重组腺病毒介导MDA-7/IL-24对Hep3B选择性杀伤和抑制增殖的研究

目的观察黑色素瘤分化相关基因7（MDA-7／IL-24）基因对人肝癌细胞Hep3B和正常的肝细胞L02的作用，并且探讨其该作用机制。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞Hep3S，逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）和ELISA方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，噻唑蓝染色法（MTT）观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检二种细胞的凋亡，利用PI染色后流式细胞仪检测细胞周期，RT-PCR方法检测bcl-2的表达变化。结果Ad．mda-7能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株Hep3B和正常细胞L02中高效表达，细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达（Hep3B：L02分别为790：810ng／L）。MDA-7／IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长（抑制率分别是83％和1．2％），能促进肝癌细胞的凋亡（58％：2．2％），阻滞肝癌细胞在G2／M期（48．29％：7．95％）。而对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用；能明显的抑制Hep3B的凋亡抑制基因bcl-2的表达。结论Ad．mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞Hep3B，促进细胞增殖阻滞，其机制是通过抑制bcl-2的表达诱导肿瘤细胞凋亡。     

Ad.mda-7高选择性杀伤不同转移潜能肝癌细胞的研究

目的利用携带人MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒（Ad．mda7）作为载体，感染不同转移潜能的肝癌细胞MHCC97H，MHCC97L，Hep3B和正常的肝细胞L02，观察该基因对肝癌的选择性杀伤作用和增殖抑制作用。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad．mda-7感染正常肝细胞L02和肝癌细胞MHCC97H，MHCC97L和Hep3B，通过RT-PCR和ELISA方法观察MDA7基因的表达，通过四甲基偶氮哩蓝染色法（MTT）观察该基因对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和流式细胞仪观察MDA-7对肝癌细胞的杀伤作用，流式细胞仪检测细胞周期变化。结果RT-PCR提示复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株MHCC97H，MHCC97L，Hep3B和正常细胞L02中高效表达；ELISA方法检测提示细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达，而且随着感染时间延长表达量升高；MTT实验结果表明MDA7能明显抑制肝癌细胞的生长，Hoechst染色和流式细胞仪提示MDA7能促进肝癌细的凋亡；细胞周期检测提示肝癌细胞大量被阻滞在G2／M期，正常细胞没有增殖阻滞作用。各项结果提示MDA7对正常的肝细胞没有促进凋亡和增殖阻滞的作用。结论Ad．mda-7选择性的杀伤肝癌细胞，促进细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡与肝癌细胞的转移潜能无关。     

含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽的白细胞介素-24突变体真核表达载体的构建及其体外抗肝癌作用

目的 构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的白细胞介素(IL)-24突变体(RGD-IL-24)真核表达质粒,观察其对肝癌细胞的抑制作用.方法 利用重叠PCR技术在IL-24cDNA中插入GGT三个碱基,获得RGD-IL-24 cDNA.将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1/RGD-IL-24.将pcDNA3-1/RGD-IL-24及作为对照的pcDNA3.1/IL-24转染肝癌细胞HepG2,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-24 mRNA表达;Western blot检测IL-24蛋白表达;噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖;FITC-Annexin V染色检测细胞凋亡;Western blot检测bax、bcl-2表达.结果 测序证明pcDNA3.1/RGD-IL-24构建成功.RT-PCR、Western blot证实转染pcDNA3.1/RGD-IL-24的肝癌HepG2细胞表达IL-24.pcDNA3.1/RGD-IL-24、pcDNA3.1/IL-24处理组HepG2细胞存活率分别为(0.382±0.064、0.563±0.038),凋亡细胞阳性率分别为(0.346±0.049、0.163±0.087),两组差异均有统计学意义.Western blot证实pcDNA3.1/RGD-IL-24促进bax表达、抑制bcl-2表达作用强于pcDNA3.1/IL-24.结论 RGD-IL-24真核表达质粒不仅不影响IL-24表达,且能显著增强IL-24诱导肝癌细胞凋亡及抑制肿瘤生长作用.     

AIBP在肝癌细胞中的表达及意义与含AIBP基因及AFP启动子驱动的双自杀基因表达载体构建

目的：探讨载脂蛋白A-I结合蛋白（AIBP）在肝癌细胞中的表达及意义。方法：用RT-PCR与Western blot法分别检测正常肝细胞株L02,AFP阳性人肝癌细胞株HepG2和Hep3B,及AFP阴性人肝癌细胞株SMMC7721中AIBP基因与蛋白的表达;构建AFP启动子驱动的双自杀基因（CD,TK）+AIBP基因过表达载体pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK,并转染Hep3B和SMMC7721细胞,用MTT法检测转染后细胞的增殖能力,用RT-PCR和Western blot法检测细胞AIBP,血管内皮生长因子（VEGF）,VEGF受体2（VEGFR-2）,基质金属蛋白酶9（MMP-9）基因和蛋白的表达。结果：AIBP mRNA和蛋白在正常肝细胞中高表达,而在各肝癌细胞系中均表达下调,且Hep3B和SMMC7721细胞中下调明显。成功构建pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK真核表达质粒并转染入Hep3B和SMMC7721细胞。转染后AFP阳性Hep3B细胞生长到明显抑制,但AFP阴性SMMC7721细胞增殖不受影响;两种细胞的AIBP基因与蛋白表达均明显上调,而VEGFR-2,VEGF和MMP-9基因与蛋白表达明显表达下调。定量指标间的差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：AIBP在肝癌细胞中表达下调,AIBP与肝癌细胞的侵袭转移能力有关,而与细胞增殖能力无关;成功构建了联合基因载体pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK。

     

核酶基因抑制肝癌细胞低氧诱导因子-1α表达的实验研究

目的探讨靶向HIF-1α核酶基因对肝癌细胞HIF-1α表达的调控。方法采用脂质体介导的方法，将靶向HIF-1α核酶基因真核表达载体转染肝癌细胞Hep3B2，并予低氧条件诱导。于转染后48h采用Western Blotting检测Hep3B2细胞中HIF-1α蛋白的表达水平；荧光报告基因方法检测HIF-1转录活性。结果Hep3B2细胞低氧诱导后，HIF-1α蛋白表达水平、HIF-1转录活性增高（1．0±0．02），转染核酶基因400μmol／L后48h，Hep3B2细胞低氧诱导的HIF-1α蛋白表达水平明显下降，HIF-1转录活性下调（0．12±0．025，P〈0．05）。结论核酶基因可特异性抑制低氧诱导的肝癌细胞HIF-1α表达，降低其转录活性。     

B7.1和B7.2基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的 构建含鼠源性B7．1和B7．2真核表达载体体系，研究其在肝癌细胞系CBRH7919中获得高效、稳定表达的方法。方法 将目的基因全长cDNA分别亚克隆到真核表达载体PCI-neo中，获得B7．1和B7．2正向单拷贝插入重组子PCI-neo-B7．1和PCI-neo-B7．2，采用酶切法和测序法鉴定。采用阳离子脂质体将PCI-neo-B7．1／B7．2分别转染CBRH7919，经G418筛选，获得阳性克隆，命名为PCI-neo-B7．1／B7．2-CBRH7919 细胞。逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因在CBRH7919中的表达。结果 PCI-neo-B7．1／B7．2酶切后，电泳显示918bp和942bp的目的基因片段和5．4kbp的线性化PCI-neo载体片段；重组子测序结果与Genebank中B7．1和B7．2序列相符，证实构建成功。RT-PCR检测结果显示B7．1和B7．2均在PCI—neo—B7．1／B7．2—CBRH7919 中获得稳定表达。结论 重组真核表达载体构建正确，并在肝癌细胞系CBRH7919中获得高效、稳定表达，为其在肝癌分子免疫治疗研究中应用奠定基础。     

凋亡素基因在人乳腺癌细胞中的表达及诱导凋亡作用

目的 构建pcDvp3重组真核表达质粒，并观察凋亡素基因(vp3)在人乳腺癌细胞一435中的表达及诱导凋亡作用。方法 (1)扩增vp3基因，与pcDNA3．1连接构建pcDvp3重组真核表达载体，并测序；(2)将pcDvp3和pcDNA3．1转染Hela细胞，免疫荧光技术检测凋亡素蛋白表达；(3)将pcDvp3和pcDNA3．1空质粒转染人乳腺癌细胞435和正常细胞，转染48h后用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果 (1)核酸序列分析证明克隆的vp3基因与文献报道一致，且正确插入载体中，表明真核表达载体pcDvp3构建成功；(2)转染pcDvp3的Hela细胞48h后可见明显的荧光，而pcDNA3．1组未见；(3)电镜可见细胞明显形态改变及凋亡小体形成；电泳见典型梯形条带；流式细胞仪检测出现凋亡峰，于转染48h后达最高，凋亡百分率为14．42％；而转染pcDNA3．1细胞未见上述改变。结论 vp3在体内能够表达并有效地诱导人乳腺癌．435细胞凋亡。     

含人γ-干扰素基因真核表达载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含人γ-干扰素（IFN-γ）基因的真核表达载体（pcDNA3-IFN-γ),并观察其在肝癌细胞株中的表达情况。方法 将IFN-γ的cDNA亚克隆于哺乳动物载体（pcDNA3）上，经脂质体介导将pcDNA3-IFN-γ导入人肝癌细胞株SMMC-7721和QGY-7701中，通过高剂量G418选择培养得出抗性克隆。RT-PCR检测IFN-γ基因在转染细胞内有无转录，ELISA法检测转染细胞内IFN-γ的表达水平。结果 IFN-γ基因在转染细胞内有无转录，ELISA法检测转染细胞内IFN-γ的表达水平。结果 IFN-γ基因的mRNA仅存在于pcDNA3-IFN-γ导入的肝癌细胞内。其细胞培养上清液存在高水平的IFN-γ。结论 含IFN-γ基因的真核表达载体能在肝癌细胞中稳定表达。     

重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因，与真核表达载体pcDNA3．1连接，成功构建了重组pcDNA3．1-hBMP-7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3，1-hBMP-7转染组；B空载体pcDNA3．1转染组；C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。[结果]RT．PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高；经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异（P〈0.05）。[结论]成功构建了pcDNA3，1-hBMP-7真核表达载体；外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。     

腺病毒介导的mda-7／IL-24抑制肝癌VEGF和MMP-9的表达

目的 观察mda-7/IL-24基因对高转移性人肝癌细胞HCCLM6中VEGF和MMP-9的作用,从而探讨mda-7/IL-24基因在抑制肿瘤转移方面的作用.方法 构建Ad.Mda-7并转染至HCCLM6;transwell实验检测侵袭能力的变化;通过RT-PCR和Western Blot分别检测转染mda-7/IL-24基因前后VEGF和MMP-9表达mRNA和蛋白的变化;构建HCCLM6高转移型裸鼠模型,采用Ad.Mda-7肿瘤内注射法干预,观察mda-7/IL-24对裸鼠生存状况的影响和肿瘤内VEGF和MMP-9 的变化.结果 复制缺陷型腺病毒能介导外源基因mda-7/IL-24在肝癌细胞中高效表达;mda-7/IL-24能显著下调肝癌细胞中VEGF和MMP-9的表达.Ad.mda-7能延长裸鼠的生存时间,抑制肿瘤的生长,瘤体内VEGF和MMP-9表达明显降低(P<0.05).结论 mda-7/IL-24基因能明显抑制肝癌细胞的侵袭力,其机制可能与下调VEGF和MMP-9的表达有关.     

稳定表达Angiopoietin-1基因肝癌细胞株的建立及其意义

目的 通过将Angipoietin-1基因转染培养人肝癌细胞SMMC－7721,建立长期表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞模型。方法 基因重组构建Angipoietin-1真核表达质粒pcDNA3/Angipoietin-1,经脂质体将pcDNA3/Angipoietin-1质粒转染培养人肝癌细胞株SMMC－7721,G418筛选阳性细胞克隆,逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测转染后25-30d细胞Angipoietin-1基因mRNA表达水平。结果 （1）限制酶切和凝胶电泳证明成功构建表达质粒pcDNA3／Angipoietin-1;（2）通过脂质体Dosper将质粒pcDNA3／Angipoietin-1转染SMMC－7721,经G418筛选后获得阳性细胞克隆;（3）RT－PCR证明经脂质体转染的人肝 癌细胞株SMMC－7721可较稳定表达Angipoietin-1基因。结论 成功建立稳定表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞株SMMC－7721／Angipoietin-1,为通过在体途径探讨Angipoietin-1对肿瘤血管生成的调节作用奠定了基础。     

VEGF15基因表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的特异表达,为重组VEGF165进一步的生物学活性和临床研究奠定基础.方法：采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,在脂质体介导下将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,以抗生素培养基筛选抗性细胞,并对抗性细胞进行单克隆化,采用双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blotting等方法对目的蛋白在细胞中的特异表达进行分析鉴定.结果：完成真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165的构建,并成功转染NIH/3T3细胞,筛选到一批G418抗性的阳性细胞,单克隆化的阳性细胞（吸光度值0.345±0.064）与空载体转染（吸光度值0.114±0.012）的对照比较,有显著的VEGF165表达（P〈0.01）,SDS-PAGE和Western Blotting检测到VEGF165在扩大培养的克隆细胞中的特异表达.结论：应用pcDNA3.1（＋）-VEGF165载体转染的NIH/3T3细胞可高效表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白.     

PNP-CD融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的 分析PNP-CD融合自杀基因系统对肝癌细胞HepG2的杀伤作用并探讨其可能的机制.方法 利用重组PCR定点诱变法制备融合基因PNP-CD.将PNP-CD插入真核表达载体pcDNA3.0中,构建融合自杀基因表达载体pcDNA3.0/PNP-CD.经酶切、PCR及测序鉴定重组体,G418筛选获得稳定转染pcDNA3.0/PNP-CD的抗性细胞克隆.用RT-PCR和Western Blotting法检测PNP-CD基因在HepG2细胞中的表达.用台盼蓝排斥法检测细胞生长曲线,用MTT法检测细胞细胞克隆对相应前药敏感性及所导致的旁观者效应.结果 融合基因片段PNP-CD正确插入了pcDNA3.0中,pcDNA3.0/PNP-CD在HepG2细胞中实现了表达.细胞抗性克隆对特定的前药高度敏感.在两种前药联合作用下,pcDNA3.0/PNP-CD所致旁观者效应明显强于只给予MeP-dR一种前药所致旁观者效应.结论 具有双自杀基因功能的PNP-CD融合基因系统是肝癌基因治疗中一种高效治疗载体,对肝癌细胞有着良好的杀伤作用.     

野生型p16基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长及代谢影响的实验研究

目的　探讨野生型 p16基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞 (keloidfibroblasts,KFb)生长增殖及DNA合成代谢的影响。　方法　构建含p16cDNA片段的真核表达载体 pcDNA3 p16 ,采用脂质体介导的基因转染法 ,将其导入体外培养的KFb中 ,并用G4 18筛选阳性克隆。随后对已转染及未转染的KFb进行免疫细胞化学染色 ,观察p16蛋白的表达 ,并通过绘制细胞生长曲线及采用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷 (3 H TdR)掺入法 ,比较转染前后细胞在生长增殖及DNA合成代谢方面的变化。结果　经酶切鉴定证实 ,pcDNA3 p16构建成功。已转染的KFb经G4 18筛选 ,出现阳性克隆 ,并有 p16蛋白表达 ;与正常KFb比较 ,其生长增殖速度明显减缓 ,DNA合成代谢能力明显减弱 (P <0 .0 5 )。　结论　p16基因对KFb的生长增殖及DNA合成代谢有明显的抑制作用。     

HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定

目的 构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒pEGF-HBx,建市稳定、高效表达乙型肝炎病毒x基因(HBx)的大鼠卵圆细胞株,以便进一步研究HBx基因和卵圆细胞在肝癌发牛过程中的作用和机制.方法 用PCR方法从质粒pcDNA3.1-HBx中扩增含Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的HBx基因序列.对增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-NI)及扩增的HBx目的 基因片段进行双酶切,纯化后用连接酶连接得到重组体pEGFP-HBx,将其转化大肠杆菌DHSα,抗生素筛选培养得到阳性克降,提取质粒后用双酶切和基因测序进行鉴定.通过脂质体介导将质粒pEGFP-HBx转染到大鼠卵圆细胞株(LE/6)中,经G418筛选,尤限传代后得到稳定表达EGFP-HBx融合蛋白的细胞株.分别采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞株中HBx基凶的表达情况.结果 双酶切及基因测序结果均显示构建的pEGFP-HBx质粒中含有完整的HBx基因片段.将得到的抗性细胞株培养传代20次后仍表达强的荧光;RT-PCR及免疫细胞化学检测均发现HBx基因在抗性细胞(LE/6)中得到了稳定转录和翻译.结论 已成功构建带HBx基因的真核表达质粒pEGFP-HBx,获得了稳定、高效表达EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圆细胞株,为进一步研究HBx基凶和卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制奠定了实验基础.     

乙型肝炎病毒X蛋白对DNA甲基转移酶3A/3B表达的影响

目的观察乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对QSG7701细胞中DNA甲基转移酶（DNMT）3A/3B表达的影响。方法本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆（pcDNA-X/QSG7701）及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆（pcDNA3.0/QSG7701）。采用RT-PCR、Westernblot分别检测转染细胞中HBxmRNA和HBx蛋白的表达。Real-timePCR检测3种细胞DNMT3A/3BmRNA的表达情况。免疫组织化学法检测3种细胞DNMT3A/3B蛋白的表达情况。结果RT-PCR、Westernblot检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中有HBxmRNA及HBx蛋白的表达。Real-timePCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中DNMT3A/3BmRNA表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及未转染的细胞QSG7701（P〈0.05）。免疫组织化学检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中DNMT3A/3B蛋白表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及QSG7701细胞（P〈0.05）。结论稳定转染HBV-X基因的人源性永生化非瘤性肝细胞QSG7701中DNMT3A/3BmRNA和蛋白的表达水平均显著升高,提示HBV-X基因在mRNA及蛋白水平能上调转染细胞中DNMT3A/3B的表达,而细胞中DNMT3A/3B表达的增加是否能进一步影响癌基因、抑癌基因的表达水平,从而导致细胞癌变,尚有待进一步研究。     

运用siRNA建立稳定低表达IGF1R基因的肝癌细胞株的实验研究

目的运用siRNA技术在肝癌细胞株中建立稳定低表达人胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的细胞株。方法构建包含封闭IGF1R基因的真核表达载体pSUPER-IGF1R-siRNA,转染SMMC7721和Hep3B细胞,G418筛选表达稳定的细胞株。通过RT-PCR、Western-blot分析与鉴定IGF1R mRNA和蛋白及cyclin D1、cyclinB1蛋白的表达,并绘制细胞生长曲线。结果在SMMC7721和Hep3B细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,其生长明显减慢(P<0.05),且其cyclinD1表达亦明显下降(P<0.05)。结论pSUPER-IGF1R-siRNA能抑制SMMC7721和Hep3B细胞的生长。     

脆性组氨酸三联体基因FHIT对乳腺癌细胞株MCF-7的作用

目的 克隆人类脆性组氨酸三联体基因(FHIT)并构建其真核表达载体pcDNA3.1(+)/FHIT,将人FHIT基因转染人乳腺细胞MCF-7中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 构建FHIT基因表达载体pcDNA3.1(+)/FHIT,用脂质体法将FHIT基因的真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)/FHIT导入人乳腺癌细胞MCF-7中,细胞计数、流式细胞术分析转染后细胞的生物学特性变化.结果 将逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增后的产物克隆到表达载体peDNA 3.1(+)上,经PCR扩增筛选鉴定和测序鉴定证实为所需序列,转染乳腺癌MCF-7细胞后,FHIT基因的表达明显增强,细胞周期分析发现MCF-7/FHIT与MCF-7比较S期及G2/M期的细胞减少,G0/G1期的细胞增加,MCF-7/FHIT细胞的凋亡率为(29.75±5.90)%,MCF-7细胞的凋亡率为(11.21±6.10)%,和MCF-7比较,转染后的MCF-7/FHIT细胞的凋亡明显增加,MCF-7细胞的增殖明显抑制.结论 FHIT基因表达载体可有效抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖.     

Utilizing alpha-fetoprotein expression to enhance oncolytic viral therapy in hepatocellular carcinoma

OBJECTIVE: To determine whether alpha-fetoprotein (AFP)-regulated ribonucleotide reductase (RR) production would promote more vigorous and specific viral killing in AFP-expressing hepatocellular carcinoma (HCC). BACKGROUND: AFP is expressed in over 70% of primary HCC but not in normal adult liver. AFP production by HCC can be exploited to target viral killing of tumor cells. G207 is an oncolytic herpes virus lacking UL39, the gene encoding RR. RR is an enzyme required for viral DNA synthesis and cytotoxicity. METHODS: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed for AFP levels on Hep3B and PLC5 human HCC cells. An AFP-albumin enhancer-promoter complex (AFP-alb) was constructed in a luciferase vector to assess function. AFP-alb was cloned upstream of UL39 (AFP-alb/UL39) and transfected into HCC cells for G207 cytotoxicity assays. Viral plaque forming assays evaluated G207 replication. Hep3B flank tumors, with and without AFP-alb/UL39 transfection, were established in athymic mice (n = 28) and treated with G207. RESULTS: Hep3B had 5-fold higher AFP levels than PLC5 (P < 0.00001). AFP-alb increased luciferase expression 72-fold in Hep3B (P < 0.001) and 3-fold in PLC5 (P < 0.001). AFP-alb/UL39 transfection increased G207 cytotoxicity 93% in Hep3B (P < 0.0005), with no significant increase in PLC5. Peak viral titers were 46-fold higher in Hep3B transfected with AFP-alb/UL39 versus mock-transfected cells (P < 0.01), with no significant change in PLC5. Flanks tumors transfected with AFP-alb/UL39 and treated with G207 demonstrated a 76% volume reduction versus mock-transfected tumors infected with G207 (P < 0.0001). CONCLUSIONS: AFP-driven RR production by hepatoma cells significantly enhances herpes viral cytotoxicity and specificity in vitro and reduces tumor burden in vivo.