晚期糖化终产物受体反义 RNA 腺相关病毒载体的构建及在肾脏系膜细胞中表达

目的 构建晚期糖化终产物受体(RAGE)反义RNA腺相关病毒载体,并在大鼠肾脏系膜细胞中表达. 方法 构建腺相关病毒介导的RAGE反义RNA载体,3个质粒共转染293细胞,获得病毒原液,感染大鼠肾脏系膜细胞,流式细胞术、RT-PCR、ELISA检测重组病毒感染的细胞RAGE的表达和分泌细胞外基质的情况.结果 经酶切鉴定、序列分析显示RAGE基因片段正确完整反向插入pAAV-MCS.利用293细胞包装获得病毒原液的滴度为8.7×107VP/mL.感染重组病毒的细胞与正常细胞比较RAGE表达被抑制(48.2±6.1)%,分泌Ⅳ型胶原(ColⅣ)水平明显下降(P＜0.05).结论 成功构建具有抑制功能的RAGE反义RNA腺相关病毒载体,为进一步研究RAGE的作用机制,以及基因治疗RAGE相关疾病提供一个重要工具.     

质粒型甲病毒复制子载体系统的构建及其功能鉴定

目的 构建质粒型甲病毒复制子载体系统,并对其功能进行鉴定.方法 在XJ-160病毒感染性cDNA克隆的基础上,将病毒非结构基因序列分为三个片段扩增,分步克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游,并用多克隆位点序列替代病毒的结构基因构建XJ-160病毒质粒型复制子载体.将病毒核蛋白基因及包膜糖蛋白基因分别克隆至pVAX1 CMV启动子下游构建载体的两个辅助质粒.通过绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因的表达检验该质粒型载体系统的功能特性.结果 成功构建了包括复制子载体和辅助质粒的质粒型甲病毒复制子载体系统,且该复制子载体系统可成功表达绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因.结论 本研究构建了能够表达外源基因的质粒型甲病毒复制子载体系统,为目标基因表达、重组病毒颗粒制备等奠定了基础.     

血友病A基因治疗载体研究现状

血友病A是X染色体隐性遗传出血性疾病.其发病原因是患者血液中先天缺乏凝血因子F Ⅷ.用于血友病A基因治疗研究的载体有病毒载体和非病毒载体,目前研究较多的是病毒载体,主要有逆转录病毒载体和慢病毒载体,腺病毒载体及腺相关病毒载体等.非病毒载体主要有质粒、脂质体、转座子等.文章拟对血友病A基因治疗各载体的特点和研究进展作一综...     

表达反义c-myc RNA的重组逆转录病毒载体对人胰腺癌细胞恶性表型的逆转作用

为研究表达反义c－mycRxA的逆转录病毒载体抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型逆转的机理，利用PXTI逆转录病毒载体构建了一个能表达反义c－mycRNA的质粒，经病毒包装细胞PA317包装后，使之成为具有感染力的重组病毒。用该病毒感染人胰腺癌细胞系PC－2细胞，经G418筛选得到稳定的转化细胞系。Northernblot杂交证实包装细胞PA317及转化的PC－2细胞中均有病毒的高表达，体外合成的单链RNA探针杂交结果表明转化PC－2细胞中有高表达的反义c－mycRNA，而内源性c－mycRNA的表达明显受抑；Westernblot分析发现c－myc癌基因产物P62蛋白的表达显著下降。反义c－mycRNA使人胰腺癌细胞生长速率、~3H-胸腺嘧啶掺入、软琼脂集落形成能力以及探鼠致瘤能力等均明显下降。实验结果表明：表达反义c－mycRNA的逆转录病毒载体能有效地抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型部分逆转。     

慢性乙型肝炎基因治疗研究进展

随着分子生物学尤其是基因工程技术的发展,抗乙型肝炎基因治疗已有了广泛而深入的研究。利用基因重组、反义核酸等技术在细胞甚至分子水平上的研究表明,基因治疗在抗乙肝病毒(HBV),抑制病毒复制等方面有着很好的作用。本文将着重对近年来抗乙肝病毒治疗基因的筛选以及外源治疗基因的载体投递系统方面的研究进展进行综述。     

慢性乙型肝炎基因治疗研究进展

随着分子生物学尤其是基因工程技术的发展，抗乙型肝炎基因治疗已有了广泛而深入的研究。利用基因重组、反义核酸等技术在细胞甚至分子水平上的研究表明，基因治疗在抗乙肝病毒（HBV），抑制病毒复制等方面有着很好的作用。本文将着重对近年来抗乙肝病毒治疗基因的筛选以及外源治疗基因的载体投递系统方面的研究进展进行综述。     

纳米基因载体的研究现状

基因治疗正成为当今医学研究的热门课题,载体问题是制约基因治疗成功的关键.目前,常用的载体包括病毒载体和非病毒载体,后者以其无病毒毒性和免疫原性等优越性而倍受瞩目.随着纳米生物技术的发展和多种纳米材料的涌现,以纳米颗粒为基础的非病毒基因载体倍受研究者推崇.综述了纳米基因载体的研究现状,重点总结阐述了阳离子聚合物、无机纳米颗粒及磁性纳米颗粒载体系统,并探讨了其在应用研究方面的现状和前景.     

非病毒型基因载体的生物安全性

近年来,基因载体的生物安全性越来越受到人们的关注,本文介绍了近年来非病毒型基因载体生物安全性的研究进展,综述了非病毒型基因载体的毒性、纳米效应、血液相容性以及免疫反应等方面的研究成果.     

非病毒载体介导Mn-SOD基因在小鼠肝脏的高表达

目的:研究非病毒载体介导Mn-SOD基因在小鼠肝脏的转染效率。方法:构建Mn-SOD真核表达质粒gWiz/Mn-SOD,通过肠系膜上静脉分支注射阳离子脂质体/质粒混合物,采用RT-PCR、Westernblot、SOD活力测定以及免疫组织化学染色等方法,观察小鼠肝脏Mn-SOD基因表达情况。结果:经肠系膜上静脉分支注射质粒/脂质体混合物几乎不对肝脏造成损伤,注射后8h即可检测到小鼠肝脏有明显的外源性Mn-SODmRNA和蛋白表达;转染前及转染后72h肝细胞线粒体SOD活性分别是(29±17)U/g和(272±56)U/g(P<0.01);免疫组化显示小鼠肝细胞转染率达70%。结论:阳离子脂质体可介导非病毒载体gWiz/Mn-SOD在小鼠肝脏高效安全表达。     

HSV-1扩增子病毒载体介导rGDNF的体外表达

Ⅰ型单纯疱疹病毒 (ＨｅｒｐｅｓＳｉｍｐｌｅｘＶｉｒｕｓ 1,ＨＳＶ 1)载体有嗜神经性 ,是神经系统基因治疗中最有前途的载体之一。ＨＳＶ 1扩增子载体质粒只含有ＨＳＶ 1病毒的复制和包装所必需的顺式元件和要转移的目的基因以及细菌质粒骨架。扩增子病毒包装所需的反式元件由辅助病毒 (如ＨＳＶ 1温度敏感突变株ｔｓＫ)或含病毒基因组的质粒ＤＮＡ提供。扩增子质粒ＤＮＡ滚环复制形成首尾串联的、长度高达 15 0ｋｂ的线状ＤＮＡ ,而被包装入病毒毒粒中 ,成为一种含有多拷贝串联质粒的、有感染性的假病毒[1] 。本研究在我们以前的工作基础…     

柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒的构建

目的：构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。方法：用RT-PCR技术，从柯萨奇B4病毒中钓取非结构蛋白P2C cDNA片段，克隆入PUCan-T载体，转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒。结果：以柯萨奇B4病毒的总RNA为模板，扩增出987bp大小的片段，克隆入PUCan-T载体，用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，与非结构蛋白P2C的PCR扩增产物片段大小一致。结论：成功地构建了柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。     

非病毒型载体介导基因转染

基因载体是制约基因转移技术发展的关键。近年来,非病毒载体由于其安全、低毒、低免疫原性等特点而备受青睐。文章以脂质体和聚乙烯亚胺为代表,介绍了非病毒载体的性质、介导转染的机制。随着人们对细胞转染机制了解的深入以及生物材料科学的迅速发展,非病毒型载体将有望实现高效、低毒、靶向特异等特点,从而成为基因治疗中的理想载体。     

基于辛德毕斯病毒载体的重组丙肝病毒颗粒的制备与鉴定

目的 利用自主研发的辛德毕斯病毒载体构建含有丙型肝炎病毒( HCV)结构蛋白E1E2的重组病毒颗粒.方法 将编码HCV包膜糖蛋白的E1 E2基因克隆至辛德毕斯病毒载体,构建重组质粒pBR-XJE1E2和pVA-XJE1E2,转染BHK-21细胞后获得重组丙肝病毒颗粒.并通过RTPCR、间接免疫荧光和Western Blot方法鉴定表达E1E2蛋白的重组病毒颗粒.结果 酶切、PCR和测序分析表明重组质粒构建成功.RT-PCR、间接免疫荧光和Western-Blot鉴定结果表明重组质粒转染细胞后能包装出表达E1E2的丙肝病毒颗粒.结论 以辛德毕斯病毒载体为基础构建的重组质粒可在真核细胞中包装出重组丙肝病毒颗粒,这为进一步研究其在动物体内免疫反应奠定了基础.     

基于非病毒载体的mRNA疫苗递送系统研究进展

mRNA疫苗是一类新型核酸疫苗。它具有通用性、开发迅速以及制造成本低等优点,目前已被广泛用于传染性疾病防治和癌症治疗的研究。但mRNA在体内的不稳定性和低表达限制其在临床的应用,因此开发出能高效转染mRNA的递送载体十分关键。目前的基因递送载体分为病毒载体和非病毒载体。本文对现有递送mRNA的非病毒载体进行综述,并对mRNA疫苗及其非病毒载体的研究前景进行展望。     

慢病毒和质粒作为shRNA载体沉默人卵巢癌RhoA基因效果的比较

目的 研究慢病毒和质粒作为RNA干扰载体在沉默卵巢癌RAS同源基因家族成员A(RhoA)基因表达方面的差异.方法 分别将慢病毒及质粒载体携带的针对RhoA基因的siRNA序列感染或转染卵巢癌HO8910细胞,经过嘌呤霉素筛选建立稳定沉默RhoA基因的细胞株.通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR、Western blot法、血管形成实验、细胞划痕实验研究两种载体随着细胞培养代数的增加在抑制卵巢癌RhoA基因表达及侵袭和转移能力上的差异.结果 采用质粒载体及慢病毒载体分别建立人RhoA基因稳定沉默卵巢癌细胞株,通过荧光显微镜观察,质粒组细胞绿色荧光蛋白的表达率随培养代数的增加而下降;第15代、第25代时表达率分别为70％、45％,而慢病毒组细胞绿色荧光蛋白表达率维持在95％以上,实时荧光定量PCR及Western blot法发现质粒组和慢病毒组细胞在第3代时RhoA mRNA及蛋白的表达无明显差异;随培养代数的增加,慢病毒组RhoA mRNA及蛋白持续低表达,而质粒组RhoA mRNA及蛋白的表达逐渐增高;细胞划痕实验及血管形成实验表明慢病毒较质粒作为载体介导siRNA对RhoA基因沉默更能持续稳定地抑制卵巢癌细胞的侵袭、转移(P＜0.05).结论 慢病毒较质粒作为载体介导RNA干扰能更好沉默目标基因的表达.     

反义阻断hREV3基因表达抑制MNNG诱发的 非定标性突变的发生率

目的 :ＲＥＶ3基因是酵母中发现的具有跨损伤修复活性的ＤＮＡ聚合酶 ,参与真菌易误性复制后修复通路。本研究采用反义核酸技术建立ｈＲＥＶ3基因表达阻断的人胚肾细胞系 ,研究它与非定标突变形成的关系。方法 :1 ｈＲＥＶ3基因片段从ｐＢＳ -ｈＲＥＶ3反向重组入载体ｐＭＡＭｎｅｏ -ａｍｐ 构建真核反义诱导表达质粒。 2 重组质粒转染ＨＥＫ2 93细胞 ,Ｇ41 8全培养基筛选建立ｈＲＥＶ3基因表达阻断细胞系。 3 细胞系生长速率及ＭＮＮＧ敏感性检测 :以ｈＲＥＶ3基因表达反义阻断细胞系为实验组 ,转染有空载体的细胞系以及母本细胞系为对…     

呼吸道病毒基因反义技术的研究进展

反义寡核苷酸是一段与mRNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子。本文通过对呼吸道病毒特异性反义寡核苷酸的作用位点、序列设计、生物利用度（化学修饰、载体运用等）的讨论为抗呼吸道病毒新型药物的研究提供一条新途径。     

呼吸道病毒基因反义技术的研究进展

反义寡核苷酸是一段与mRNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子.本文通过对呼吸道病毒特异性反义寡核苷酸的作用位点、序列设计、生物利用度(化学修饰、载体运用等)的讨论为抗呼吸道病毒新型药物的研究提供一条新途径.     

人神经生长因子β亚基慢病毒载体的构建

背景：糖尿病神经源性膀胱的发病与神经生长因子缺乏有关,β亚基是构成神经生长因子(NGF)3种亚基中惟一具有生物活性的亚基,慢病毒载体是基因治疗的理想载体。 目的：构建过表达人神经生长因子β亚基(β-NGF)基因的慢病毒载体。 方法：通过目的基因的获得,载体质粒双酶切,载体质粒与目的基因的连接将人β-NGF基因克隆到慢病毒载体质粒pGC-FU中,构建重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF。观察人β-NGF基因的克隆情况,并进行重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF的PCR鉴定和测序。 结果与结论：构建的重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF进行PCR实际获得的产物与预计PCR产物大小一致,即初步判断为构建成功的重组质粒。所获得的β-NGF基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。说明pGC-FU-β-NGF中携带有正确的β-NGF基因。结果证实,实验成功构建了携带人β-NGF基因的重组慢病毒载体质粒。     

反义技术在抗HBV感染中的应用

反义技术是近些年来随着现代分子生物学技术的发展而产生的新的生物医学治疗技术.它采用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因组的技术手段,包括反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰等.反义分子通过与靶基因异性互补配对结合,阻断靶基因的复制、转录或翻译过程,从而发挥抗病毒作用.针对乙型肝炎病毒的反义技术也有了广泛而深入的研究.根据反义技术在分子、细胞以及动物水平上的研究表明:反义技术能够高效、特异地抑制HBV的复制与表达.