。作者构建一个能表达人ODC反义RNA的真核表达质粒pCMV／ODCas，用磷酸钙沉淀法将其导入人肺鳞癌细胞系LTEP-78(L78）经G418筛选，获两株转染细胞系L78／ODCasl和L78／ODCas4。与亲本细胞相比，其生长速度减慢，软琼脂集落形成能力减弱，DNA、RNA及蛋白质等生物合成受到抑制，ODC酶活性降低。经Southern blot及PCR分析，进一步证明了上述变化与ODC反义序列稳定完整地整合到转染细胞基因组中有关。