拳卷地钱基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增体系优化

目的建立一种拳卷地钱基因组DNA的提取方法;对影响拳卷地钱ISSR-PCR反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法采用改进的CTAB法提取拳卷地钱基因组DNA;以Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平的正交设计对拳卷地钱ISSR-PCR反应体系进行优化。结果采用改进的CTAB法提取的拳卷地钱基因组DNA质量高,且适用于ISSR-PCR扩增;获得拳卷地钱最佳反应体系(20μl)为:Taq酶0.5 U,Mg2+2.0 mmol/L,dNTP 250μmol/L,模板DNA 50ng,引物0.6μmol/L。结论建立并优化了拳卷地钱总DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的:对白芨ISSR-PCR反应体系进行建立以及优化。方法:采用正交试验对影响白芨的ISSR-PCR反应体系中的6个影响因素Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、d NTP、Mg2+进行系统的筛选和优化,寻找白芨ISSR-PCR的最优条件。结果:经过系统的优化后,最终确立了最优的白芨ISSR-PCR方案,50μL反应液中Taq DNA聚合酶为2.5U、BSA为7.5g/L、引物为5.0μmo L/L、模板DNA为200ng、d NTP为0.4mmo L/L、Mg2+为4.0mmo L/L。结论:试验结果得出最佳的白芨ISSR-PCR反应体系,为后期合理有效的应用ISSR方法对白芨遗传资源的监测提供了参考。     

濒危药用植物三叶青ISSR分子标记的建立

目的对三叶青的简单重复序列-聚合酶链式反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序进行优化,并将其应用于野生三叶青种质资源的遗传分子标记。方法采用单因素试验,对三叶青ISSR-PCR反应条件中的Mg2+、d NTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度等因素进行筛选,之后结合正交试验来选择多态性高、重复性好的ISSR引物。结果建立了ISSR-PCR最佳反应体系,为25μL反应体系中含有2.5 mmol/L Mg2+、0.2μmol/L引物、0.25mmol/L d NTP、50 ng DNA模板、0.5U Taq DNA聚合酶,并利用U810等16条引物,初步构建了15份三叶青种质资源的ISSR指纹图谱,平均多态条带百分率达57.0%。结论该反应体系的稳定性和多态性良好,可满足对三叶青野生资源的遗传变异水平和结构分析的研究考察。     

云南沉香ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的建立并优化出清晰稳定的云南沉香ISSR-PCR反应体系和扩增程序,并筛选出适合的引物。方法利用正交设计试验,对云南沉香ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素进行优化,并设置温度梯度检测最佳退火温度。结果首次建立了云南沉香ISSR-PCR的最佳反应体系,即在20μl反应体系中,各个因素的浓度分别为:模板DNA 10 ng/20μl、Mg2+3mmol/L、Taq DNA聚合酶2.4 U/20μl、d NTP 0.6mmol/L、引物0.2μmol/L;引物UBC811的最佳退火温度为53.0℃。并且,从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论优化确立的云南沉香ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可为后续云南沉香的遗传多样性分析研究奠定基础。     

药用植物胡黄连ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 优选胡黄连稳定的ISSR-PCR反应体系.方法 采用4因素(dNTPs、Mg2+、Taq酶、引物)4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法.结果 适于胡黄连的25 μl的ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer2.5 μl,dNTPS150 μmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq酶1U,引物0.5μmol/L,DNA20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs150 μmol/L,Mg2+2 mmol/L,Taq酶0.5U,引物0.5 μmol/L,DNA20 ng.结论 对于胡黄连ISSR-PCR实验,一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系.     

温郁金SRAP-PCR反应体系建立及条件优化

目的研究温郁金Curcuma wenyujin的SRAP-PCR扩增体系最适宜的条件。方法以提取纯化温郁金基因组DNA为模板,利用PCR扩增技术,对SRAP反应中主要影响因素Mg2+浓度、d NTP浓度、模板DNA质量浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度进行优化。结果根据实验确定的最佳体系为25μL SRAP反应体系,其中Mg2+2.0 mmol/L,Taq聚合酶2.0 U,引物浓度1.6μmol/L,模板DNA 0.4 ng/μL,d NTP 2.0 mmol/L,10×PCR缓冲液2.5μL。结论通过扩增条件优化实验,扩增的产物条带清晰明亮、重复性好,确定的反应体系及反应程序适用于温郁金的SRAP分子标记,为今后温郁金的遗传多样性研究奠定了基础。     

穿龙薯蓣ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

目的建立穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的稳定体系。方法利用单因素及正交试验设计的方法对影响穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增效果的d NTPs浓度、引物浓度、模板DNA用量Taq DNA聚合酶用量、Mg~(2+)浓度进行优化。结果穿龙薯蓣的ISSR-PCR的20μl最佳反应体系为:2.0μl 10×Taq Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.225mmol/L d NTPs,1.5 UTaq DNA聚合酶,1.0μmol/L引物,2.0 ng/μl DNA模板,dd H2O补齐。应用该反应体系筛选出来适用于穿龙薯蓣ISSR扩增的12条引物,并确定了各引物的最佳退火温度。结论确立了一个适用于穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的体系。     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq酶1.00 U、Mg2+1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25mmol/L、引物0.50μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

天门冬ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的建立并优化天门冬ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨天门冬种质间遗传多样性提供依据。方法采用单因子试验和正交设计法,研究Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响。结果天门冬ISSR-PCR的最佳反应体系为25μL的反应体系中含模板DNA 40 ng、Mg2+1.25 mmol/L、dNTP 320μmol/L、引物1.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U。在此基础上,从50条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论建立的天门冬ISSR-PCR反应体系,经过17份天门冬种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬遗传分析。     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序.为探讨夏枯草种质问遗传多样性奠定基础.方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究.Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响.结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20 μL的反应体系中含模板DNA 30ng,Mg2+ 2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U.在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.并通过梯度PCR试验.确定引物最佳退火温度.结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析.     

水母雪莲ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

目的优化并建立适合于水母雪莲的ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR引物。方法采用L16(45)正交设计方法,以Taq DNA聚合酶浓度、d NTP浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度5种因素4个水平对水母雪莲ISSRPCR反应体系进行优化;并对反应体系进行验证。采用优化后的反应体系筛选出条带清晰且稳定的ISSR引物,通过退火温度梯度试验确定最佳退火温度。结果最终确立了水母雪莲20μl ISSR-PCR最佳反应体系,即包含Taq DNA聚合酶0.7U、d NTP 0.125mmol/L、引物0.3μmol/L、模板DNA 40ng、Mg~(2+)1.5mmol/L。在此基础上,从84条ISSR引物中筛选出条带清晰且稳定的8条引物,并通过梯度PCR反应确定最佳退火温度。结论经过11份水母雪莲种质验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于后续水母雪莲遗传多样性分析和种质资源鉴定。     

金樱子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的为获得稳定的金樱子ISSR反应体系。方法采用L16(45)正交试验设计,以金樱子DNA为模板,研究PCR反应体系中5种主要成分,即Mg2+、d NTPs、Tag酶、引物及模板对金樱子ISSR-PCR扩增结果的影响。结果金樱子ISSR在20μl的最佳反应体系中,Mg2+浓度为0.5mmol/L,Tag酶为0.9 U/μl,d NTPs为0.3 mmol/L,引物为0.2(100μmol/L),模板DNA用量为2ng/μl。结论实验结果可用于金樱子ISSR的构建。     

杜仲SSR-PCR反应体系的优化

目的:建立杜仲简单重复序列-聚合酶链式反应(SSR-PCR)的优化反应体系,为杜仲种质间的遗传差异及亲缘关系分析提供参考。方法:选择Taq DNA聚合酶,模板DNA,Mg2+,引物及d NTP浓度为考察因素,利用单因素试验和L16(45)正交试验优选杜仲的SSR-PCR反应体系,运用SPSS软件对试验结果进行分析。结果:各因素水平变化对反应体系影响顺序依次为Mg2+Taq DNA聚合酶引物d NTP模板DNA。优化的PCR反应体系为10×PCR缓冲液2μL,Taq DNA聚合酶0.5U,Mg2+浓度1.25 mmol·L-1,d NTP浓度0.2 mmol·L-1,引物浓度0.3μmol·L-1,模板DNA用量60 ng,定容至20μL。结论:利用该体系进行扩增,所得谱带明亮清晰,稳定性和重复性良好,适用于杜仲不同居群间亲缘关系和遗传多样性分析。     

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据.方法 使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择.结果 在25 μL总体积中,其中包括10×PCR缓冲液2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7℃.结论 所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析.     

桔梗ISSR反应体系的建立和优化

目的建立并优化桔梗ISSR-PCR反应体系和扩增程序。方法采用正交试验和单因子试验,对ISSR反应体系主要因子(dNTPs、Taq酶、引物、Mg2+、模板)进行筛选。之后通过单因子试验,进行引物退火温度、循环次数的筛选。结果桔梗ISSR-PCR的最佳反应体系(20μl)为:dNTPs 0.25mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.30μmol/L、Mg2+1.50mmol/L、模板DNA10ng。利用此反应体系从54条引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,确定了引物UBC853[序列为(TC)8RC]的最佳退火温度为55℃和循环次数为45次。结论建立的桔梗ISSR-PCR反应体系,经过白、紫花桔梗共20份样品检验,证明该体系具有稳定性和可靠性,可用于桔梗遗传多样性研究。     

民族药青叶胆EST-SSR反应体系建立及引物筛选

目的采用EST-SSR标记遗传多样性能研究。方法以青叶胆叶片为材料,采用改良CTAB法提取DNA,通过单因素筛选法及L16(45)正交试验对模板DNA、d NTPs、引物、Taq酶及Mg~(2+) 5个因素进行优化试验。结果最佳反应体系为(20μl):50 ng模板DNA,150μmol/L d NTPs,0.1μmol/L引物,1.5 U Taq酶,2.5μmol/L Mg2+。从52对引物中初步筛选出10对条带清晰、多态性好的引物。结论本实验获得的优化体系能稳定用于青叶胆EST-SSR分子标记,为遗传多样性、亲缘关系分析及遗传作图等研究工作奠定了重要基础。     

三叶青相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系的建立与优化

目的建立浙江和江西产的三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)SRAP-PCR的反应体系和扩增程序。方法应用L9(34)正交设计方法,以三叶青基因组DNA为模板,研究了Mg2+、dNTP、引物和模板DNA 4种PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,根据梯度PCR仪引物的条带数量及清晰度选择退火温度。结果优化后的25μL反应体系包含:10×PCR buffer2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.15mmol/Ld NTP,0.15μmol/L引物,1.0U Taq DNA聚合酶,50ng DNA模板。扩增程序的最佳退火温度为51℃。并筛选出8对扩增产物丰富,多态性好的引物。结论正交设计优化的三叶青SRAP反应体系,经过10份样品检验,证明该体系稳定可靠,多态性好,可用于三叶青遗传多样性分析。     

正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系

目的 建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系.方法 利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度)进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测.结果 大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响最大;地枫皮ISSR-PCR最佳反应体系(20 μL)为:Mg2+ 1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90 μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;最佳退火温度和循环次数分别为51.8℃和40次;从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论 建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析.     

羌活和宽叶羌活简单重复序列区间扩增反应体系的正交优化

目的通过探讨羌活和宽叶羌活ISSR实验中各种因素的影响,以建立羌活和宽叶羌活的简单重复序列区间扩增(ISSR-PCR)最佳反应体系。方法利用正交实验设计L9(34)对羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系的4因素(Mg2 ,dNTP,引物,Taq酶)在3个水平上进行优化实验,PCR结果用SPSS13.0统计软件分析,并设置梯度PCR进行引物退火温度筛选。结果在20μl ISSR-PCR反应体系中,各组分的最适浓度为:2.0 mmol/L Mg2 ,250μmol/L dNTPs,0.50μmol/L引物,1UTaq酶,40 ng DNA模板;模板DNA40~90 ng,不同引物有不同的最佳退火温度,范围在48~52℃。结论该优化体系的建立为进一步进行羌活和宽叶羌活种群间遗传多样性研究提供了参考。     

青天葵ISSR-PCR体系优化及引物筛选

目的:建立适合青天葵遗传差异分析的简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链式(PCR)反应体系。方法:采用正交试验设计对影响青天葵ISSR-PCR反应体系的5种因素(dNTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶)4个水平进行优化,并结合新复极差法,对试验中各单因素进行分析。结果:确立了青天葵最佳反应体系,即在20μL的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μL,dNTP 225μmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA60 ng;从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论:建立的青天葵ISSR-PCR反应体系,经过24份青天葵样品检验,得出该体系稳定可靠,可用于青天葵遗传差异分析。