中国莱姆病螺旋体PD91外膜蛋白A的克隆表达及免疫保护性的初步研究

目的：克隆并表达中国莱姆病螺旋体Borrelia garinii基因型代表菌株PD91的外膜蛋白A(OspA)，并对其免疫保护性进行 初步研究，为进一步研制莱姆病疫苗提供基础。方法：用聚合酶链反应（PCR）从莱姆病螺旋体PD91全基因组DNA中将OspA基因调出，插入原核表达载体P42，在大肠杆菌BI21(DE3)中表达，表达产物用SDS-PAGE、Western blot分析，并进行基因序列测定。用重组OspA（rOspA）免疫新西兰家兔，用间接免疫荧光（IFA）检测其血清特异性抗体（IgG），并进行体外中和试验，从而对其免疫保护性有初步的了解。结果：rOspA在宿主菌内表达高效、稳定；Western blot 显示其与抗OspA的多抗有较好的免疫反应性；用rOspA免疫新西兰家兔后，其血清抗体（IgG）效价显著升高（32倍），体外中和试验表明，每毫升兔抗rOspA血清可杀来源10^5个莱姆病螺旋体。结论：在国内首次成功地对中国莱妈病螺旋体Borrelia garinii基因型的OspA基因进行了克隆和表达。ROspA有较好的免疫保护性，可作为多价莱姆病疫苗的一种成分。     

中国莱姆病螺旋体FP1外膜蛋白A的克隆表达及其抗原性的初步研究

目的　克隆并表达中国莱姆病螺旋体阿弗西尼疏螺旋体基因种参照菌株FP1的外膜蛋白A(OspA) ,并对其抗原性进行初步研究和基因序列分析 ,为研制中国莱姆病疫苗提供资料。方法设计引物 ,用聚合酶链反应 (PCR)从莱姆病螺旋体FP1全基因组DNA中扩增出OspA编码基因 ,经酶切、连接 ,插入原核表达载体pET 11d ,构成重组质粒pET 11d ospA ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,表达产物用SDS PAGE、Westernblot分析 ,并进行基因序列测定。结果　rOspA在宿主菌内获得高效、稳定表达 ;相对分子质量 (Mr)约为 31× 10 3,Westernblot显示其与抗OspA的多抗有良好的免疫反应性 ;经测序显示该rOspA的基因片段长度为 783bp ,编码 2 6 1个氨基酸 ,与欧洲标准菌株Pko和瑞士标准菌株VS4 6 1的OspA的DNA碱基序列比较 ,同源性均为 94 %。结论　在国内首次成功地对中国莱姆病螺旋体阿弗西尼疏旋体基因种的代表菌株FP1的OspA基因进行了克隆和表达。并且证实rOspA有良好的抗原性 ,可进一步对其免疫保护性进行研究 ,以便为研制有效的莱姆病疫苗提供数据。     

中国莱姆病螺旋体鞭毛蛋白中央区的基因克隆和表达

目的　对中国莱姆病螺旋体Borreliagarinii基因种参照菌株PD91的鞭毛蛋白中央区的编码基因进行克隆表达 ,对重组鞭毛蛋白作为莱姆病血清学诊断抗原进行初步的研究 ,并进行基因序列和氨基酸序列分析。方法　设计引物 ,用PCR技术获得PD91的鞭毛蛋白中央区的编码基因片段 ,经酶切、连接 ,插入质粒pET 30a中 ,构成重组质粒pET30a mfla,转化到大肠杆菌BL2 1,提取质粒进行酶切、DNA测序和氨基酸序列分析鉴定 ,诱导表达 ,筛选高效表达株 ,应用SDS PAGE和Westernblot鉴定重组蛋白及其抗原性。结果　成功地获得了鞭毛蛋白中央区的编码基因片段和基因重组 ,重组蛋白在宿主菌BL2 1中高效表达。Westernblot结果显示重组鞭毛蛋白的中央区与PD91的鞭毛蛋白具有相同的抗原性。经测序显示该中央区基因片段为鞭毛蛋白基因的 4 0 9～ 786bp ,与北美莱姆病螺旋体标准株B31的DNA碱基序列比较分析 ,同源性 92 %。结论　成功地对中国莱姆病螺旋体Borreliagarinii基因种的鞭毛蛋白中央区进行了克隆表达 ,并证实具有抗原性 ,为我国莱姆病血清学诊断研究提供资料。     

中国莱姆病伽氏疏螺旋体蛋白免疫印迹法诊断标准的研究

目的研究中国莱姆病伽氏疏螺旋体基因型蛋白免疫印迹法（WB）的阳性诊断标准。方法采用中国莱姆病螺旋体伽氏疏螺旋体基因型参照菌株PD91作抗原，建立WB检测方法。采用Gel—Pro凝胶分析软件进行结果分析。病例组和对照组各组蛋白条带的频数分布比较采用x^2检验或Fisher’s精确检验，WB检测莱姆病阳性诊断标准确定采用ROC曲线。结果共检测127例莱姆病病例和504例对照的血清标本，经统计学分析得出我国莱姆病伽氏疏螺旋体检测中WB阳性诊断标准为：对于IgG P83／100、P58、P39、P30、OspC、P17、P66、OspA中至少有一条蛋白条带显色即可诊断为阳性，此标准敏感度为73．2％，特异度为99．4％；对于IgM P83／100、P58、OspA、P30、OspC、P17、P41中至少有一条蛋白条带显色则可诊断为阳性，此标准敏感度为50．4％，特异度为93．1％。结论建立了中国莱姆病伽氏疏螺旋体基因型WB阳性诊断标准，用于莱姆病的WB诊断具有较好的特异性。     

离体免疫制备莱姆病螺旋体单克隆抗体的初步研究

制备单克隆抗体采用离体免疫时间短、抗原用量少 ,并有不受有毒有害物质限制、诱发抗体生成所需时间短等优点。目前 ,未见有鼠 -鼠离体免疫制备单克隆抗体的详细报道。本文试图探索离体免疫制备抗莱姆病螺旋体的单克隆抗体。材料和方法抗原 :从全沟硬蜱自行分离培养伯氏疏螺旋体株Ｈ 0 1,菌体经超声破碎后离心 ,取上清。实验动物 :ＢＡＬＢ ｃ、Ｃ5 7 ＢＬ小鼠 ,购于中华预防医学科学院流行病学微生物学研究所动物室。试剂 :ＲＰＭＩ 16 40 (ＧＩＢＣＯＢＲＬ)、β 巯基乙醇 (2 ＭＥ)、胞壁酰二肽 ＭＤＰ (Ｓｉｇｍａ)。离体免疫基础培养…     

空肠弯曲菌粘附蛋白PEB1的克隆表达及免疫保护性初步探索

空肠弯曲菌 (Campylobacterjejuni,Cj)已成为近年引起腹泻最常见病原 ,而其某些菌株更被证实是诱发格林 巴利综合征 (GBS)的最主要前驱感染因子。Cj的可溶性蛋白 (PEB1)是该菌侵袭肠道的重要致病因子 ,其抗原性在各个菌株间相对保守〔1〕,使它可望成为Cj疫苗候选抗原成分。材料和方法菌株和质粒 :空肠弯曲菌 5个血清型共 7个菌株 ,包括血清型PennerO∶2 ,PennerO∶19各 2株 ,每种血清型包含标准株和自GBS患者分离菌株各 1株。其它为血清型PennerO∶4、O∶8和O∶2 1各 1株。转化菌JM10 9、宿主菌BL2 1(DE3)及表达质粒pET32a(+ )…     

铜绿假单胞菌外膜蛋白的免疫原性及免疫保护性

铜绿假单胞菌亦称绿脓杆菌,是一种最常见的条件致病菌。铜绿假单胞菌感染占院内感染的15 %以上,并还有上升趋势,这与铜绿假单胞菌对抗生素耐药率增高有关〔1〕。在国内外烧伤中心对革兰阴性细菌感染的临床调查表明,铜绿假单胞菌感染占首位(约5 0 %) 〔2〕。为此,人们一直在寻找有效的防治对策。既往研究的菌体疫苗缺点较多,如不同血清型保护率及保护时间不甚理想等。因此,发展高免疫保护性、低不良反应的亚单位疫苗非常必要。制备亚单位疫苗的关键在于找出与保护性免疫相关的抗原。细胞膜中的一种重要成分———外膜蛋白,在免疫方面的作用越…     

贝氏柯克斯体30kD外膜蛋白基因表达及免疫保护性的研究

贝氏柯克斯体可引起人类急、慢性Q热。急性Q热临床表现多种多样,主要症状为发热、头痛和肌肉酸痛,并常伴有肺炎、肝炎等。慢性Q热常发展为Q热性心内膜炎、骨髓炎。Q热疫苗是预防Q热流行的最有效手段,目前人用Q热疫苗是灭活的柯克斯体。虽然灭活疫苗的免疫保护效果很好,但注射该疫苗接种部位常出现不良反应。研究发现,在贝氏柯克斯体的Ⅰ相和Ⅱ相中含有相对分子质量(Mr)为30×10 3 的外膜蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性〔1〕。我们采用分子生物学技术,研制出贝氏柯克斯体Mr30×10 3 重组外膜蛋白,用重组蛋白免疫小鼠,对其免…     

梅毒螺旋体Tp0136活性肽段的可溶性表达、纯化及鉴定

目的 筛选梅毒螺旋体特异性抗原Tp0136的活性肽段,可溶性表达和纯化该肽段,并鉴定其免疫活性,探索Tp0136活性肽段在早期梅毒诊断中的价值.方法 通过生物信息学方法对Tp0136亲水性、B细胞表位和二级结构等进行分析,筛选出Tp0136活性肽段(Tp0136B)替代全蛋白.将Tp0136B基因插入到pET22b(+)上,在E.coli BL21中表达.镍离子亲和色谱纯化表达产物,Western blot检测其免疫反应性,免疫日本大耳白兔评价其免疫原性,免疫双扩检测其效价,以重组Tp0136B蛋白为包被抗原的间接ELISA检测早期梅毒血清抗体.结果 重组工程菌可溶性表达相对分子质量约为28×103的rTp0136B,表达率为21%,制备得到纯度大于98%的rTp0136B.纯化的rTp0136B能诱导大耳白兔产生特异性免疫应答,免疫双扩测得其效价为1:16.Western blot检测重组蛋白能与兔抗Tp0136多克隆抗体发生特异性反应.间接ELISA检测正常人血清均为阴性,而早期梅毒血清抗体的阳性率为85.5%.结论 重组表达的Tp0136活性肽段具有良好的免疫活性,预示其在早期梅毒血清学诊断中具有良好的前景.

Abstract：

Objective To express and purify recombinant Tp0136 epitope fragment, and study the immunity activity. Methods The Tp0136 selective fragment(Tp0136B) gene was devised by the surface property analysis, solvent-accessible suface calculateions, secondary structure function region analysis, and was inserted between the sites of Nde Ⅰ and Not Ⅰ in pET22b ( + ) . The recombinant plasmid was expressed in E. coli BI21. After nickel ion metal affinity chromatography, the antigenic and immune reactivity of rTp0136B was confirmed. Then indirect ELISA with the rTp0136B as coating antigen was performed to detect the anti-Tp0136 antibody in sera from 100 normal human controls and 131 primary syphilis patients. Results The rTp0136B was soluble expressed with a molecular weight of about 28 000 and was obtained with a purity of ＞98% by chromatography. Western blot proved that the rTp0136B could specifically react with anti-Tp0136 polyclonal antibody. Specific humoral response was elicited by the recombinant protein in Japan negative. The positive detection rate in sera from primary syphilis patients was 85.5%. Conclusion This result suggested that the recombinant Tp0136 epitope fragments have a satisfactory immunocompetence,which may have applications in the serodiagnosis of primary syphilis.     

巨噬细胞移动抑制因子基因的克隆和原核表达

目的：扩增、克隆人巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因，并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组MIF蛋白。方法：根据人MIF基因序列，设计、合成PCR引物，利用RT-PCR技术从人T淋巴细胞mRNA中扩增MIF基因。将MIF定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，并将构建正确的重组表达载体pGEX-4T-MIF转化工程菌BL21(DE3)，用异丙基硫代-β-D-半乳糖（IPTG）诱导表达重组MIF蛋白。用GSTrap亲合柱纯化表达产物GST-MIF，行柱上凝血酶消化，洗脱获得MIF蛋白。用巨噬细胞移动抑制试验（MMI）鉴定MIF蛋白的生物活性。结果：限制性内切酶分析和DNA测序结果表明，成功构建了重组质粒pGEX-4T-MIF，人MIF cDNA长348 bp，编码115个氨基酸。经IPTG诱导，高效表达出可溶的GST-MIF蛋白。SDS-PAGE 和 Western blotting分析显示，GST-MIF经凝血酶消化，获得13 kU的MIF蛋白。MIF蛋白对巨噬细胞移动的抑制率达30%，具有生物活性。结论：克隆、测定了人MIF基因，在大肠杆菌表达出具有生物活性的MIF蛋白。     

TRBP分子克隆及其功能初步研究

目的:构建TRBP原核表达载体,评价表达的重组TRBP蛋白对双链RNA的结合能力。方法:利用RT-PCR扩增小鼠TRBP基因双链RNA结合区,构建其与His标签融合的表达载体,转化E.coli BL21(DE3)菌株,利用Ni-NTA磁珠对重组蛋白进行分离纯化;体外转录合成小鼠肝脏miR-122前体RNA Pre-miR-122,分别利用PAGE电泳和等温量热滴定仪检测TRBP与Pre-miR-122的结合能力。结果:分离纯化得到的重组TRBP蛋白为可溶蛋白,Mr为32 400,结合在NI-NTA磁珠上的TRBP能有效的结合Pre-miR-122。结论:成功建立了TRBP原核表达系统,初步研究了TRBP重组蛋白与双链RNA的结合能力。     

Analysis of Borrelia burgdorferi IgG antibodies with a combination of IgG ELISA and VlsE C6 peptide ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) were used to detect antibodies to the C6 peptide of the Borrelia burgdorferi VlsE protein and a selection of B. burgdorferi IgG antigens, separately and as a combination, in 355 serum specimens from blood donors and patients. Western immunoblotting was used as the reference method. The sensitivity of the combined analysis of IgG antigen and C6 peptide analysis was markedly superior to those of the separate analyses. When the C6 peptide and IgG results were concordant, the customary confirmatory Western immunoblotting assay could be omitted, thus reducing the time and cost of analysis.     

hTRT催化功能区基因克隆及其在肿瘤中的表达

目的 研究端粒酶蛋白ｈＴＲＴ基因在肿瘤中的表达及其意义。方法 用ＲＴ－ＰＣＲ法检查Ｈｅｌａ细胞与ＰＧ细胞的ｈＴＲＴ表达水平,将Ｈｅｌａ细胞的ｈＴＲＴ催化功能克隆,并进行测序比较,应用原位杂交技术对肿瘤组织中的ｈＴＲＴ和ｈＴＲ（端粒酶ＲＮＡ组分）基因进行检测。结果 Ｈｅｌａ细胞与ＰＧ细胞均有ｈＴＲＴ表达,Ｈｅｌａ细胞ｈＴＲＴ催化功能区ｃＤＮＡ序列与文献报道一致,原位杂交结果显示ｈＴＲＴ与ｈＴＲ的协同     

IFITM2的克隆表达及其抗病毒作用初探

目的:构建含有ifitm2基因的重组质粒,在人胚肾HEK293T细胞中表达,并验证IFITM2蛋白的抗病毒作用.方法:参照Genbank ifitm2基因序列,设计上下游引物,通过RT-PCR技术扩增ifitm2基因,并将扩增产物连接至pMD18-T-simple载体上,目的基因测序正确后进一步亚克隆至真核表达载体pVAX1上,转染HEK293T细胞,通过RT-PCR,蛋白免疫印迹(Western blot)和激光共聚集显微镜(LCSM)验证外源基因在细胞内的表达情况.同时HEK293T细胞过表达IFITM2蛋白,利用含有EGFP基因的VSV-G假膜病毒感染细胞,通过Western blot检测IFITM2蛋白对病毒的抑制作用.结果:成功获得ifitm2基因,测序正确,将其连接到pVAX1载体中,经酶切鉴定,证明含有ifitm2基因的重组质粒构建成功,Western blot和LCSM分析表明,目的基因能够在HEK293T细胞中表达,且呈广泛分布.过表达IFITM2蛋白后,荧光蛋白分析表明,该蛋白对病毒感染具有一定的抑制作用.结论:成功构建了含有ifitm2基因的重组真核表达质粒,该质粒可以在真核细胞中得到有效表达,且对VSV-G假膜病毒具有一定抑制作用,该研究为进一步探讨IFITM2蛋白的抗病毒作用及其分子机制提供了实验及理论基础.     

汉坦病毒84Fli株S和M片段基因克隆、序列分析及在真核细胞中表达的研究

目的 克隆汉坦病毒84Fli株S，M片段，测定这些基因的核苷酸序列，用瞬时表达了解S和M片段在真核细胞中的表达。方法 以我国分离的汉坦病毒84Fli株感染的Vero-E6细胞提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术扩增其S及M片段的全长cDNA，然后将84Fli株的2，M片段cDNA基因分别克隆入pCR2.1-TOPO载体中，随机挑选其中的3个克隆测定核酸序列，确定汉坦病毒84Fli株S和M片段核苷酸序列，根据S和M片段核苷酸序列设计引物，PCR扩增S及M片段的编码区，构建了真核表达质粒pcDNA3/84SC ey 实验室/84MC。用质脂体法把质粒转入COS7细胞，瞬时表达NP及G1和G2糖蛋白，用免疫荧光（IFA）、Western blot和免疫沉淀方法检测核蛋白及糖蛋白的表达。结果 汉坦病毒84Fli株的基因组S片段长度为1688个核苷酸，编码430个氨基酸，汉坦病毒84Fli株的基因组M片段长度为3616个核苷酸，编码1136个氨基酸，用免疫荧光（IFA）检测S和M片段在COS细胞中的瞬时表达为阳性。Western blot结果显示，存在有相对分子质量为50000左右的核蛋白表达，免疫沉淀法显示有核蛋白、G1和G2糖蛋白的表达。结论 84Fli株病毒和其他汉滩病毒在核苷酸序列上虽有差异。但在氨基酸水平上的同源性仍很高，成功地在COS7细胞中瞬时表达了汉滩病毒的核蛋白及糖蛋白。     

Molecular cloning of a 30-kilodalton lysine-rich surface antigen from a nonpathogenic Entamoeba histolytica strain and its expression in a pathogenic strain.

A monoclonal antibody (MAb), 318-28, that specifically reacts with a 30-kDa antigen present on membrane surfaces of all nonpathogenic (NP) Entamoeba histolytica strains tested and which did not react with pathogenic (P) strains was used for the isolation of the cDNA coding for this antigen from an expression library of an NP E. histolytica strain. The deduced amino acid composition was rich in lysine residues (14.5%), with some sequence similarity to a polyadenylate-binding protein. Southern and Northern (RNA) blot analyses, as well as amplifications of DNA segments by PCR, indicate that a very similar gene (identity of 96.5%) exists in P strains of E. histolytica. Unexpectedly, the NP-specific antigen was also identified by MAb 318-28 on the surfaces of a cloned, xenically cultivated and well-characterized P strain (BNI:0591) that was recently isolated from a human liver abscess. Binding of the MAb, both to the cell surfaces and to Western blots (immunoblots), was abolished, however, upon axenization of the BNI:0591 cultures. Oligonucleotide primers, designed to anneal only to specific DNA sequences of the NP 30-kDa protein gene copy, amplified a DNA segment from P strain BNI:0591 which was identical in sequence to that of the NP 30-kDa protein gene. Our findings indicate that a P strain of E. histolytica can possess and express, under certain growth conditions, an antigen that is usually detected only in NP strains.