随机扩增多态性DNA的研究

随机扩增多态性 DNA(RAPD)是 1990年首次由 William等 [1 ]提出的用于监测 DNA多态性的新型的 PCR技术。它是利用单个的、任意序列的寡聚核苷酸作引物 ,随机地与靶序列完全或部分配对 ,以扩增出特异的 DAN产物。 RAPD方法与传统的 PCR技术比较 ,最显著的优点是 :事先不需要知道目的基因组的任何序列信息 ,便可直接用一任意序列的引物对整个基因组进行分析 ,极大地提高了效率。因其引物序列的任意性 ,没有种属特异性 ,所以不同种属的结果可以相互比较。且灵敏度高 ,能监测出单个碱基的变化 [1 ] 。因此 ,该方法一经提出 ,便迅速得…     

分子标记技术在寄生虫分类鉴定中的应用

寄生虫在生物学上有差异的亚种和株具有不同的致病性, 其分类学对于寄生虫病的病原学、流行病学和防治等方面具有实际意义。DNA分子标记是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记, 具备多态性高、无基因多效性、能够明确辨别等位基因等优点。本文综述第1代（限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA等）、第2代（微卫星锚定PCR、简单重复序列间扩增等）和第3代（单核苷酸多态性）分子标记技术在寄生虫分类鉴定中的应用。     

五条蚋细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的生物信息学分析

以五条蚋基因组DNA为模板PCR扩增其COⅠ基因序列,将所得片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选阳性克隆。经PCR与双酶切鉴定,获得阳性重组质粒pMT18-T-COⅠ,测序后作序列分析和同源性比较。结果表明,从五条蚋DNA中扩增出COⅠ基因及5′端tRNA-Tyr基因和3′端tRNA-Leu基因部分片段共1 621 bp,其中COⅠ基因序列长度为1 542 bp(GenBank登录号为DQ534949),与预期相符,该基因开放阅读框编码513个氨基酸,编码蛋白等电点为5.84,相对分子质量为M_r5 650,具有COⅠ基因的核心保守结构域。与GenBank已知基因(登录号为AY251520)的序列一致性为99%。     

PCR-RFLP和微卫星DNA标记法在棘球绦虫感染诊断中的应用

目的 探讨PCR-RFLP和微卫星DNA标记法诊断棘球绦虫感染的临床价值.方法 对40例包虫病患者的40个包囊标本提取DNA后,分别采用PCR-RFLP和微卫星DNA标记法进行检测.结果 以棘球绦虫DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,可得到大小约为561 bp的扩增条带,产物的长度与引物设计的预期产物长度一致.以棘球绦虫DNA为模板,用Sea引物进行PCR扩增,可得到约90 bp的扩增条带,产物的长度与引物设计的预期产物长度一致.40个标本均鉴定为细粒棘球绦虫,39个为细粒棘球绦虫G1基因型,1个为细粒棘球绦虫G6基因型.结论 PCR-RFLP和微卫星DNA标记法是简单、快速、有效的棘球绦虫基因型检测诊断方法.     

猪瘟病毒cDNA片段的合成及克隆

以猪瘟病毒石门系毒株常规感染 PK15细胞48小时后,去上清,直接用异硫氰酸胍一步法提取细胞总 RNA。根据猪瘟病毒Alfort 株的基因组序列化学合成了8条引物,用3′端引物及提取的总 RNA 进行反转录合成第一链 cDNA,再以此单链 cDNA 为模板,用 PCR 法扩增猪瘟病毒 cDNA 片段,2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果证明所扩增片段的长度与根据 Alfort 株基因组序列推测的长度相符,依次为693bp,629bp,346bp,285bp,120bp。用限制性内切酶分析进一步证明了所扩增片段的正确性。最后按标准方     

微卫星体简单重复序列锚定PCR扩增技术(SSR-PCR)及其在寄生虫基因研究中的应用

寄生虫基因变异现象是普遍存在的 ,了解其变异情况有助于寄生虫的防治控制及疫苗研制。早期的限制性酶切片段长度多态性 ( RFLP)等分子生物学技术的运用极大地推动了寄生虫遗传变异研究的深入发展。由于这些方法复杂、费时且 DNA需求量大 ,因而未广泛使用 ;特异性 PCR检测 DNA多态性 ,需预知靶基因核苷酸序列 ,设计合成特异性扩增引物 ,也限制了其广泛应用 ;90年代初报道的随机扩增多态性 DNA技术 ( RAPD) ,对 DNA差异研究敏感有效 ,但重复稳定性差。新近出现的基于微卫星体 DNA的简单重复序列锚定 PCR扩增技术 ( simplesequenc…     

日本血吸虫卵壳白基因的体外扩增

根据日本血吸虫卵壳蛋白基因的已知序列，借助计算机核酸序列软件分析，设计了一对引物。在5’端引物中引入HindⅢ酶切位点和起始密码子，在3’端引物中引入EcoRⅠ酶切位点和终止密码子，用PCR方法对日本血吸虫虫卵、雌虫、雄虫的基因组DNA进行体外扩增。1％琼脂糖凝胶电泳显示：雌虫和虫卵的基因组DNAPCR产物在618bp处出现特异扩增条带，而雄虫及对照组则无此条带出现。该条带与预期长度相符，并对PCR产物进行纯化和酶切。     

中华按蚊防御素基因 cDNA序列和基因组序列的克隆及鉴定

目的 克隆中华按蚊防御素基因全长cDNA序列及基因组序列,并对其进行鉴定和生物信息学分析。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊等的防御素基因序列设计引物,提取中华按蚊总RNA并构建其基因组文库,分别进行多轮RT-PCR和巢式PCR扩增,将所得片段进行克隆、测序,并应用相关生物信息学软件对序列进行鉴定和分析。结果 从中华按蚊基因组文库中扩增出完整的防御素基因组序列(由两个外显子和一个内含子组成)以及5′端和3′端的非编码序列(UTR)片段,总长度为2 256 bp;从中华按蚊总RNA中扩增出大小为324 bp的cDNA片段,经测序证实为中华按蚊防御素基因全长cDNA序列,其开放阅读框共编码107个氨基酸,成熟肽部分具有40个氨基酸残基。结论 首次克隆出中华按蚊防御素基因全长cDNA序列及基因组序列,为进一步的功能研究奠定了基础。     

湖北钉螺多态微卫星DNA位点筛选和特征初步分析

目的分离湖北钉螺的微卫星DNA序列,筛选多态的微卫星DNA位点并分析其特征。方法应用湖北钉螺基因组DNA的酶切片段与生物素标记的(AAT)17、(GA)25、(CCT)17、(CA)25等10个寡核苷酸探针杂交,富集、浓缩、克隆并测序,构建微卫星DNA库。挑选合适的微卫星DNA位点设计并合成引物,扩增钉螺样本经聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选多态性。结果获得湖北钉螺微卫星DNA序列205条,GenBank注册登记号GU204044～GU204248,其中完整重复序列74条,占36.10%;非完整重复序列102条,占49.76%;复合重复序列29条,占14.15%。设计合成的20对微卫星DNA位点引物中,经鉴定显示13个位点具有多态性。结论分离建立了湖北钉螺微卫星DNA序列库,为湖北钉螺群体遗传、种群溯源等相关研究提供了分子标志。