神经细胞黏附分子对小鼠骨髓间充质干细胞黏附、迁移及细胞形态的影响

目的探讨神经细胞黏附分子(NCAM)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、迁移及细胞形态的影响。方法从野生型小鼠和NCAM基因敲除小鼠中分离、培养BMSCs,Western blot和免疫荧光标记检测NCAM的表达;划痕实验和黏附实验分别检测细胞迁移和黏附能力;倒置显微镜下观察细胞形态;Western blot检测β1整联蛋白、E-cadherin、β-catenin和N-cadherin的表达。结果 NCAM基因敲除后细胞的迁移能力和黏附能力明显降低,β1整联蛋白的表达下调(P0.01),BMSCs形态由不规则形变为扁平形,且成簇增殖,上皮细胞标记蛋白E-cadherin和β-catenin的表达显著上调(P0.05),而间质细胞标记蛋白N-cadherin的表达下调(P0.01)。结论NCAM通过调控β1整联蛋白的表达影响BMSCs的黏附和迁移,同时NCAM可能对BMSCs的间质上皮转化起负调控作用。     

PKC在TNF-α诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ表达中的作用

目的:研究蛋白激酶C(PKC)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-GalT-Ⅰ)表达的调节作用,以及对内皮细胞骨架结构改变及其黏附能力的影响。方法:分别用PKC激动剂或几种不同类型的PKC抑制剂预处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs),再用TNF-α刺激HUVECs,应用RT-PCR、Western blot方法检测β-1,4-GalT-Ⅰ表达变化,应用细胞荧光染色观察β-1,4-GalT-Ⅰ催化的糖链的表达变化及细胞骨架结构的改变,通过内皮-单核细胞黏附试验观察HUVECs黏附能力的改变。结果:几种不同类型的PKC抑制剂均能不同程度的抑制TNF-α刺激HU-VECs引起的β-1,4-GalT-Ⅰ表达的上调,PKC激动剂能够使上调的β-1,4-GalT-Ⅰ的表达进一步增加;在HUVECs中β-1,4-GalT-Ⅰ与细胞骨架有共同定位,PKC抑制剂显著抑制TNF-α诱导的内皮细胞骨架蛋白的重构和β-1,4-GalT-Ⅰ细胞内的再分布;PKC抑制剂显著抑制TNF-α诱导的内皮-单核细胞黏附能力的上调。结论:PKC可能参与调节TNF-α诱导的HUVECsβ-1,4-GalT-Ⅰ的表达,并且可能多种类型的PKC参与了这一调节过程;PKC可能通过对β-1,4-GalT-Ⅰ的调节进而影响炎症过程中内皮细胞骨架蛋白的重构及内皮细胞与单核细胞的黏附能力。     

蛋白激酶C在脂多糖诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ表达中的作用

目的 研究蛋白激酶c(PKC)对脂多糖(LPS)诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ)表达的调节作用,以及对内皮细胞骨架结构改变及其黏附能力的影响.方法 分别用PKC激动剂或几种不同类型的PKC抑制剂预处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)30 min,LPS刺激HUVECs 4 h后,RT-PCR、Western blot方法 检测β-1,4一GalT-Ⅰ表达变化,细胞荧光染色观察β-1,4-GalT-Ⅰ催化的糖链表达变化及细胞骨架结构的改变,通过内皮-单核细胞黏附试验观察HUVECs黏附能力的改变.结果 几种不同类型的PKC抑制剂均能不同程度地抑制LPS刺激HUVECs引起的β-1,4-GalT-Ⅰ表达的上调,PKC激动剂能够使上调的β-1,4-GalT-Ⅰ的表达进一步增加;在HUVECs中β-1,4-GalT-Ⅰ与细胞骨架有共同定位,PKC抑制剂显著抑制LPS诱导的内皮细胞骨架蛋白的重构和β-1,4-GalT-Ⅰ细胞内的再分布;PKC抑制剂显著抑制LPS诱导的内皮-单核细胞黏附能力的上调.结论 PKC可能参与调节LPS诱导的HUVECs β-1,4-GalT-Ⅰ的表达,可能多种类型的PKC参与了这一调节过程;PKC可能通过对β-1,4-GalT-Ⅰ的调节进而影响炎症过程中内皮细胞骨架蛋白的重构及内皮细胞与单核细胞的黏附能力.     

缓解-复发型多发性硬化患者血脑屏障损害及sICAM-1、TNF-α水平的临床分析

在多发性硬化(multiple sclerosis,MS)及实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)中,血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)受到破坏,淋巴细胞介导BBB损害继而浸润中枢神经系统是MS发病特征之一,而炎症细胞黏附于内皮细胞是其由循环进入脑的第一步.研究表明细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)在脑微血管内皮细胞(BMEC)的表达增加与淋巴细胞黏附和穿越BBB有关,ICAM-1的水平的升高被认为是反映BBB遭到破坏[1]和病情进一步恶化的重要指标.     

微管相关蛋白1B在FMR1基因敲除小鼠睾丸间质细胞中的表达

目的对不同周龄的Fmr1基因敲除和野生型雄性小鼠睾丸组织微管相关蛋白1B的表达进行分析比较,探讨Fmr1基因敲除小鼠的睾丸间质细胞微管相关蛋白1B表达的差异。方法采用不同周龄(4、6、8、10周)的FMR1基因敲除型(KO)和野生型(WT)各6只,先采用聚合酶链式反应(PCR)技术对KO小鼠和WT小鼠进行基因型鉴定,之后所有小鼠麻醉取睾丸组织、石蜡包埋切片进行HE染色对比观察Fmr1小鼠睾丸组织的形态,最后用免疫组织化学染色技术对KO小鼠和WT小鼠睾丸微管相关蛋白1B的表达进行检测并作对比分析。结果微管相关蛋白1B在4～10周小鼠睾丸间质细胞阳性表达,8、10周为强阳性表达,且KO小鼠在睾丸的阳性表达均高于WT小鼠。结论微管相关蛋白1B在同周龄FMR1基因敲除小鼠睾丸间质细胞的表达均显著高于WT小鼠,提示微管相关蛋白1B可能参与脆性X综合征巨睾症的发病过程。     

尿路致病性大肠杆菌ppk1基因缺失株的构建及其生物学特性研究

目的构建尿路致病性大肠杆菌CFT073的聚磷酸盐激酶1（ polyphosphate kinase , PPK1）基因敲除株,并初步探索其体外生物学特性。方法以CFT073株为研究对象,利用Red同源重组技术敲除CFT073的ppk1基因,构建敲除株△pk1;通过细胞实验即以人膀胱癌上皮细胞5637为体外模型对CFT073野生型菌株、敲除菌株的黏附及侵袭能力进行比较;采用96孔板结晶紫染色法分析CFT073 ppk1基因敲除对其生物膜形成能力的影响。结果成功构建了CFT073 ppk1基因敲除株;敲除ppk1后,细菌对膀胱癌上皮细胞的黏附、侵袭能力较野生株都明显减弱;△pk1在各时间点570 nm处结晶紫吸光度值均较野生株的低。结论利用Red同源重组技术可成功敲除CFT073的ppk1基因,ppk1在尿路致病性大肠杆菌黏附、侵袭尿路上皮及生物膜形成过程中可能发挥了重要作用。     

细胞间黏附分子-1基因多态性与缺血性心脑血管疾病

细胞间黏附分子-1在炎症早期介导白细胞与受损内皮细胞的黏附，由于其基因多态性影响了缺血性心脑血管疾病的发生和预后，成为研究热点。本文就该研究领域的新进展做一综述。     

细胞间黏附分子-1基因多态性与缺血性心脑血管疾病

细胞间黏附分子-1在炎症早期介导白细胞与受损内皮细胞的黏附,由于其基因多态性影响了缺血性心脑血管疾病的发生和预后,成为研究热点。本文就该研究领域的新进展做一综述。     

抗人内皮细胞特异性分子-1单克隆抗体的研制和初步鉴定

运用B淋巴细胞杂交瘤技术 ,以人内皮细胞特异性分子 1(ESM 1)蛋白为抗原 ,经PEG融合 ,有限稀释法筛选 ,获得了 7株稳定分泌抗人ESM 1的杂交瘤细胞株 ,其中 3A7细胞株特异性尤为显著 ,效价高达 1∶6 0 0 0。所分泌抗体亚型为IgG2b ,Westernblot结果表明对内皮细胞中的ESM 1蛋白及细胞培养上清中的ESM 1均可特异性识别。并观察到ESM 1主要分布在内皮细胞的细胞胞质伴胞核中。在肾组织中 ,ESM 1定位于血管内皮细胞 ,且肾癌标本中ESM 1阳性表达显著高于正常肾组织。免疫组化结果表明所获单抗具有一定的特异性和实用性。     

新生儿脑膜炎大肠埃希菌 ompT 敲除株毒力分析

目的探讨新生儿脑膜炎大肠埃希菌ompT对菌株毒力的影响。方法对比野生致病株E44及ompT敲除株E44∶ΔompT两者体外黏附人脑微血管内皮细胞的能力;构建回复株,并考察ompT回补质粒pST及点突变质粒pST85能否恢复敲除株的黏附能力;考察ompT缺失对菌株定植乳鼠肠道能力的影响;考察 ompT 缺失对菌株穿越乳鼠血脑屏障的影响。结果相比野生株, E44∶ΔompT黏附人脑微血管内皮细胞能力明显降低;低拷贝质粒pST及点突变质粒pST85部分恢复了E44∶ΔompT的黏附能力;ompT缺失不影响菌株肠道定植能力;E44∶ΔompT可诱导与野生株相似水平的菌血症,但穿越乳鼠血脑屏障的能力显著降低。结论 ompT与菌体黏附脑微血管内皮细胞及穿越血脑屏障相关,OmpT蛋白水解酶活性在其中的作用有待进一步研究。     

Fmr1基因敲除小鼠的ABR阈值观察

目的对不同周龄的KO与WT小鼠听阈进行检测并对比,了解KO小鼠的听阈变化。方法采用PCR法鉴定FMR1基因敲除型(KO)纯合子(-/-)及其野生型(WT)纯合子(+/+)FVB近交系小鼠,实验动物150只分两组:(1)KO组(3、4、6、8、10周龄,每周龄15只,共75只;②WT组(3、4、6、8、10周龄,每周龄15,共75只,用于听性脑干反应(ABR)测试。数据及图像的采集:以ABR图形中Ⅱ波的阈值为小鼠的ABR阈值。结果 ABR阈值:3周及4周年龄组小鼠各基因型间KO小鼠的ABR阈值显著高于WT小鼠,差异有统计学意义(P<0.01);6、8、10周各组中各基因型小鼠的KO小鼠和WT小鼠的ABR阈值的差异无统计学意义(P>0.05)。结论幼年期FMR-1 KO小鼠听阈提高,成熟期FMR-1 KO小鼠听阈无异常,KO小鼠ABR的结果与AGS发生的年龄依赖性相一致。     

Aβ1-40通过激活MAPKs通路诱导血管平滑肌细胞发生炎症及表型转化

目的:探究β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)对血管平滑肌细胞(VSMCs)的炎症反应、活力、迁移能力及表型转化的影响,并分析其机制。方法:以不同浓度的Aβ1-40干预VSMCs适当时间。用CCK-8和Transwell实验评估细胞的活力及迁移能力;用Western blot检测细胞中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子水平,VSMCs表型转化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、骨桥蛋白(OPN)和Krüppel样因子4(KLF4)的表达,以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路相关蛋白p-p38 MAPK、p-ERK1/2和p-JNK的蛋白水平。结果:在Aβ1-40的作用下,VSMCs中炎症因子IL-1β和TNF-α水平显著升高,表型转化相关蛋白表达发生改变,α-SMA表达水平显著下降,而OPN和KLF4的表达水平显著升高(P<0.05);且在一定浓度范围内,Aβ1-40可提高VSMCs的活力和迁移能力;另外,Aβ1-40处理可显著增加VSMCs中p-p38 MAPK、p-ERK1/2和p-JNK的蛋白水平(P<0.05)。应用...     

Slc7a11通过E-cadherin/β-catenin信号通路诱导自噬促进乳腺癌细胞侵袭转移的作用机制研究

目的:探讨溶质载体家族7成员11(Solute carrier family7 member11,Slc7a11)对乳腺癌细胞侵袭转移的作用机制.方法:采用细胞划痕实验与Transwell实验检测Slc7a11对MDA-MB-231细胞迁移的影响,采用免疫印记(Western blotting,WB)检测Slc7a11对MDA-MB-231细胞黏附相关分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)与β-连环蛋白(β-catenin)表达及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3II和p62表达的影响.结果:与对照组比较,Slc7a11过表达组E-cadherin和β-catenin蛋白表达明显降低(P<0.05),细胞体外与迁移侵袭实验检测到,穿过Transwell小室的细胞数量明显升高(P<0.05).与对照组比较,干扰Slc7a11表达组E-cadherin和β-catenin蛋白表达明显升高,细胞体外与迁移侵袭实验检测到,穿过Transwell小室的细胞数量明显降低(P<0.05).过表达Slc7a11后,自噬相关基因包括Beclin-1和LC3II的表达明显上调,而p62表达明显降低(P<0.05).结论:Slc7a11能够调控细胞自噬促进乳腺癌细胞侵袭和转移,其主要机制可能与其下调细胞黏附分子E-cadherin/β-catenin复合体表达有关.     

Fmr1基因敲除小鼠耳蜗GAD的表达

目的对4周龄Fmr1基因敲除小鼠的耳蜗的GAD表达进行观察,探讨耳蜗GAD的表达是否受FMRP的影响。方法使用PCR技术对Fmr1基因敲除小鼠鉴定后对4周龄的Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠各15只进行耳蜗的苏木精-伊红(HE)染色和GAD免疫组织化学的表达观察,数据采用多因素方差分析处理。结果耳蜗HE染色结果:4周龄组KO鼠较WT鼠形态学观察无差异。4周龄KO小鼠的耳蜗中GAD表达的平均阳性细胞数均高于WT小鼠,P<0.01,差异具有统计学意义。结论 GAD表达的改变可能与FMR1基因KO小鼠听源性惊厥发病有关。     

CD226基因敲除加重小鼠放射性肝损伤的发生

目的观察CD226基因敲除(KO)对小鼠放射性肝损伤的影响。方法雄性野生型(WT)和CD226KO小鼠随机分为非辐照组和辐照组,非辐照组不经过任何处理,辐照组接受8 Gy ~(60)Co照射建立急性放射性损伤模型。观察小鼠存活和体质量改变情况, HE染色观察肝脏和结肠病变情况,实时定量PCR检测肝和结肠组织炎症因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素1β(IL-1β)、 IL-6、 IL-12p40、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的mRNA水平。结果与辐照WT小鼠相比,辐照后的CD226KO小鼠体质量明显下降,存活率下降; CD226KO小鼠肝脏损伤加重,肝指数(肝质量/体质量)下降显著, iNOS、 IL-1β、 IL-6、 IL-12p40、 TNF-α、 MCP-1 mRNA水平显著升高;但CD226KO小鼠结肠炎症减轻,炎症因子mRNA水平降低。结论 CD226缺失降低辐照小鼠存活率,与肝损伤加重密切相关。     

OX-LDL诱导内皮细胞条件培养液对内皮细胞VCAM-1和 ICAM-1的影响

目的探讨受损内皮细胞的自分泌和旁分泌对内皮细胞自身的影响。方法利用正常内皮细胞条件培养液和用氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导内皮细胞的条件培养液分别作用于正常内皮细胞和受损内皮细胞,用酶联免疫细胞化学法检测血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的变化。结果正常内皮细胞的条件培养液和OX-LDL诱导的内皮细胞条件培养液对正常内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的表达作用不明显(P>0.05),而对受损内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的表达具有明显的下调作用(P<0.01)。结论正常和受到氧化损伤的内皮细胞的自分泌和旁分泌作用对正常内皮细胞黏附分子没有影响,而对受损内皮细胞黏附分子有下调作用,说明内皮细胞可通过下调黏附分子的表达来实现自身的抗损伤作用。     

整合素β1对人体滋养层细胞黏附和迁移行为的影响

在体内,滋养层细胞是通过何种方式到达子宫螺旋动脉血管并对其基础结构进行重构的机制目前尚不清楚,但这一过程涉及到了细胞在血管内黏附和迁移的行为。采用微管吸吮技术和平行平板流动腔系统对整合素β1在滋养层细胞黏附和迁移中的作用进行检测。将滋养层细胞分别培养在I型鼠尾胶原和血管内皮细胞上,进行细胞黏附力测量和剪切应力加载,实验分为整合素β1抗体阻断组、非特异性抗体阻断组和正常对照组。结果显示:整合素β1抗体阻断组可显著降低细胞的黏附力和抵抗流体剪切应力引起位移的能力,而非特异性抗体组的结果与对照组差异不显著;内皮细胞可显著增强滋养层细胞的黏附力和抵抗流体剪切应力引起位移的能力。结果表明,整合素β1参与了滋养层细胞与血管内皮细胞间的黏附并调控了流体剪切应力作用下滋养层细胞的迁移行为。     

烟碱型乙酰胆碱受体α7在Fmr1基因敲除小鼠中的表达及意义

目的观察烟碱型乙酰胆碱受体α7在Fmr1基因敲除小鼠前额皮层及海马的表达,探讨其在Fmr1基因敲除小鼠学习记忆中的作用。方法将4周龄FVB小鼠分为WT组和KO组,用跳台实验分别检测KO及WT小鼠学习记忆的能力,利用Western blotting和免疫组化方法检测KO及WT小鼠前额皮层及海马α7 nAChR的表达。结果跳台实验结果显示,与WT空白组比较,KO空白组第一天及第二天的潜伏期均显著缩短,错误次数明显增多,差异均具有统计学意义(P0.05);免疫组化结果显示,与WT空白组相比,KO空白组前额皮层和海马区α7 nAChR免疫阳性细胞数均显著减少(P0.05);Western Blotting结果显示,KO空白组前额皮层及海马区α7 nAChR表达量均较WT空白组减少,海马区更为显著,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论 Fmr1基因敲除小鼠前额皮层、海马区的α7 nAChR表达量较野生型小鼠减少,提示α7 nAChR参与了Fmr1基因敲除小鼠学习记忆障碍的发病机制。     

共转录因子CITED1在小鼠骨代谢中的调控作用

目的在体研究CITED1在骨代谢即成骨/破骨平衡中的调节作用,为骨质疏松的治疗提供相应的理论基础。方法利用野生型小鼠(WT小鼠)和构建的CITED1基因敲除小鼠(KO小鼠),显微电子计算机断层扫描(CT)定量测量WT小鼠和KO小鼠股骨长度、骨量和骨皮质以及骨松质厚度等骨骼表型。用ELISA检测骨代谢的血液学相关指标。用RT-qPCR检测骨标志基因的表达,从分子水平探究骨代谢改变的原因。结果 KO小鼠颅骨成骨细胞中CITED1表达极少,表明敲除成功。KO小鼠股骨长度、骨量和骨皮质以及骨松质厚度显著高于WT小鼠。KO小鼠外周血血清中I型原胶原肽(P1NP)、骨钙素(OC)和骨碱性磷酸酶(BALP)浓度均显著高于WT小鼠,而抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的浓度显著低于WT小鼠。RT-qPCR结果显示,KO小鼠颅骨成骨细胞中OC和BALP基因表达较WT小鼠显著增加(P<0. 001);同时,KO小鼠颅骨成骨细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的表达较WT小鼠显著降低(P<0. 05)。结论小鼠CITED1敲除后可以通过上调OC和BALP基因表达,下调TRAP基因的表达,促进骨形成,抑制骨吸收。     

1-磷酸鞘氨醇在高糖诱导血管内皮细胞功能损伤中的作用

 目的: 探讨1-磷酸鞘氨醇(S1P)在高糖诱导血管内皮细胞功能损伤中的作用及其机制。方法: 在高糖培养的人主动脉内皮细胞模型中,分别或同时给予S1P、鞘氨醇激酶1抑制剂和Akt抑制剂处理后,观察一氧化氮(NO)、粒细胞-内皮细胞黏附率、细胞间黏附分子1(ICAM-1)蛋白表达、内皮细胞迁移以及Akt/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号途径的改变。结果: S1P明显降低高糖诱导的内皮细胞培养上清液中NO含量,促进粒细胞与内皮细胞黏附,显著增加内皮细胞ICAM-1蛋白表达,抑制内皮细胞迁移和Akt/eNOS信号通路激活。鞘氨醇激酶1抑制剂减少S1P生成后上述内皮细胞功能指标得以明显改善,Akt/eNOS信号通路恢复激活。结论: S1P促进高糖培养的内皮细胞功能障碍的形成,可能与其抑制Akt/eNOS信号通路激活有关。抑制S1P生成有望成为减轻内皮细胞功能损伤的治疗策略之一。