组织工程骨神经化构建的组织学研究

[目的]通过观察不同神经束植入组织工程骨后组织学的变化,探讨组织工程骨神经化构建的效果.[方法]将新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs )进行诱导分化为成骨细胞,与β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)复合制作组织工程骨,分别将不同类型神经束植入组织工程骨,进行以下分组:A组,组织工程骨组; B组,感觉神经束植入组; C组,运动神经束植入组; D组,血管束(含有自主神经)植入组; E组,感觉、运动神经束联合植入组.分别用于修复兔股骨1.5 cm大段骨缺损;各组分别在12周进行组织学的Masson染色,降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)的免疫组织化学检测,并进行统计学分析,以比较骨缺损修复情况.[结果]在观察期内,有感觉神经植入的组别和血管束植入的组别在组织学上具有明显骨化作用,而运动神经束植入却没有明显的促进作用.[结论]感觉神经束和血管束具有明显的促组织工程骨成骨作用,可以作为组织工程骨神经化构建的一种方法.     

植入感觉神经束和血管束的组织工程骨修复兔股骨缺损对神经激肽1受体和血管活性肠肽受体1表达的影响

目的研究植入了感觉神经束和血管束的组织工程骨修复兔股骨缺损对神经激肽1受体(neurokinin1receptor,NK1R)和血管活性肠肽受体1(vasoactive intestinal peptide type1receptor,VIPR1)表达的影响。方法 5月龄健康新西兰大白兔54只,抽取髂骨红骨髓,全骨髓贴壁筛选法分离、培养BMSCs。取第3代BMSCs成骨诱导培养7d后,与β磷酸三钙支架复合培养制备组织工程骨。将54只兔制备单侧股骨1.5cm缺损模型,随机分成3组(n=18),分别在修复缺损的组织工程骨侧槽中植入感觉神经束(A组)、股血管束(B组),以及空白对照(C组)。术后4、8、12周各组分别处死6只兔,对修复骨段进行大体观察、X线片检查成骨情况,提取总RNA行实时荧光定量PCR检测NK1R mRNA和VIPR1mRNA的表达情况,并行免疫组织化学染色检测NK1R和VIPR1的表达情况。结果大体观察和X线片检查均显示A、B组成骨情况优于C组。各组X线片评分随时间延长逐渐升高。术后4周B组X线片评分高于A、C组(P0.05),A、C组间差异无统计学意义(P0.05);术后8、12周A、B组X线片评分高于C组(P0.05);A、B组间差异无统计学意义(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示各组NK1R mRNA和VIPR1mRNA的表达量均于术后8周达峰值,各时间点间表达量差异均有统计学意义(P0.05);各时间点A、B组NK1R mRNA和VIPR1mRNA表达均高于C组(P0.05),B组高于A组(P0.05)。免疫组织化学染色显示,各组NK1R和VIPR1的阳性表达均在术后8周最强,且A、B组的表达强于C组。结论血管束植入法可以替代感觉神经束植入法构建血管、神经化组织工程骨,并能促进神经肽受体的表达,避免因感觉神经束植入导致支配区的感觉缺失,是一种较理想的复合组织工程骨构建方法 。     

Ⅰ型胶原凝胶包埋脂肪干细胞复合PLGA-β-TCP支架修复兔自体桡骨缺损

目的 采用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋兔脂肪干细胞并复合PLGA-β-TCP支架修复自体桡骨缺损。方法 使用Ⅰ型胶原凝胶悬浮兔脂肪干细胞并与PLGA-β-TCP复合构建脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(ASCs-COL/PLGA-β-TCP)(A组),同时设立单纯细胞/PLGA-β-TCP材料复合体(ASCs/PLGA-β-TCP)(B组)、单纯Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(COL/PLGA-β-TCP)(C组)、单纯PLGA-β-TCP支架材料(D组)以及空白缺损(E组)作为对照,体外成骨诱导培养2周后植入桡骨1.5cm缺损部位。30只兔(60侧)采用两因素随机区组设计每只兔两侧骨缺损植入组别。分别于术后8、16、24周处死兔,取材,进行相关分析。结果 术后8周,大体观察、放射学、组织学检测示A组桡骨断端连续性基本恢复。术后16周,A组骨断端连续性完全恢复,髓腔未通。术后24周,A组髓腔再通,改建塑形趋于完成,材料基本降解。自术后16～24周,A组残存材料比例低于其他3组(P＜0.05,n=4);与A组比较,在整个观察周期内,B、C、D组均无明显成骨现象,E组保持骨缺损状态(P ＜0.05,n=4)。结论 通过应用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋脂肪干细胞进而与PLGA-3-TCP多孔支架材料复合构建新型仿生骨组织工程复合体,可修复兔桡骨1.5 cm缺损。     

神经植入对大段组织工程骨成骨影响的早期实验研究

目的 研究在组织工程骨内植入神经束对大段组织工程骨成骨的影响以及初步探讨促进成骨的机制.方法 48只新西兰大白兔,随机分为4组:A组,单纯组织工程骨组;B组,组织工程骨+运动神经束植入组(股神经肌支);C组,组织工程骨+感觉神经束植入组(隐神经);D组,组织工程骨+感觉、运动神经束联合植入组.每只动物均在右侧股骨制备长1.5 cm的节段性骨与骨膜缺损,钢板固定后在骨缺损处分别植入四种方法制备的组织工程骨.术后4、8、12周行大体观察、X线观察、新生骨组织定量观察成骨效果,降钙素基因相关肽(CGRP)及S-100蛋白的免疫组化染色观察其在组织工程骨内的分布,并行半定量分析.结果 在组织工程骨内植入感觉神经后,比单纯组织工程骨和运动神经束植入的修复效果均有明显提高.而在组织工程骨中植入运动神经与单纯组织工程骨修复效果无明显差异,感觉神经植入与感觉、运动联合植入的成骨效果无明显差异.免疫组化染色显示神经肽类物质CGRP、S-100在C组与D组中的表达高于A组与B组,差异有统计学意义.结论 在组织工程骨内植入感觉神经在早期可促进成骨,而植入运动神经未见促进作用, 其机制可能是植入的感觉神经在组织工程骨内分泌神经肽所致.     

不同培养时间β-磷酸三钙/骨髓基质干细胞组织工程骨在兔脊柱后外侧融合中的作用研究

目的 探讨β-磷酸三钙/骨髓基质干细胞( β-TCP/BMSCs)组织工程骨培养不同时间对兔脊柱后外侧融合的作用.方法 分离培养BMSCs并经体外成骨诱导后接种至β-TCP上,分别培养1、3、7d后植入新西兰大白兔体内,行脊柱后外侧融合.利用噻唑蓝、扫描电镜、荧光染色等方法观察体外细胞活力和生长情况;术后12周处死动物,行X线、显微-CT、组织学及组织形态计量学检测,观察新生骨形成和融合情况. 结果 1、3、7d组细胞活力分别为(0.19±0.02) A/g、(0.48±0.06) A/g、(0.61±0.05) A/g,3组间两两比较差异均有统计学意义(F=175.570,P=0.000).扫描电镜及荧光染色显示细胞生长良好;术后12周ld组X线评分、脊椎融合率、BMC、BV/TV、新生骨面积百分比均低于于3、7d组,差异均有统计学意义(P＜0.05),但3、7d组比较差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 β-TCP/BMSCs组织工程骨培养时间明显影响兔脊柱后外侧融合效果,但融合效果并不随培养时间延长而明显提高,提示培养时间存在“临界值”.     

3D打印β-磷酸三钙负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物抗结核药物缓释微球细胞毒性及对BMSCs成骨分化影响的研究

目的研究3D打印技术制备的β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)支架负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide),PLGA]抗结核药物缓释微球的细胞毒性及对BMSCs成骨分化的影响。方法通过复乳溶剂挥发法制备异烟肼、利福平/PLGA缓释微球,3D打印技术制备β-TCP支架,用离心震荡法将微球负载于支架上制备复合材料。采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取第3代细胞分别与成骨诱导培养液(A组)、PLGA抗结核药物缓释微球浸提液(B组)、3D打印β-TCP支架浸提液(C组)、3D打印β-TCP负载PLGA抗结核药物缓释微球复合材料浸提液(D组)共培养。采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞毒性;茜素红染色观察钙沉积情况;实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RTq PCR)检测成骨相关基因ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)的表达。结果 CCK-8法检测示,随培养时间延长A、B、C、D组吸光度(A)值逐渐增加;培养24、48、72 h时,A值按A、C、B、D组顺序递减,除B、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。细胞毒性评价为0～2级,毒性实验合格。成骨诱导21 d茜素红染色示,各组均有红色矿化结节形成,但矿化结节数量C组D组A组B组。RT-q PCR检测示,随培养时间延长,A、B、C、D组OCN和BSP基因相对表达量均呈逐渐增加趋势;ALP基因相对表达量于7、14 d时呈增高趋势,21 d时有所降低。培养7、14、21 d时ALP、OCN和BSP基因相对表达量均为C组D组A组B组,各时间点各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 3D打印β-TCP负载PLGA抗结核药物缓释微球复合材料对BMSCs无明显细胞毒性,同时在一定程度上促进其向成骨细胞分化。     

绿色荧光蛋白基因转染示踪比格犬体内骨髓间充质干细胞分化

目的运用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察骨组织工程中种子细胞的变化和转归。方法使用重组腺病毒(Ad-GFP)将GFP基因转染比格犬骨髓间充质干细胞(BMSC),倒置相差显微镜下观察BMSC形态、碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色情况;荧光显微镜下观察细胞GFP表达状况。待细胞标记成功后将其离心,接种于β-磷酸三钙(β-TCP)上,回植于比格犬胫骨内侧骨膜囊内,构建组织工程骨记为A组;单纯β-TCP植入对称胫骨内侧骨膜囊记为B组;单纯β-TCP植入皮下记为C组。术后2周取材,分别行组织学观察、免疫组化检测,同时激光共聚焦显微镜下观察GFP表达情况。结果体外成骨诱导实验显示,ALP染色以及茜素红染色阳性。组织学观察可见,A组新生骨组织以及新生血管均较B组明显,C组未见新生骨组织。免疫组化检测显示,A组Ⅰ型胶原、血小板内皮细胞黏附分子CD31染色阳性;B组Ⅰ型胶原、CD31染色部分阳性;C组未见阳性表达。免疫组化半定量检测显示,A、B两组Ⅰ型胶原、CD31定量有统计学差异(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察结果显示,A组新生骨组织内可见GFP表达,B、C组未见GFP标记细胞。结论 BMSC是组织工程骨早期形成的重要来源,但周围成骨细胞并非新生骨组织主要来源;移植BMSC于骨膜下可促进新生血管形成。     

内皮祖细胞促进组织工程骨体内成骨

目的探讨自体外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)体内微血管化组织工程骨,并促进BMSCs成骨的能力。方法分离培养并鉴定1~9号新西兰大耳兔外周血来源EPCs及BMSCs;取第3代细胞分3组:单纯EPCs(A组)、单纯BMSCs(B组)及共培养细胞(C组,EPCs∶BMSCs=1∶2),分别复合至包被纤维粘连蛋白的部分脱蛋白生物骨支架上构建组织工程骨,4 d后将A、B、C组组织工程骨分别自体异位移植于右上肢、左上肢、右下肢肌袋内(2块/肢体),于移植后2、4、8周大体观察组织工程骨生长情况;取材行HE染色并计算骨长入率;行CD34、CD105、紧密连接蛋白1(zonula occludens protein 1,ZO-1)免疫组织化学染色,并比较各组各时间点各因子表达量变化。结果成功分离1~9号兔外周血EPCs及BMSCs,免疫荧光染色鉴定EPCs为CD34、CD133及血管性血友病因子阳性,BMSCs为CD29、CD90阳性,CD34阴性。3组自体细胞成功复合至部分脱蛋白生物骨支架并异位移植。2、4、8周大体观察示,随时间延长,包绕各组组织工程骨的软组织逐渐增多、增厚,切缘与组织工程骨分界不清,原组织工程骨孔隙逐渐被填充,C组最明显,组织工程骨内可见迂曲血管网形成。HE染色示各组组织工程骨内毛细血管及胶原纤维逐渐增多,4、8周组织工程骨骨长入率C组明显高于A、B组(P0.05),B组高于A组(P0.05)。免疫组织化学染色示,随时间延长,3组组织工程骨CD34、CD105、ZO-1表达量均逐渐增多,组内各时间点间比较差异均有统计学意义(P0.05);移植后2周,C组CD105表达量高于A、B组(P0.05);4、8周3组间CD34、CD105、ZO-1表达量两两比较差异均有统计学意义(P0.05),各因子表达量C组均最多,B组最少。结论自体外周血EPCs与BMSCs按1∶2比例共培养后具有协同作用,可促进组织工程骨血管化及成骨。     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

β-磷酸三钙复合骨髓间充质干细胞修复山羊骨软骨缺损的实验研究

目的将β-磷酸三钙（β-TCP）与山羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合后,在生物反应器中分别向成软骨和成骨诱导,并植入骨软骨缺损处,观察软骨修复效果。方法分离、培养山羊BMSCs,在生物反应器中分别向成软骨及成骨诱导2周,植入骨软骨缺损部位。实验组分为A组：旋转力刺激＋成软骨、成骨诱导组（力学刺激组）,B组：单纯成软骨、成骨诱导组（无力学刺激组）,并设空白对照组。术后12周和24周进行大体观察、组织学染色等,并行O＇Driscoll Keeley and Salter评分。结果 A、B组均有新生软骨形成;A组软骨在12周与24周均优于B组（P〈0.05）;术后12、24周A组评分优于B组,差异有统计学意义（P〈0.05）。对照组无新生软骨形成。结论将BMSCs复合于β-TCP,可用于组织工程修复骨软骨缺损;体外培养阶段的旋转力刺激有利于改善组织工程软骨的质量。     

单纯血管束、神经束分别植入组织工程骨修复兔骨缺损对降钙素基因相关肽和神经肽Y表达的影响

目的 比较单纯血管、神经束分别植入组织工程骨修复兔骨缺损对神经肽降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)和神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)表达影响. 方法 36只新西兰大白兔,随机平均分为3组:A组为组织工程骨+股血管束植入,B组为组织工程骨+感觉神经束植入,C组为单纯组织工程骨.每只动物均在右侧股骨制作长1.5 cm的段缺性骨与骨膜缺损,钢板固定后分别用以上方法修复大段骨缺损.术后3、6、12个月行免疫组化染色检测修复骨段内的CGRP和NPY的表达,并采用图像分析软件行半定量分析. 结果 CGRP和NPY的表达量在A、B、C 3组均随时间推移而增多(P=0.000),在3个月时A组较B组多(P=0.000),但在6个月和12个月时A组和B组的表达量无明显差异(P>0.05).A、B两组在3、6、12个月时的表达最均较C组多(P=0.000). 结论 与单纯神经束植入组相比,单纯血管束植入组织工程骨修复兔骨缺损在术后3个月可以明显促进CGRP和NPY表达,但后期两组对神经肽表达的影响作用无明显差异.     

新型骨组织工程β-TCP／CPPF／PLLA支架复合BMSCs修复节段性骨缺损的影像学研究

目的：将自体骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）接种到β-TCP／CPPF／PLLA支架上,进行体外复合培养,构建组织工程人工骨,植入兔桡骨大段骨缺损模型中,评估BMSCs／β-TCP／CPPF／PLLA复合体促进成骨的作用。方法：用新西兰大白兔40只,随机分为BMSCs／β-TCP／CPPF,PLL复合物组（A组）、β-TCP／CPPF／PLLA支架组（B组）、空白对照组（C组）共三组,建立兔桡骨双侧大段骨缺损模型,相应植入自体细胞材料复合物和单纯支架材料,空白对照组不作任何处理。术后4、8、12、16周处死动物,摄X线片观察骨缺损修复情况。结果：X线检查结果：A组术后2周可见缺损处有散在的、少量的模糊状骨痂生成,术后4周可见明显的骨生成影像,成云雾状,均匀分布在骨缺损区,术后8周整个缺损区均可见到骨痂生成,成骨现象较4周更加明显,部分髓腔已通,术后12～16周,缺损区已完全为新生的骨组织充填,骨髓腔已完全再通,修复区比正常的桡骨较细。B组、C组术后2～16周,虽有不同程度的成骨现象,但没有完全修复骨缺损区,B组较C组修复明显。X线评分结果：A组在各时期均明显高于B组,差异具有显著性（P〈0．01）。结论：自体BMSCs与β-TCP／CPPF／PLLA复合物移植能修复大节段的骨干缺损。     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

雪旺细胞促进组织工程骨修复大鼠股骨损的实验研究

目的 探讨雪旺细胞(SCs)对β-磷酸三钙/骨髓基质干细胞诱导分化的成骨细胞(β-TCP/BDOB)组织工程骨修复大鼠股骨缺损的影响. 方法 将SD大鼠骨髓基质于细胞(BMSCs)诱导分化为BDOB,并从SD乳鼠中提取SCs.将36只SD大鼠随机分为3组,每组12只,分别将术前预种植SCs的β-TCP/BDOB组织工程骨(A组)、β-TCP/BDOB组织工程骨(B组)、单纯β-TCP材料(C组)植入大鼠体内修复长度为8 mm的股骨缺损.于术后12周行X线摄片、组织学检查和显微CT扫描观察各组股骨缺损部位新生骨质的形成情况. 结果 术后12周X线片和显微CT扫描结果显示:A组大鼠股骨缺损已完全愈合,B组大鼠股骨缺损部分愈合,C组大鼠股骨缺损未愈合.A组、B组、C组的X线影像学评分平均分别为(12.08 ±0.90)、(9.25±1.06)、(6.17±1.12)分,3组比较差异有统计学意义(F=99.553、P=0.000),3组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).组织学检查结果显示:A组植入物中有大量骨质形成,广泛分布肥大的软骨细胞与成骨细胞;B组植入物中也可见散在新生骨形成,软骨细胞与成骨细胞散在稀疏分布;C组植入物中新生骨质形成极少,几乎未见软骨细胞或成骨细胞. 结论 SCs可提高β-TCP/BDOB组织工程骨修复大鼠股骨缺损的效果.     

低氧与低氧模拟剂对BMSCs成骨分化影响的对比研究

目的对比低氧培养与常氧条件下低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠BMSCs成骨分化的影响。方法原代分离培养健康3~4周龄昆明小鼠BMSCs,采用流式细胞术对细胞CD29、CD44、CD90、CD34表面标志进行检测,行成骨、成脂、成软骨诱导分化染色鉴定。取第3代BMSCs分为对照组(A组,常氧条件下培养)、低氧培养组(B组,1%O2低氧条件下培养)及DMOG干预组(C组,常氧条件下加入0.5 mmol/L DMOG培养)。分别于培养1、2、3、4 d采用MTT法检测BMSCs增殖情况,7、14 d检测ALP含量,24 h后采用Western blot法检测低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)蛋白表达,3、7 d采用实时荧光定量PCR检测RUNX2、Osterix基因表达,21 d行茜素红染色观察。结果 BMSCs流式细胞术表面标志鉴定示CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)、CD34(-);成骨、成脂、成软骨诱导分化后茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色均呈阳性。MTT法检测示,培养1 d,3组细胞增殖比较差异无统计学意义(P0.05);2、3、4 d,与A组比较,C组均抑制细胞增殖,但差异无统计学意义(P0.05);而B组则促进细胞增殖,差异有统计学意义(P0.05)。培养各时间点,B、C组ALP含量、HIF-1α蛋白相对表达量及RUNX2、Osterix基因相对表达量均显著高于A组,ALP含量及RUNX2、Osterix基因相对表达量C组高于B组,而HIF-1α蛋白相对表达量B组高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。培养21 d茜素红染色示,A组可见少许结节状红染物质,B组可见中等量红染物质,而C组可见大量红染物质。结论低氧能明显促进BMSCs增殖,DMOG对BMSCs增殖无明显影响;低氧与DMOG均能促进BMSCs成骨分化,且DMOG促BMSCs成骨分化能力更强。     

神经植入对大段组织工程骨成骨效果的一年观察

目的 观察在组织工程骨内植入神经束后大段组织工程骨的长期成骨效果.方法 新西兰大白兔64只,随机分为四组:A组,单纯组织工程骨组;B组,运动神经束植入组(股神经肌支);C组,感觉神经束植入组(隐神经);D组,感觉、运动神经束联合植入组.每只动物均在左侧股骨制作长1.5 cm的段缺性骨与骨膜缺损,钢板固定后在骨缺损处分别植入四种方法制备的组织工程骨.术后1、3、6、12个月行大体观察、X线和组织学定量观察成骨情况. 结果 术后1、3、6个月时,在组织工程骨内植入感觉神经或联合植入两种神经后,比单纯组织工程骨和运动神经束植入的修复效果均有明显提高.术后12个月时,各组骨再生情况基本一致,但新生骨组织出现一定程度的吸收,其外观较正常股骨细,新生骨组织与兔股骨牢固愈合,并开始塑形且出现髓腔再通. 结论 在组织工程骨内植入感觉神经可促进成骨,而植入运动神经未见促进作用;组织工程骨可以修复兔大段骨缺损;该实验新生骨组织的吸收可能与模型的制作方法有关.     

脂肪干细胞/Ⅰ型胶原凝胶/聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三钙骨组织工程复合体的构建及其异位成骨研究

目的 构建基于脂肪干细胞、Ⅰ型胶原凝胶以及聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三钙支架(PLGA-β-TCP)的骨组织工程复合体并对其异位成骨进行研究.方法 设计构建脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(A组),同时设立单纯细胞/PLGA-β-TCP材料复合体(B组)、单纯Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(C组)以及单纯PLGA-β-TCP支架材料(D组)作为对照.扫描电镜、相差显微镜观察细胞材料复合情况并对脂肪干细胞增殖以及成骨分化进行分析.体外成骨诱导培养2周后移植于自体股部肌袋,8周后取出,依次行放射学、组织学定性及半定量分析.结果 (1)体外成骨诱导2周,A组细胞增殖率慢于B组(P<0.05,n=4),但其细胞总数远高于后者(P<0.01,n=4).A组碱性磷酸酶(ALPase)活性、细胞外基质矿化程度均显著高于B组(P<0.01,n=4).A组细胞悬浮于Ⅰ型胶原凝胶并均匀分布于材料孔隙中而B组细胞仅见黏附于材料表面.(2)移植8周,X线片示A组高密度钙化影形成,B、C、D组未见有阳性结果.A组材料孔隙中均匀充满新生骨组织,可观察到骨小梁样结构.B组仅在少数孔隙中有类骨组织形成,同时伴有结缔组织长入.A组新生骨面积百分比显著高于B组(P<0.01,n=4).结论 通过应用Ⅰ型胶原凝胶来实现脂肪干细胞与PLGA-β-TCP多孔支架材料的均匀复合,能够有效促进脂肪干细胞在材料孔隙中的成骨分化及均质骨组织形成.     

hBMSCs诱导分化类髓核细胞

目的 探讨人椎间盘细胞和关节软骨细胞的分子表型差异,分析hBMSCs经TGF-β,和BMP-7联合诱导后能否分化为软骨细胞和髓核细胞.方法 取9例自愿捐赠者髂嵴骨髓20～40 mL分离培养hBMSCs.取第4代hBMSCs行三维微球培养.根据基础培养基中加入的生长因子不同,实验分成4组,分别为加入10 ng/mL TGF-β3组(A组)、200 ng/mL BMP-7组(B组)、同时加入两种生长因子组(C组)以及空白对照组(D组).于培养后21 d,行组织学及免疫组织化学观察:于培养后4、21 d进行PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达.结果 培养后21 d,HE染色示A组和C组细胞呈软骨细胞样形态特征,甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色Ⅱ型胶原表达呈阳性.B组和D组细胞形态无明显改变,PCR检测示培养后21 d,A、C组SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原表达较4 d时明显增加(P＜0.05).B、D组Ⅰ型胶原表达较4d时明显增加(P＜0.05),SOX9、蛋白多糖及Ⅱ犁胶原较4d时无明显变化(P＞0.05).其中仅A组X型胶原表达呈阳性.结论 TGF-β,和BMP-7联合应用能促进hBMSCs分化更接近于椎间盘细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞.     

软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体修复兔膝关节骨软骨损伤

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的软骨细胞与聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)-Ⅱ型胶原支架通过管帽结构复合构建组织工程软骨复合体修复兔膝关节骨软骨损伤的效果及各界面耦合情况。方法BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后接种于PLGA-Ⅱ型胶原支架的底层,支架表层戴管帽。将该细胞-支架复合物置入软骨条件培养液中培养2周,扫描电镜观察。将45只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组,每组15只,并于股骨髁处造模。分别于缺损处植入戴管帽结构复合的软骨支架复合体(A组)、PLGA-Ⅱ型胶原支架(B组)、不植入任何材料(C组)。于第4周和第12周取材行大体观察和组织学分析。结果 A组和B组缺损处均有软骨生成;C组缺损明显,只有纤维组织生长。A组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复;两者耦合处犬牙交错,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于B、C组。软骨组织学评分A组优于B、C组(P0.05)。结论 BMSCs诱导分化成的软骨细胞与PLGA-Ⅱ型胶原支架经过管帽结构构建成的软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体可有效修复兔膝关节骨软骨损伤,新生软骨、骨与宿主软骨、骨及新生软骨与软骨下骨各界面耦合良好。