兔视网膜Mller细胞的原代培养

目的探索体外培养兔视网膜Mller细胞的有效方法。方法采用酶消化法从乳兔视网膜获取Mller细胞,通过振荡和反复洗涤使之纯化。采用免疫组织化学技术和透射电镜对传代Mller细胞进行鉴定。结果培养24h后即有部分细胞贴壁生长,72h后贴壁细胞进一步增多。通过振荡吹打可使附着于Mller细胞上的神经元脱落。20～25d后细胞接近融合,呈三角形或不规则形。传代后细胞经1周达到融合。培养细胞GFAP阳性率在95%以上。电镜观察显示:细胞内含有线粒体、粗面内质网、核糖体及8～10nm的中间丝。结论利用酶消化法可成功分离兔视网膜Mller细胞,通过振荡和吹打洗涤,可使之纯化。     

兔视网膜Mūeller细胞的原代培养

目的探索体外培养兔视网膜Mūeller细胞的有效方法。方法采用酶消化法从乳兔视网膜获取Mūeller细胞，通过振荡和反复洗涤使之纯化。采用免疫组织化学技术和透射电镜对传代Mūeller细胞进行鉴定。结果培养24h后即有部分细胞贴壁生长，72h后贴壁细胞进一步增多。通过振荡吹打可使附着于Mūeller细胞上的神经元脱落。20～25d后细胞接近融合，呈三角形或不规则形。传代后细胞经1周达到融合。培养细胞GFAP阳性率在95％以上。电镜观察显示：细胞内含有线粒体、粗面内质网、核糖体及8～10nm的中间丝。结论利用酶消化法可成功分离兔视网膜Mūeller细胞，通过振荡和吹打洗涤，可使之纯化。     

缺氧对视网膜Müller细胞促红细胞生成素mRNA和蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧条件下促红细胞生成素（EPO）mRNA及蛋白在体外培养的Müller细胞的表达情况。 方法 胰酶消化新生大鼠视网膜组织制成单细胞悬液，机械震荡、吹打法分离纯化视网膜Müller细胞，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学方法对缺氧条件下视网膜Müller细胞EPO基因和蛋白的表达进行测定。 结果 成功获得视网膜Müller细胞，传代后95%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。EPO蛋白的阳性染色位于视网膜Müller细胞的细胞浆及突起上。在正常的视网膜Müller细胞中仅见微弱的EPO mRNA和蛋白表达，而缺氧后表达明显上调，且呈时间依赖性。 结论 Müller细胞在缺氧条件下EPO mRNA和蛋白表达增强，EPO表达水平的升高可能是缺氧性视网膜病变的神经保护因素之一。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 196-199)     

糖尿病视网膜Müller细胞病理改变的体内外研究

目的研究糖尿病视网膜Müller细胞的病理改变.方法用链脲菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠糖尿病模型,3个月后观察视网膜Müller细胞超微结构的变化.行免疫组织化学染色,在激光共聚焦显微镜下观察视网膜Müller细胞GFAP、VEGF表达的改变;纯化培养出生5～7d(SD)乳鼠的Müller细胞,在其中加入糖基化终末产物(AGEs)2500μg/mL,培养24h后,用MTT方法检测细胞活性.结果3个月后电镜观察发现糖尿病鼠视网膜Müller细胞突起有损伤表现,微血管内皮细胞、周细胞未见病理改变;正常鼠视网膜VEGF染色阴性,视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP染色;糖尿病鼠除视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP染色外,其余各层也可见丝条状贯穿于内外界膜之间的GFAP染色,在上述部位有VEGF及GFAP的共表达.培养24h后,2500μg/mL质量浓度的AGEs对Müller细胞活性有显著促进作用.结论反应性胶质化增生可能是糖尿病早期Müller细胞的主要病理改变,它所引起的Müller细胞结构和功能改变应在糖尿病视网膜病变(DR)的发生发展中起重要作用.AGEs可能是DR中视网膜Müller细胞反应性胶质化增生的重要致病因素.     

腹腔渗出细胞辅助原代培养成年大鼠视网膜Müller细胞

目的 观察以腹腔渗出细胞为饲养细胞对原代培养的成年大鼠视网膜Müller细胞生长状态的影响。方法 制备大鼠腹腔渗出细胞,CD68免疫组织化学染色鉴定巨噬细胞,墨汁吞噬实验检测吞噬活性。酶消化法原代培养成年大鼠视网膜Müller细胞,神经胶质酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白免疫组织化学染色鉴定。饲养细胞加入Müller细胞进行共培养后,流式细胞术分析Müller细胞的生长周期,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口翻译法（TUNEL）染色检测凋亡情况。结果 大鼠腹腔渗出细胞中巨噬细胞占95%以上,对墨汁颗粒有良好的吞噬能力。原代培养的Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,第3代细胞生长减慢。加入饲养细胞后,Müller细胞生长增生加快,S期和G2/M期细胞增多（S期, t=4.172, P<0.001;G2/M期, t=3.562, P<0.01）,第1代细胞生长时间由25~30 d缩短至18~22 d,第2代由10~15 d缩短至7~10 d;Müller细胞凋亡减少（t=3.804, P<0.01）。结论 以腹腔渗出细胞为饲养细胞能促进Müller细胞的生长增生,抑制其凋亡,加快Müller细胞的培养速度,是原代培养成年大鼠视网膜Müller细胞的一种有效方法。     

高浓度胰岛素对兔视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子的影响

目的探讨高浓度胰岛素对体外培养的视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法采用免疫细胞化学法、原位杂交法及ELISA法,定性、定量测定在不同浓度胰岛素条件下,体外培养的兔视网膜Müller细胞表达VEGF的变化.结果胰岛素能明显增强VEGF的表达,并通过转录水平调节.结论高浓度胰岛素可能通过刺激Müller细胞编码VEGF基因的转录,增强VEGF蛋白的表达,从而加速糖尿病视网膜病变的新生血管形成.     

体外培养兔视网膜Müller细胞葡萄糖转运载体蛋白1表达及其影响因素研究

目的观察高糖以及高浓度胰岛素等不同因素对体外培养兔视网膜Müller细胞葡萄糖转运载体蛋白1(GLUT1)表达的影响。方法利用组织块悬浮法原代培养兔视网膜Müller细胞，分为正常对照组、高糖组、胰岛素组、高糖加胰岛素组，通过激光共聚焦显微镜结合免疫细胞化学、荧光染色的方法，定位定量分析GLUT1的表达情况。结果高糖及高浓度胰岛素条件下视网膜Müller细胞GLUT1的表达均明显增强，并主要位于细胞浆靠近核膜周围。结论视网膜Müller细胞可表达GLUT1，高糖以及高浓度胰岛素均可使其表达增强。 （中华眼底病杂志，2008，24：265-267）     

高糖对体外培养的视网膜Müller细胞膜离子通道的影响

目的 观察在高浓度葡萄糖条件下，体外培养的兔视网膜Müller细胞的钙依赖性钾(K_Ca)通道的变化。 方法 高浓度葡萄糖条件下体外培养兔视网膜Müller细胞，并用免疫组织化学染色及透射电镜鉴定培养的Müller细胞，采用膜片钳方法观察不同时间高糖条件下视网膜Müller细胞K_Ca通道的变化。 结果 高糖对体外培养的Müller细胞K_Ca通道有阻滞作用，其阻滞作用呈时间依赖性。 结论 高浓度葡萄糖可能通过阻滞K Ca通道而降低 Müller细胞的生物学功能。 （中华眼底病杂志，2003，19：164-167）     

新生大鼠视网膜Müller细胞原代培养纯化及鉴定

目的 探讨新生SD大鼠视网膜Müller 细胞原代培养的方法.方法 用酶消化法分离制备视网膜细胞悬液,采用分次贴壁和反复吹打法分离并纯化Müller 细胞,进行形态学观察及免疫组织化学染色.结果 光镜下培养细胞体较大,呈扁平不规则形状;免疫组织化学染色显示95%以上的原代细胞神经胶质纤维酸性蛋白染色阳性;电镜下细胞内可见丰富的线粒体、高尔基体和大量直径8～10 nm的微丝结构.结论 分次贴壁和反复吹打法是一种简单可靠的视网膜Müller 细胞原代培养的方法.     

豚鼠近视眼视网膜M&#252;ller细胞的原代培养

目的研究豚鼠近视眼视网膜M&#252;ller细胞原代培养的方法。方法用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型。采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜M&#252;ller细胞,用倒置相差显微镜观察M&#252;ller细胞的生长状况,以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定。结果半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。原代培养的视网膜M&#252;ller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性。结论酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜M&#252;ller细胞的一种有效方法。     

改良的人视网膜Müller细胞的原代培养方法与鉴定

背景 视网膜Müller细胞是视网膜重要的胶质细胞,也是视网膜干细胞的来源之一,研究Müller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义,而建立稳定的视网膜Müller细胞培养体系是相关研究的基础. 目的 优化分离培养和纯化人视网膜Müller细胞的方法,为相关的实验研究提供良好优质的Müller细胞来源. 方法 分离人供体眼视网膜组织,然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0.25％胰蛋白酶+100 U透明质酸酶混合溶液中进行消化,添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液1～2 ml终止消化,然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72 h,行半量换液,再以含10％胎牛血清的培养液进行传代.光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定,并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Müller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶(GS)的表达,对培养的细胞进行鉴定.结果 应用0.25％胰蛋白酶+100 U(商品单位)透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Müller细胞,原代培养后24 h细胞贴壁,培养后9～1Od细胞融合.培养的细胞胞体呈长圆形,细胞质丰富,部分细胞体两端锥状长突起,末端膨隆,细胞核大.传代后的细胞胞体大,呈扁平多角形,符合Müller细胞的形态.细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达,90％以上的细胞中GS呈强阳性表达. 结论 应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Müller细胞,分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养和传代的人视网膜Müller细胞产量高且纯度好.     

黄连素对高糖培养下大鼠视网膜Müller细胞增殖的影响

目的：研究黄连素对体外高糖环境下的SD大鼠视网膜Müller细胞增殖的影响。

方法：采用酶消化法原代培养SD大鼠视网膜Müller细胞,将第2代Müller细胞随机分为正常糖浓度(5mmol/L)组、高糖浓度(25mmol/L)组、高糖+不同浓度(5、10、25、50、100μmol/L)黄连素组,分别培养24、48、72h后,采用CCK-8法检测细胞增殖活性。

结果：培养24、48、72h时,高糖浓度组Müller细胞吸光度值较正常糖浓度组明显降低(均P<0.01); 10、25、50、100μmol/L黄连素组细胞吸光度值较高糖浓度组明显升高(均P<0.05),且呈剂量依赖性; 5μmol/L黄连素组细胞吸光度值与高糖浓度组无明显差异(P>0.05)。

结论：黄连素在一定程度上能够减轻高糖对Müller细胞增殖活性的抑制作用,其作用强度与黄连素浓度呈正相关。     

兔眼视网膜铁锈症中Müller氏细胞的变化

在电镜下观察了兔眼视网膜铁锈症中Müller氏细胞的变化。其变化有:(1)细胞变形,极性特征消失;(2)胞突扩张,填补细胞变性的空隙;(3)胞浆内出现大量线粒体;(4)并见色素颗粒及感光细胞的残片;(5)在视网膜不同层次,Müller氏细胞之间形成排列紊乱的粘着小带。证实Müller氏细胞具有相当活跃的吞噬及修补功能。推测含铁物质的毒性可能通过Müller氏细胞传递,影响视网膜色素上皮细胞及感光细胞。     

阿柏西普对大鼠视网膜Müller细胞STAT3表达的影响

目的：探讨阿柏西普对大鼠视网膜Müller细胞信号转导及转录活化因子3(STAT3)表达的影响。

方法：采用不同浓度的阿柏西普 100μL(加药浓度分别为400、200、100pg/mL)大鼠永生化视网膜Müller细胞24、48h后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell小室法检测细胞侵袭,Western-blot法检测AKT、STAT3蛋白表达。

结果：随着阿柏西普浓度的升高,Müller细胞的增殖活性下降(P<0.05)。处理48h后,随着阿柏西普浓度的升高,Müller细胞的凋亡率逐渐上升,Müller细胞的侵袭穿透指数逐渐降低(P<0.05)。转染48h后,随着阿柏西普浓度的升高,Müller细胞的AKT蛋白相对表达量无显著变化(P>0.05),STAT3蛋白相对表达量逐渐降低(P<0.05)。

结论：阿柏西普可抑制大鼠视网膜Müller细胞STAT3蛋白表达,从而抑制细胞增殖与侵袭性,促进细胞凋亡。     

SD大鼠Müller细胞的原代培养

目的:原代分离培养SD大鼠Müller细胞,在实验室建立Muller细胞株.方法:采用改良的酶消化法培养新生大鼠的视网膜Müller细胞,免疫组化法进行鉴定.结果:原代培养的Muller细胞胞体狭长,胞浆丰富,经过3～5次传代后逐渐变得胞体宽大,出现微丝和突起.免疫组化显示,95%以上的细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性.结论:改良的酶消化法是培养视网膜MUller细胞的简单有效的方法.     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体表达的影响

目的研究羊膜对兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响及其机制。方法取出生15d新西兰白兔视网膜Müller细胞进行原代培养及传代,采用神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100进行细胞鉴定。0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA酶消化取第3代Müller细胞,实验组加0.5mL羊膜匀浆上清液继续培养12h,采用免疫组织化学法检测羊膜诱导和非诱导条件下兔视网膜Müller细胞EGFR表达的变化并进行分析。结果培养的兔视网膜Müller细胞GFAP和S-100表达阳性,透射电镜检查细胞质内可见8～10nm的中间丝。未经羊膜诱导的视网膜Müller细胞EGFR有少量表达,经羊膜诱导12h后,EGFR表达明显增多,2组灰度值分别为571588.80±67862.68和1000352.00±98386.22,差异有统计学意义（t=4.035,P〈0.01）。结论经羊膜诱导后可促进培养的兔视网膜Müller细胞EGFR的表达。     

Müller细胞对视网膜血管内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响

目的
探讨体外培养的Müller细胞在糖基化终末产物（AGEs）作用下增殖活性的变化，以及这种改变对牛视网膜血管内皮细胞（BREC）紧密连接蛋白（occludin）表达的影响。
方法
培养新生大鼠Müller细胞和BREC，两类细胞均用特异性抗体进行免疫鉴定。将培养的BREC分4组观察：第1组未添加任何细胞上清液；第2组添加正常Müller细胞上清液；第3组添加糖基化终末产物(AGEs)作用后的Müller细胞上清液；第
4组无细胞组，为空白对照组。酶联免疫吸附法（ELISA）测定4组细胞上清液中紧密连接蛋白的含量，比较其变化。
结果
添加正常Müller细胞上清液组紧密连接蛋白表达量最多，未添加任何细胞上清液组次之，添加AGEs作用后的Müller细胞上清液组更少。
结论
AGEs能促进Müller细胞异常增殖、抑制BREC表达紧密连接蛋白。
(中华眼底病杂志, 2006, 22: 28-30)     

阿柏西普对体外培养的视网膜Müller细胞膜离子通道的影响

目的：探讨阿柏西普对体外培养的高糖环境下视网膜Müller细胞膜K⁺通道的影响。

方法：人Müller细胞分为3组：对照组(常规DMEM培养基培养)、高糖组(高糖DMEM培养基培养)、实验组(高糖DMEM培养基和100μmol/L 阿柏西普处理)。采用荧光探针检测细胞K⁺浓度,MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot法检测Müller细胞caspase-3蛋白水平。

结果：Müller细胞培养48h后呈现谷氨酰胺合成酶(GS)阳性,纯化度在90%以上。荧光检测显示对照组、高糖组、实验组K⁺相对浓度分别为(2.14±0.44)%、(23.11±4.39)%、(5.20±0.92)%,细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(73.24±4.13)%、(85.22±5.33)%,细胞凋亡率分别为(5.03±1.91)%、(26.73±3.14)%、(16.63±2.73)%(均P<0.05)。 与对照组相比,高糖组Müller细胞内caspase-3蛋白水平显著上升(P<0.05); 与高糖组Müller细胞相比,实验组Müller细胞内caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)。

结论：阿柏西普可抑制体外培养的高糖环境下视网膜Müller细胞膜K⁺通道,抑制高糖诱导的Müller细胞凋亡,降低caspase-3蛋白表达水平,促进细胞增殖。     

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜M&#252;ller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜M&#252;ller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜M&#252;ller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染M&#252;ller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对M&#252;ller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜M&#252;ller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染M&#252;ller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7&#177;1.9）%、（18.1&#177;16）%、（17.2&#177;2.5）%、（16.9&#177;1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2&#177;5.6）%、（96.1&#177;6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导M&#252;ller细胞的转染,为进一步明确M&#252;ller细胞的病理、生理功能及靶向M&#252;ller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

SD大鼠Mller细胞的原代培养

目的：原代分离培养SD大鼠Müller细胞,在实验室建立Müller细胞株。方法：采用改良的酶消化法培养新生大鼠的视网膜Müller细胞,免疫组化法进行鉴定。结果：原代培养的Müller细胞胞体狭长,胞浆丰富,经过3～5次传代后逐渐变得胞体宽大,出现微丝和突起。免疫组化显示,95%以上的细胞谷氨酰胺合成酶染色阳性。结论：改良的酶消化法是培养视网膜Müller细胞的简单有效的方法。