体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

OBJECTIVE: To study the optimal dosage and timing for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro. METHODS: Bone marrow-derived MSCs of SD rats were cultured in vitro routinely and the sixth passage was taken for identification of specific surface antigens by flow cytometry. Before reaching cell confluence, the purified MSCs were incubated with BrdU at different concentrations (5, 10, and 15 micromol/L) for different incubating time (3, 12, 24, 36, 48, and 72 h) with 10 micromol/L BrdU, to identify the optimal BrdU concentration and incubating time for cell labeling. Immunohistochemistry was performed to calculate the labeling index (LI). RESULT: Flow cytometry showed that MSCs expressed CD29 and CD44 but not CD11b or CD45. Incubation of the MSCs with BrdU at 10 micromol/L and for an optimal length of 48 h appeared to achieve the highest LI, both of which exceeded 98%, with the labeling identifiable in five consecutive passages. CONCLUSIONS: The continually passaged cells are MSCs, the incubation of which with 10 micromol/L BrdU for 48 h may achieve a LI over 98% without producing obvious cell damages. The results suggest that BrdU labeling provides a feasible means for a dynamic in vivo observation of the survival, growth and differentiation of the implanted MSCs.     

BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨连续培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)最佳标记时间、剂量。方法 差速贴壁法对SD鼠MSCs进行体外传代培养;第6代细胞行流式细胞仪鉴定细胞的表面抗原;以终浓度分别为5、10、15μmol/L的BrdU检测最佳标记剂量;在细胞生长融合前72、48、36、24、12、3h加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,并分别孵育至细胞融合,测定BrdU的标记率,找出最佳标记时间;免疫组化分析BrdU标记率。结果 流式细胞仪检测所标记的细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,并且连续传5代均可检测到。结论 传代后贴壁生长的梭形细胞为MSCs,终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,且可以连续检测到,提示BrdU标记可用于MSCs移植入体内后存活、生长和分化的动态观察。     

成人骨髓间充质干细胞体外培养扩增及其生物学特性研究

目的 建立成人骨髓间充质干细胞 (MSCs)体外培养和扩增的条件 ,探讨其生物学特性。方法 取正常成人骨髓用含10%胎牛血清的LG -DMEM培养液培养、扩增后 ,进行透射电镜观察 ,流式细胞仪行细胞表面抗原及细胞周期分析检测。结果 培养扩增获取的成人骨髓MSCs形态均一 ,增殖能力强 ,细胞扩增至第5代细胞数达 (2～3)×108。该类细胞CD29、CD44、CD166表达阳性 ,CD14、CD34、CD45、HLA -DR表达阴性。细胞周期以G0/G1 期为主。细胞胞浆具丰富粗面内质网。结论 所建立的分离和培养方法可获取骨髓粘附细胞中一组独特的细胞群 ,具有MSCs的生物学特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性.方法:用密度为1.073 kg/L的细胞分离液分离骨髓间充质干细胞.取第3代培养细胞用含0.1 μmoL/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的成骨细胞分化培养液培养.于培养7,14 d取细胞爬片做改良的Gomori钙钴法碱性磷酸酶染色,21 d做Von Kassa染色;脂肪细胞分化培养用含10 mg/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.25 mmol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤和100 μmol/L吲哚美辛的培养液诱导培养,于诱导3,7 d取细胞爬片做油红0染色.用含1mmol/L β-巯基乙醇和150 mL/L FBS的DMEM培养基先预诱导分化24 h.再用含有5 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM无血清培养基诱导分化5 h.做神经元特异性烯醇化酶、角质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白免疫组化染色.结果:在加入成骨细胞分化培养液后7和14 d钙钴法碱性磷酸酶染色阳性细胞百分率分别为11.5%和37.5%.21 d的细胞爬片Von Kassa染色显示钙盐沉积.在脂肪细胞诱导3和7 d分别得到22%和90.33%油红O染色阳性细胞.5 h神经细胞诱导分化后NSE免疫组化染色阳性率为33%,NF-200阳性细胞率为37.5%,GFAP染色阴性.结论:骨髓间充质干细胞在体外可定向加药诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞.     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性。方法 采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达。结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性。细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)％,其中s期为(4.12±2.35)％;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)％,说明大部分细胞仍然处于静止期。流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征。结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数。     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性

目的：建立一种成人骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增的方法，并探讨其部分生物学活性及向脂肪细胞诱导分化的方法，并以此鉴定所获细胞。方法：采用1．073g／ml的Percoll分离液分离成人骨髓间充质干细胞。接种于纤维连接蛋白包被，含有表皮生长因子和血小板原性生长因子BB的2％胎牛血清培养液中，并利用其贴壁性进行纯化；观察其形态学变化及超微结构，流式细胞仪检测其表面标记物；采用10％胎牛血清和尼克酰胺诱导其向脂肪细胞的分化。结果：原代和传代培养均保持较强的增殖能力，超微结构显示了干细胞的幼稚特性，流式细胞仪检测示CD34、CD45、CD19、组织相容性抗原-DR阴性，CD44、CD10、CD29、CD13阳性。体外能够分化成为脂肪细胞，油红O染色阳性。结论：采用该方法骨髓间充质干细胞生长稳定，扩增较快；一定条件下能够定向分化成为脂肪细胞；我们所获得的细胞具有间充质干细胞的特性。     

骨髓间充质干细胞的体外培养

目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(MSCs)。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,并于体外扩增、培养、鉴定。应用免疫组化法和流式细胞术评估实验结果。结果:骨髓间充质干细胞易于培养,扩增明显。结论:骨髓间充质干细胞取材方便易于诱导,作为种子细胞具有良好的应用前景。     

骨髓间充质干细胞的体外培养

目的建立骨髓问充质干细胞（MSCs）体外分离纯化的方法,探索MSCs体外培养的最佳方法,为细胞工程学提供细胞来源。方法①MSCs的分离、培养：在无茵条件下取3．4周龄Wistar雄性大鼠四肢骨的骨髓细胞,采用裂解红细胞后的贴壁培养法分离MSCs,利用MSCs与其他贴壁细胞的贴壁差异性,严格控制传代时酶的量和消化时间,传代纯化MSCs;②MSCs的鉴定：取第4代（n）MSCs,用免疫荧光染色的方法检测MSCs的表面抗原CD44、CIM5和CDg0。结果①采用裂解红细胞分离骨髓细胞得到的骨髓单个核细胞形态较多样,分布不均,含杂细胞多,随挟液和传代次数增多,细胞纯度提高,n后细胞形态一致,分布均匀,几乎不见杂细胞;②免疫荧光染色结果显示：P4代MSCs经加入一抗、二抗及荧光染料后见CD44、CD90染色呈阳性,CIM5染色呈阴性反应。结论采用裂解红细胞与贴壁培养法相结合分离、纯化MSCs,可得到活性和纯度均较好的MSCs。     

人骨髓间充质干细胞的分离及鉴定

［摘 要］ 目的：建立分离并鉴定人骨髓间充质干细胞（HMSC）的方法。 方法：联合应用Percoll（1.073 g•L^-1）密度梯度离心和贴壁筛选的方法分离HMSC进行体外培养,利用免疫细胞化学、细胞化学和电镜等技术手段对体外培养的HMSC进行鉴定。 结果：HMSC具有独特的表型特征,即CD29、CD44阳性和CD34、CD45阴性。细胞糖原反应（PAS）阳性、苏丹黑反应（SB）阴性。电镜观察结果提示细胞较幼稚。 结论：利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法可以分离HMSC,联合应用免疫细胞化学、细胞化学和电镜等技术手段鉴定HMSC的方法有效。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察

目的：观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养的生物学特性和作为组织工程的种子细胞的可能性。方法：将人骨髓MSCs自骨髓中分离、纯化和培养，观察原代和传代培养的增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCS有活跃的增殖能力。结论：体外获得的人骨髓MSCs的生物年龄较为年轻，可以为组织工程的进一步研究提供种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性观察

目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)部分生物学特性。方法：自健康人骨髓中分离出MSCs,进行原代培养,第5d首次更换培养液,以去除未贴壁细胞,以后每周换液2次,细胞铺满整个培养瓶底90％时开始传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性,并绘制传代细胞的生长曲线。流式细胞仪检测第3代MSCs细胞表面分子CD29、CD44,以进行MSCs鉴定。结果：MSCs体外培养为贴壁生长。MSCs原代培养约18～21d才达传代要求;传代培养细胞生长潜伏期仅24～36h,对数增长期约3～5d,之后为平台期,4～6d传1代。传至第8代,出现凋亡征象。第3代MSCs细胞表面CD29、CD44的表达率分别为90．6％和91．5％,MSCs均一性较高。结论：从人骨髓中分离出的MSCs在体外环境中具有很强的自我更新和分裂增殖能力。     

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）的方法,研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC,体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;利用四唑盐比色（MTF）法测定MSC的生长曲线;流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。结果原代分离的MSC在接种后48h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期,3天后进人生长期,7天后进入平台期。FCM检测CIM5、CD90阳性率分别为19．60％、95．38％。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

人羊膜负载猪骨髓间充质干细胞生长的形态学研究

目的 建立人羊膜（HAM）负载培养骨髓间充质干细胞（MSCs)生长的组织工程方法，观察MSCs生长增殖的形态特点。方法 将贵州小香猪的MSCs原代培养，传代扩增后，以不同密度多次接种于HAM基质面，逐日到倒置显微镜下观察MSCs的生长增殖变化情况，并于培养8、18d后进行光镜、电镜观察。结果 接种后30min内明显见到MSCs在HAM上贴附生长，MSCs能以合适的接种密度在羊膜上良好生长。结论 HAM对MSCs有明显的促增殖作用，MSCs可以HAM为载体在体外进行培养，HAM是MSCs的良好载体。     

人骨髓内皮前体细胞的体外培养和生物学特性

目的:体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞,研究其基本生物学特性.方法:利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞,再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞,观察细胞生长特性,通过检测细胞血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定.结果:原代培养后细胞贴壁生长,7～10 d形成集落或融合呈卵石形,免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR-2, Ⅷ/vWF 阳性,透射电镜显示细胞内具有特征性的W-P小体.结论:用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞,该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征,可以进一步分化为血管内皮细胞,是理想的组织工程种子细胞.     

人骨髓间充质干细胞体外培养及鉴定

目的：体外分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSC）。方法：利用密度梯度离心法分离出人骨髓单个核细胞（MNC），通过贴壁筛选法建立hBMSC的体外培养体系，并通过一系列检测方法对所培养的细胞进行鉴定。结果：细胞主要呈“成纤维样”，但体积较大、形状不规则、细胞质突起多，细胞核大而疏松，核仁明显。流式细胞仪检测：CD34阳性率为2．09％、CD29阳性率为94．46％；CD54及CD105表达阳性。细胞周期及透射电镜检测提示细胞处于相对原始状态。免疫细胞化学染色显示：CD14、CD45、胶原蛋白Ⅱ呈阴性；CD106、CD166、纤维连接蛋白、波形蛋白及胶原纤维酸性蛋白呈阳性。细胞化学染色：糖原染色呈强阳性；碱性磷酸酶染色呈阴性。通过诱导分化培养可诱导出成骨细胞。结论：成功建立了稳定的hBMSC体外培养体系，按照此培养体系进行培养可获得hBMSC。hBMSC可传代培养，但在培养过程中细胞逐渐出现老化现象，且不能冻存。     

全骨髓法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种体外纯化及培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MsCs）的简便有效方法。方法全骨髓法分离培养SD大鼠MSCs,通过体外培养和连续传代达到纯化和扩增MSCs目的。倒置显微镜下观察细胞形态变化情况：利用四唑盐比色（MTT）法测定MSCs的生长曲线：流式细胞仪（FCM）鉴定MSCs膜抗原。结果SD大鼠胫骨全骨髓细胞在分离后与含10％优质胎牛血清DMEM培养基混合,约5-10min后即可见大量有核细胞贴壁,细胞形态为圆形,24-48h后可见贴壁细胞转变为椭圆形、多角形及短梭形,7-12d时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。通过传代细胞进一步纯化及扩增。细胞传代后2d内处于潜伏期,3d后进入生长期,5d后进入平台期。FCM检测第4代MSCs膜表面抗原CD45、CD90、CD29阳性率分别为1．50％、99．18％、97．70％。结论SD大鼠全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的MSCs,用此方法培养的SD大鼠MSCs生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,可以为组织工程提供理想的种子细胞。为本实验研究打下基础。