人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

新疆出血热病毒重组核蛋白及糖蛋白片段能诱导小鼠免疫应答

目的研究重组表达的新疆出血热病毒(XHFV)核蛋白和糖蛋白截短片段在刺激机体免疫应答中的作用。方法采用基因重组技术和亲和层析技术对XHFV截短的核蛋白(NP2)、糖蛋白片段(Gc和Gn)进行表达和纯化,并通过蛋白免疫及核酸初次免疫、蛋白加强免疫的方式免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测鼠血清抗体效价,采用T淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫应答的效果,对上述表达产物刺激小鼠免疫应答的作用进行初步评价。结果利用原核表达系统成功表达纯化出XHFV核蛋白和糖蛋白截短片段。重组蛋白免疫BALB/c小鼠后能刺激机体产生Ig G(效价为1∶12 800以上),并能与相应的抗XHFV核蛋白及糖蛋白的多克隆抗体发生特异性反应。各组均能有效地激发较强的细胞免疫应答,其中p VAX1-Gc联合r Gc实验组小鼠脾脏淋巴细胞增殖明显,与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.01)。结论获得的重组XHFV核蛋白、糖蛋白片段能有效刺激小鼠的体液和细胞免疫应答。     

Autotaxin多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Autotaxin(58-157位氨基酸)融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotax-in的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58-157)-His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。     

SFTSV重组假病毒的构建及Gc糖基化对病毒感染力的影响

目的为探究发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)中Gc及其N-糖基化位点与病毒感染性的关系, 构建了含有SFTSV Gc糖基化位点突变体的重组假病毒。方法利用定点突变和同源重组技术构建了SFTSV Gc及3个N-糖基化位点突变的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gc、pcDNA3.1(+)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(+)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(+)-Gc(N374Q)。验证其在293T细胞中成功表达后, 感染VSVΔG-Fluc*G假病毒, 构建4株重组假病毒并检测其对细胞感染力的影响。结果双酶切鉴定和序列测定证实成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gc、pcDNA3.1(+)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(+)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(+)-Gc(N374Q)。间接免疫荧光和Western blot结果表明4个重组质粒均成功表达。SFTSV Gc重组假病毒对Vero细胞有感染特异性。糖基化位点突变后假病毒感染能力明显降低, 且352位糖基化位点突变株感染水平最低(P<0.001、P=0.001)。结论 SFTSV G...     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

肠道病毒71 VP1基因的原核表达及其抗血清的制备

目的克隆并表达重组肠道病毒71(EV71)VP1基因,进行抗血清的制备并检测抗血清效价。方法利用原核表达系统将PCR获得的VP1片段构建成原核表达载体pET32a(+)-VP1,诱导其表达VP1融合蛋白并利用包涵体纯化方法进行重组蛋白的纯化,将纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备VP1抗血清,ELISA检测抗体效价。同时构建真核表达载体,利用其在真核细胞中的瞬时表达检测抗血清的特异性。结果通过克隆获得VP1原核表达载体,IPTG诱导VP1蛋白表达并纯化,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达且纯化浓度较高,将重组蛋白乳化后免疫新西兰兔3次,取血检测抗血清的效价,ELISA结果显示抗体效价为1∶64 000,利用所构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP1表达VP1对抗血清进行检测,Western blot结果表明抗血清可较好的与VP1特异性结合。结论制备具有免疫原性的VP1蛋白及其效价较高的抗血清,为进一步研究抗EV71诊断方法、血清学诊断试剂盒及抗病毒疫苗的研制奠定基础。     

人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达

目的: 制备人核迁移蛋白(hNudC )的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性.方法: 从人胎肝组织中克隆得到 hNudC 基因, 构建重组表达质粒 pET-28b/hNudC, 表达带有6-His标记的重组hNudC, 用纯化的重组 hNudC 蛋白免疫 BALB/c小鼠制备mAb, 用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆, 用免疫荧光染色法及Western blot 试验鉴定 mAb 的特异性.结果: 获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8, 其分泌的mAb的 Ig亚类(型)分别为IgG1 和IgM(ê) , 杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶ 64和1∶ 32; 腹水mAb的效价分别为1∶ 1×105和1∶ 5×104.mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应, 免疫荧光染色和Western blot试验证明, 制备的 mAb 可以识别人巨核系白血病细胞株 Dami、 Meg-01和人脐带血来源的CD41 巨核细胞中表达的 hNudC 蛋白.结论: 成功地制备了特异性抗 hNudC mAb, 为研究 hNudC 蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础.     

人前蛋白转化酶枯草溶菌素9的cDNA克隆和表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的原核表达载体并诱导其表达,制备其蛋白的多克隆抗体.方法 聚合酶链式反应扩增人工合成的pcsk9 cDNA序列;扩增产物经TA克隆、双酶切、连接,构建pET-28b-pcsk9表达载体;将重组质粒转化人大肠杆菌表达菌BL21(DE3)的感受态细胞中,诱导表达;用纯化检测过的目的蛋白免疫新西兰兔,最后采集全血收集血清,获得多克隆抗体,并对该抗体进行免疫印迹及效价测定.结果 PET-28b-pcsk9原核表达载体构建成功,用诱导表达的目的蛋白免疫动物,收集血清获得多克隆抗体.对多克隆抗体进行纯化,免疫印迹检测结果证明自制多克隆抗体特异性良好,效价测定为1∶13 200.结论 成功构建了pcsk9原核表达载体pET-28b-pcsk9,且获得了其蛋白的多克隆抗体.     

兔抗重组人钙网蛋白抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备兔抗人钙网蛋白抗体并进行特性鉴定。方法:用PCR法扩增人钙网蛋白(CRT)基因,并克隆至pET32a表达载体中。以重组质粒pET32a/hCRT转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化目的蛋白。以纯化的hCRT为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗体,用ELISA法、Westernblot和免疫组化染色法检测抗体的效价和特异性。结果:成功地表达并纯化hCRT重组蛋白。以纯化的重组hCRT免疫新西兰大白兔制备的抗体,ELISA检测其效价为1∶51 200,Western blot分析显示,该抗体能与hCRT特异性结合。免疫组化染色法检测结果表明,该抗体能识别天然的hCRT。结论:以重组hCRT为免疫原,成功地制备效价高、特异性好的兔抗hCRT抗体,为进一步进行钙网蛋白的检测及其临床应用研究奠定了基础。     

重组天花粉蛋白的原核表达纯化和免疫原性分析

目的构建携带天花粉蛋白基因的高效表达载体,对比原核表达的重组天花粉蛋白和天然蛋白的免疫原性.方法通过RT-PCR技术扩增无N端和C端序列的TCS基因,测序鉴定后克隆入表达载体pET-29b中,IPTG诱导表达.用金属螯合层析法纯化重组蛋白.薄层扫描及Bradford法检测纯化后重组蛋白的纯度和含量.间接ELISA法检测重组蛋白和天然蛋白产生的多克隆抗体效价.Western blotting检测重组蛋白与抗天然蛋白抗体之间的免疫反应性.结果 1.双酶切鉴定结果表明,pET-29b-TCS成功构建;2.30℃,1 mmol/L的IPTG诱导4 h,重组蛋白的表达量最高（占细菌总蛋白量的36%）,主要以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中;3.His-tag特异性结合树脂纯化后,获得了纯度达95%的重组蛋白,纯化后的蛋白含量为1.2 g/L;4.间接ELISA法检测天然蛋白和重组蛋白产生的抗体效价分别为1：4 960和1：5 120;5.Western blotting测纯化的重组蛋白与抗天然蛋白的多克隆抗体之间有特异反应性.结论本实验成功构建了高效表达载体pET-29b-TCS,携带的天花粉蛋白基因无N端和C端编码序列.重组蛋白的抗体效价显著低于天然蛋白,表明天然蛋白的糖基化与其免疫原性之间有一定的关系.     

Generation and application of monoclonal antibodies against Rift Valley fever virus nucleocapsid protein NP and glycoproteins Gn and Gc

Rift Valley fever virus (RVFV) is a vector-borne virus that causes high neonatal mortality in livestock and deadly haemorrhagic fever in humans. In this paper, we describe the generation of monoclonal antibodies (mabs) against all three structural proteins of RVFV (glycoproteins Gn and Gc and nucleocapsid protein NP). After immunization of BALB/c mice with individual recombinant proteins, a total of 45 clones secreting ELISA-reactive monoclonal antibodies against NP, Gn and Gc epitopes were obtained. Twelve clones were directed to NP, 28 to Gn, and 5 to Gc. Western blot analysis revealed that most of the mabs were reactive to linearized epitopes on recombinant as well as native virus proteins. Six mabs against NP, 21 against Gn and all mabs against Gc also detected conformational epitopes, as shown by indirect immunofluorescence on RVFV-infected cells. All of the mabs were evaluated for their use in a competition enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of a RVFV infection. Several mabs were identified that competed with polyclonal rabbit serum, and one of them – mab Gn123, raised against Gn protein – was selected for a proof-of-principle study with field sera from a recent Rift Valley fever outbreak. The novel Gn-based competition ELISA demonstrated high performance, offering a promising alternative and addition to serological assays based on nucleocapsid protein.     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。     

结核分枝杆菌调节蛋白RelA的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码结核分枝杆菌调节基因RelA并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗RelA的抗体。方法:利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增RelA基因,构建重组表达质粒pET-32a(+)-RelA;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Westem blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性;以表达的RelA蛋白免疫家兔,制备抗RelA的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了RelA基因,克隆于表达载体pET-32a(+)中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为120 000的目的蛋白;纯化的RelA免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶6 400以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建RelA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗RelA抗体,效价及特异性均良好,为进一步研究RelA蛋白在结核病中的致病机制奠定了基础。     

Characterization of B virus glycoprotein antibodies induced by DNA immunization

Genes encoding glycoproteins gB, gC, gD, gE, and gG of herpes B virus (species Cercopithecine herpesvirus 1) were cloned into mammalian expression vector pcDNA3.1/V5-His. Abilities of the plasmid constructs to express recombinant glycoproteins were confirmed by Western blot analysis of transfected CHO-K1 and COS-7 cells. Antibody production was induced in rabbits by intramuscular injections with the expression constructs at four-weekly intervals. Antibodies to gB were detected after the second DNA inoculation, while it took an additional plasmid injection to induce responses to gC, gD and gE. The gG plasmid failed to stimulate antibody production. Antisera ELISA titers varied greatly depending on the gene, with gB inducing highest (21,000) and gE inducing lowest (60) antibody titer. The induced antibodies were predominantly conformation-dependent. The gB, gC, and gD antisera contained HSV cross-neutralizing antibodies, but only gB antisera contained B virus neutralizing antibodies. The gB antisera cross-reacted with HSV antigens in Western blot, ELISA, dot-blot, plaque immunostaining and immunoprecipitation assays, whereas gD and gC antisera were mostly B virus-specific. Thus, polyclonal antibodies to B virus glycoproteins can be generated by DNA immunization and used as diagnostic and research reagents.     

人胱抑素C基因的克隆和原核表达

目的：研究人胱抑素c（Cycstatin C,cysC）的原核重组表达及纯化。方法：通过RT-PCR扩增得到人CysC的cDNA序列,并将其构建到pET-32a（＋）的表达载体中。通过转化人BL21（DE3）表达宿主茵及表达条件的优化,摸索其最佳表达条件。通过镍柱纯化以及DEAE—sepharoseFF离子交换层析的方法纯化得到重组的人cysC蛋白。结果：通过RT-PCR扩增的方法得到的cDNA序列通过测序证明与预期一致。通过优化表达,CysC的表达水平达到了160mg／L,约占总可溶蛋白的20％,表达产物通过两步纯化后获得了纯度为95％的重组Cys C。结论：成功构建cy8C原核表达系统和蛋白纯化系统,为下一步制备多克隆抗体以及开发Cysc的免疫诊断试剂奠定了基础。     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定

目的 克隆沉默信息调节因子1（SIRTl）基因的全长cDNA,构建含有SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的重组真核表达载体,为进一步研究SIRT1基因功能奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,扩增产物通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到pcDNA3.1 （＋）-SIRT1重组质粒;同时采用定点突变法构建其突变体pcDNA3.1 （＋）-T200I和pcDNA3.1（＋）-E420K表达载体.重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组成功的真核表达载体.结果 成功克隆了SIRT1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1 （＋）-SIRT1及其突变体的真核表达载体;阳性重组质粒酶切后经测序比对鉴定,与预期序列完全相符,转染293T细胞后可以表达带有HIS标签的SIRT1蛋白.结论 此方法可成功构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-SIRT1及其突变体pcDNA3.1（＋）-T200I、pcDNA3.1（＋）-E420K真核表达载体,为SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的生物学功能研究提供了基因材料.     

人PRMT1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人PRMT1基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法:采用RT-PCR技术扩增人PRMT1全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pcDNA3.1(+)-PRMT1真核表达载体,并转化DH5α感受态细胞;用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆;经菌液PCR及测序鉴定重组质粒;瞬时转染A549细胞,采用实时定量PCR检测重组质粒的表达水平及PRMT1对eotaxin-1和ccr-3表达的影响。通过Western blot从蛋白水平检测重组质粒在真核细胞内的表达。结果:RT-PCR扩增的人PRMT1全长cDNA为1136 bp;所筛选出的pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体中插入片段与NCBI GenBank文库中人PRMT1 cDNA的序列完全一致;实时定量PCR和Western blot检测证实重组质粒在A549细胞内可高效表达;并且PRMT1与eotaxin-1和ccr-3的表达呈正相关性。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体,为进一步研究PRMT1基因的作用机制奠定基础。     

两株登革2型病毒NS1基因真核重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较

目的 利用登革2型病毒(dengue type 2 virus,DENV2)M株和NGC株NS1基因部分扇列PcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 分别构建两株DENV2 NS1基因部分序列(1-413 bp)的PcDNA3.1真核重组质粒和pET28a(+)质粒,进行原核蛋白的表达、鉴定、纯化和定量;并用pcDNA3.1重组质粒免疫BALB/c小鼠,初次免疫及第7天、14天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第7、14、28和56天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血清特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异保护性抗体水平.结果 构建了pET28a(+)-NS1m/pET28a(+)-NS1n原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,NS1基因部分序列获得表达,其相对分子质量均约22.3×103;Western blot表明该目的 蛋白可与抗His标签单克隆抗体结合;经Ni柱亲和层析法得到纯度达92%的表达蛋白,对C6/36细胞有毒性,并可用于ELASA检测.不同DENV2毒株NS1基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类和中和抗体的产生存在差异,M株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DENV2两毒株NS1基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.

Abstract：

Objective To compare the humoral immune response of BALB/c mice immunized by recombinant plasmids PeDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1.Methods Dengue type 2 virus(DENV2)NS1 gene were constructed two partial sequences(1-413 bp)of the pcDNA3.1 eukaryotic plasmids and pET28a(+)plasmid for prokaryotic expression,identification,purification and quantification.The BALB/c mice were immunized by pcDNA3.1-M-NS1,pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmids with adjuvant.Each animal received a primary inoculation and two boosts at 1-week intervals.Then the blood samples of BALB/c mice were collected from different experiment groups at day 7,14,28 and 56,respectively after first immunization.The specific IgM/IgG antibodies for NS1 protein in serum were confirmed by indirect ELISA.And then the activities of the specific protective antibody were determined by cytopathic effect inhibition(CPEI).Results Construction of the pET28a(+)-NS1 m/pET28a(+)-NS1n prokaryotic expression plasmid,SDS-PAGE analysis showed that,NS1 gene partial sequence was expressed,both the relative molecular weight of about 22.3×103:Western blot showed that the protein can bind anti-His tag monoclonal antibody;byNi affinity chromatographywith apurity of 92% protein,on the C6/36 cell toxicity,and can be used ELASA detection.The results showed that the levels of specific IgM/IgG antibody and neutralizing antibody activities were increased in pcDNA3.1-M-NS1 booster immunization group than other groups.The result had been observed longer duration of antibody level in peDNA3.1-M-NS1 booster immunization group.Conclusion Humoral immune response were significantly different between pcDNA3.1-M-NS1 and pcDNA3.1-N-NS1 recombinant plasmid immunized mice groups.