两种去除血清高丰度蛋白方法的比较

目的比较乙腈沉淀法和MERCK公司的血清白蛋白和IgG去除试剂盒去除人血清中高丰度蛋白的效果。方法应用乙腈沉淀法和MERCK公司的血清白蛋白和IgG去除试剂盒对血清样品进行处理,Tricine-SDS-PAGE电泳和SELDI-TOF-MS检测去除高丰度蛋白的效果。结果乙腈沉淀法能在去除血清高中丰度蛋白的同时收获更多的10kD以下的小分子量蛋白,MERCK公司的试剂盒也能有效地去除血清高中丰度蛋白,特异性较好。结论2种方法均能去除血清中高丰度蛋白,需根据研究目的选择适合的方法。     

乙腈、乙醇、色谱柱去除血清高丰度蛋白方法的比较

目的比较乙腈沉淀法、乙醇沉淀法和多重亲和去除色谱柱Human 14法去除人血清中高丰度蛋白的效果。方法应用乙腈沉淀法、乙醇沉淀法和多重亲和去除色谱柱Human 14法对血清样品进行处理,Bis-Tris Mini Gels电泳和双向凝胶电泳检测去除高丰度蛋白的效果。结果从一维胶电泳图灰度值分析,血清经过乙腈法、色谱柱法、乙醇法处理后,白蛋白条带灰度值由原血清的19分别变成157.2,40.8和8.2;从2-DE电泳图分析看出,多重亲和去除色谱柱Human 14法处理后的蛋白点数显著增多,比原血清增加了137个;乙腈法和乙醇法处理后虽然蛋白点减少了,却有低丰度蛋白质点显现出来。结论乙腈沉淀法能在去除血清中高丰度蛋白的同时收获更多的10kD以下的小分子量蛋白;乙醇沉淀法虽然能去除部分高丰度蛋白,但小分子量蛋白的收获量较少;而多重亲和去除色谱柱Human 14法不仅能有效地去除血清中高丰度蛋白的干扰,且保留了大量的小分子量蛋白。     

人血清中小分子蛋白质分离电泳方法改进

目的建立一种灵敏易行分离分子量〈10000 Da低丰度蛋白质的电泳方法。方法用Hitrap Blue层析柱去除血清中白蛋白,用U9对血清样品进行变性处理,采用改进后的方法（0.1%甲醇,0.5%三氯乙酸,0.1%考马斯亮蓝G250）进行染色。结果经去除血清中的白蛋白、对样品进行变性处理及改进染色方法后,分辨率和灵敏度明显提高,可有效分离10000 Da以下的小分子蛋白质。结论改进后的电泳方法,不仅简便灵敏,而且还有利于蛋白质的洗脱回收。     

相对定量质谱技术检测血清标志物方法部分关键点的优化对比和探讨

目的对iTRAQ结合质谱相对定量检测血清标志物实验关键点进行优化。方法采用正常人血清样本,对iTRAQ-LC-MS/MS检测血清标志物实验过程中,多种低丰度蛋白除盐浓缩方法、低丰度蛋白定量方法以及点靶仪反相洗脱效果进行比较。结果三种除盐浓缩方法中,蛋白除盐柱处理后所得蛋白得率最高(P0.01);五种蛋白定量方法中,Nanodrop2000测试仪测定低丰度蛋白的方法耗时最少,偏离度最小(P0.01);两种反向C18分离柱中,Magic柱洗脱效果更佳。结论优化后的实验条件有利于提高血清样本中蛋白的检出率。     

三氯乙烯药疹样皮炎差异血清蛋白的筛选及鉴定

目的 筛选并鉴定三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)暴露者、TCE药疹样皮炎急性期及恢复期差异血清蛋白.方法 收集TCE暴露者血清(Ⅰ组)、TCE药疹样皮炎急性期患者血清(Ⅱ组)和TCE药疹样皮炎恢复期患者血清(Ⅲ组)各5份,各组血清样本等量混合,去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白后经除盐处理并定量.采用双向凝胶电泳技术对上述3组混合血清分别进行蛋白分离,银染后扫描成像,用ImageMaster Platinum 2D 5.0软件进行分析,筛选差异蛋白,并应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定.结果 经去除高丰度蛋白和除盐处理后获得了分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,处理后血清蛋白检出量增至(300±12)个.经MALDI-TOF-MS鉴定得到5个差异蛋白,分别为:补体4b、载脂蛋白A-Ⅰ、载脂蛋白C-Ⅲ、载脂蛋白C-Ⅱ和转甲状腺素蛋白.补体4bⅢ组相对Ⅰ组表达量为1.352 88,表达上调.Ⅱ组相对Ⅰ组血清中载脂蛋白C-Ⅱ相对表达量为1.512 14,表达上调;载脂蛋白A-Ⅰ、载脂蛋白C-Ⅲ和转甲状腺素蛋白相对表达量分别为-1.601 17、-1.034 49、-1.313 35,表达有所下调.结论 筛选的差异蛋白功能与机体免疫及肝功能异常有关,为阐明TCE致TCE药疹样皮炎作用机制及筛选相关生物标志物提供了重要信息.     

人血清中小分子蛋白质的电洗脱回收

[目的]建立一种快速简便的回收分子量﹤10000 Da低丰度蛋白质的电洗脱方法。[方法]采用改进后的聚丙烯酰胺凝胶电泳和电洗脱方法分离纯化小分子标志蛋白,利用SELDI技术检测回收后的标志蛋白。[结果]SELDI技术检测发现,改进后的电泳和电洗脱方法能有效分离并回收10000 Da以下的低丰度蛋白质。[结论]改进后的电洗脱方法,不仅快速简便,而且还有利于蛋白质的后续鉴定。     

烟雾病相关血清蛋白标志物筛选及鉴定

目的筛选烟雾病血清差异蛋白,并研究其在烟雾病中的作用,为可能的烟雾病分子靶向治疗提供依据。方法于2015年12月—2017年3月分别收集烟雾病病人血清11份与正常人血清20份,去除Ig G、白蛋白等高丰度蛋白,胰蛋白酶酶切后i TRAQ标记,液相分离后质谱检测,筛选血清差异蛋白。筛选出TGF-β1后进行酶联免疫吸附试验(ELISA)验证。结果总共鉴定了202个烟雾病相关的血清差异蛋白,其中13个蛋白上调,7个蛋白下调,ELISA结果验证了维生素D结合蛋白(D6RF35)在烟雾病病人血清中表达水平异常升高(1.22±0.48,P0.05),辅酶Q10B(Co Q10B)血清中含量明显降低(0.81±0.25,P0.05);工作特征曲线(ROC)表明COQ10B曲线下面积(AUC)(AUC=71.4%)优于D6RF35(AUC=61.7%)。结论 COQ10B是烟雾病人潜在的血清标志蛋白,在其发病中可能起到关键作用,效果优于D6RF35。     

辐照对小牛血清中牛腹泻病毒去除效果评价

新生小牛血清是生物制品生产中一种重要的原材料,是细胞培养中不可缺少的营养成分,小牛血清的质量直接影响生物制品质量.国家在新版<中国药典>中对小牛血清质量提出了严格的检测标准,其中病毒外源因子检测是重要的指标之一.尽管小牛血清经过多级过滤系统的过滤,达到了去除细菌和支原体目的,但病毒等外源因子因分子量小仍无法去除.     

超高效液相色谱-串联质谱法检测大鼠血浆中白当归脑及其药代动力学研究

目的建立大鼠血浆中白当归脑的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定方法,并用于白当归脑的药代动力学研究。方法以地西泮为内标,采用UPLC BEH C_(18)柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)为分离柱,以乙腈-0.1%甲酸为流动相,进行梯度洗脱,流速为0.4 ml/min。乙腈沉淀法去除蛋白处理大鼠血浆样本,用电喷雾离子源(ESI),正离子检测,MRM模式对白当归脑进行定量分析。结果在1 ng/ml～200 ng/ml浓度内,该方法线性关系良好(r0.995),定量限为1 ng/ml。日内精密度11%,日间精密度12%,准确度在92.0%～108.7%,回收率89.6%,基质效应在85.9%～95.8%。结论该分析方法灵敏、快速、选择性好,可应用于白当归脑大鼠药代动力学研究。     

单纯性室间隔缺损血清标志蛋白的筛选

目的应用蛋白质组学表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱技术筛选单纯性室间隔缺损血清标志蛋白,为从蛋白质分子水平研究其致病机理奠定基础。方法用CM10芯片检测56例单纯性室间隔缺损患儿、85例儿科常见病患儿及23例其它先天性心脏病患儿血清,分析血清蛋白质谱,筛选室间隔缺损血清标志蛋白。结果有25个蛋白成分在三组之间具有统计学差异,其中,与儿科常见病对照组相比,11个蛋白成分在VSD血清中高表达,14个下调;与其它先天性心脏病组相比,14个蛋白成分在VSD血清中高表达,11个下调。结论表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱技术可能是发现与筛选室间隔缺损血清标志蛋白的快速、有效的蛋白质组学工具。     

白蛋白在新生儿疾病中的临床应用

白蛋白又称清蛋白，是一种中分子量的胶体。呈球状，能于水。血清白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质，占血清总蛋白的50￥以上，在血液中具有多种重要的药理作用，现将白蛋白在新生儿疾病中的应用综述如下：     

微污染地表水的组合微滤工艺处理

目的考察用粉末活性炭-膜生物反应器(PAC-MBR)组合工艺处理微污染地表水的出水水质,并分析造成膜污染的主要物质的分子量范围。方法常规项目采用国家环保局颁布的标准检测方法。用空间排阻液相色谱法(SE-LC)测定分子量分布,将膜污染物的分子量分布与进水、混合液和出水的分子量分布进行对比,确定主要膜污染物质的分子量范围。结果经该组合工艺处理后,出水的浊度和耗氧量(CODMn)均可达到《生活饮用水水质卫生规范》(2001)的要求,且该工艺对氨氮也有良好的去除。结论大分子物质是造成膜污染的主要物质,且其从混合液中的去除主要通过膜分离来实现,粉末活性炭(PAC)和生物作用对去除分子量在500~10 000 Dalton之间的物质较为有效。     

饮食诱导肥胖与肥胖抵抗大鼠血清差异蛋白筛选

目的:探讨高脂饲料诱导的肥胖(diet-inducedobesity,DIO)与肥胖抵抗(diet-inducedobesityresistance,DIO-R)大鼠不同易感性的差异及血清中蛋白表达。方法:健康雄性SD大鼠40只,随机分为基础组和高脂饲料组,分别给予基础饲料和高脂饲料5w后,参照Levin等的方法建立动物模型,按照体重增加量排序,位于体重上1/3的大鼠筛选为肥胖大鼠,位于体重下1/3的大鼠筛选为肥胖抵抗大鼠。处死动物,收集血清样品检测各组相关指标的差异,并应用SELDI蛋白质芯片技术检测DIO与DIO-R大鼠血清蛋白的差异表达。结果:DIO大鼠体重﹑体脂比﹑血糖﹑血脂均与DIO-R大鼠有显著性差异。由蛋白质芯片检测图可见,在分子量2～100ku范围内,分子量为7945和9513的蛋白峰在DIO大鼠和DIO-R大鼠血清中存在差异;分子量为6256、6267、4496的蛋白峰在DIO-R大鼠和基础组大鼠血清中存在差异。结论:SD大鼠对高脂饮食诱导的DIO和DIO-R存在易感性差异,应用SELDI蛋白质芯片技术筛选出了DIO大鼠与DIO-R大鼠血清差异蛋白,为以后进行蛋白质分离﹑纯化及鉴定提供依据。     

乳清蛋白水解法及其多肽对KKAy小鼠血糖的影响

目的研究乳清蛋白的水解方法,并观察其水解多肽对KKAy糖尿病小鼠的降血糖作用。方法采用碱性蛋白酶水解乳清蛋白,透析后检测其水解度、含氮量、氨基酸含量、多肽图谱、质谱分析,并进行动物实验,检测其对KKAy小鼠糖耐量、空腹血糖和随机血糖以及血清胰岛素水平的影响。结果乳清蛋白水解多肽水解度为14.8%,含氮量68.2%,多肽分子量分布在900-1900,大部分集中在1800-1900。乳清蛋白水解多肽能降低灌胃后KKAy糖尿病小鼠血糖、显著升高灌胃后0.5h血清胰岛素水平。结论乳清蛋白水解多肽能有效降低KKAy小鼠空腹血糖、随机血糖和改善糖耐量。     

超高效液相色谱-串联质谱同时检测大鼠血浆中羟基安非他酮、羟基美托洛尔、1-羟基咪达唑仑、对乙酰氨基酚和羟基甲苯磺丁脲

目的以地西泮为内标,使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定大鼠血浆中羟基安非他酮、羟基美托洛尔、1-羟基咪达唑仑、对乙酰氨基酚和羟基甲苯磺丁脲。方法血浆样品用乙腈沉淀法去除蛋白,色谱分离采用UPLC BEHC_(18)(2.1 mm×50 mm,1.7μm)柱,流动相为乙腈-水(含0.1%甲酸)梯度洗脱,采用电喷雾多反应监测模式定量。结果日间和日内精密度13%,准确度为94.5%～107.2%,提取回收率在83.2%～92.6%。血浆标准曲线在1 ng/ml～1 000 ng/ml浓度内呈线性,相关系数(r)0.997。结论该方法可用于5种CYP450亚型探针药物给药后的代谢产物药代动力学研究。     

人外周静脉血血清蛋白质双向凝胶电泳条件优化

目的优化人外周静脉血血清蛋白质的双向凝胶电泳条件。方法血清总蛋白经去除白蛋白、IgG和丙酮沉淀去盐分处理后,固相pH梯度等电聚焦(IEF)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行蛋白质电泳,对蛋白质的上样量、固相pH梯度(IPG)胶条的pH值范围、凝胶浓度、水化上样液体积和IEF程序及其参数等条件进行优化。结果将50～100μg蛋白质溶解于终体积为350μl水化上样液,应用pH4～7的IPG胶条和浓度12%的SDS-PAGE凝胶进行双向电泳,经优化电泳电流、时间等参数后,建立了合适的双向凝胶电泳条件,得到比较理想的蛋白质二维图谱。结论优化了血清蛋白质双向凝胶电泳条件,为进一步开展血清差异蛋白质组学研究奠定基础。     

淋球菌膜蛋白疫苗的研究

目的 :设计淋球菌膜蛋白疫苗并构建原核表达系统 ,测定表达蛋白的免疫活性。方法 :PCR扩增淋球菌膜蛋白( PIA)基因片段 ,构建重组质粒 ,重组质粒宿主菌经 IPTG诱导 ,用 SDS- PAGE分析 PIA的表达情况。淋球菌标准株免疫 BAL B/c小鼠 ,体外凝集检测动物血清的免疫效果及 EL ISA法检测 PIA的免疫活性。结果 :成功构建表达 PIA蛋白的重组质粒 ,SDS-PAGE电泳图上显示 1条相对分子量 ( Mr)约为 4 0 KDa的新生条带 ,能与免疫血清发生特异性结合反应。结论 :淋球菌膜蛋白疫苗原核表达系统的设计和构建正确 ,表达蛋白 PIA具有免疫活性 ,为淋病疫苗的开发奠定了基础     

苍白密螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫反应性分析

目的 表达苍白密螺旋体(梅毒螺旋体)黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫反应性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础.方法 通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲合层析柱纯化重组蛋白,Western-印迹检测其免疫反应性.结果 成功构建了PET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子量约为26×103的融合蛋白,其表达产物占全菌总蛋白的＞30%,并且主要可溶性形式存在;Western-印迹检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性.结论 重组表达的Tp0751黏附蛋白为可溶性蛋白,且具有良好的免疫反应性,为进一步研究其在Tp0751黏附蛋白在梅毒致病过程中的作用和其生物学功能奠定了基础.     

十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法定量分析镉接触工人尿蛋白

本实验测定了33例镉接触工人,45例正常人和5例慢性肾炎患者的夜间卧床期间尿样。以双缩脲法测定尿蛋白浓度;以分光光度扫描仪扫描固定于SDS-PAGE凝胶上的各区带染料,测定尿样中不同分子量蛋白的经例。尿蛋白SDS-PAGE图型分为正常型(生理型)、低分子量型、中分子量型及中高分子量型。镉接触工人组的尿蛋白排泄量、尿低分子量(MW≤4万)蛋白的比例和排泄量的均值均高于正常人组(P<0.01,P<0.001,P<0.01)。     

妊娠期糖尿病患者腹部皮下脂肪组织中高分子量脂联素的表达变化及调控机制

目的分析妊娠期糖尿病患者腹部皮下脂肪组织中高分子量脂联素的表达变化及调控机制。方法选取2016年3月-2018年3月在华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科行剖宫产分娩的20例正常妊娠女性(正常妊娠组)和20例GDM患者(GDM组)为研究对象。应用RT-PCR方法测定脂联素多聚化相关基因mRNA表达水平,应用Western blot检测高分子量脂联素表达水平。结果与正常妊娠组比较,GDM组脂肪组织中内质网氧化还原酶1-Lα(Ero1-Lα)、二硫键氧化还原酶A类似蛋白(Dsb A-L)表达水平显著降低,内质网蛋白44 (ERp44)表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P0. 05)。正常妊娠组和GDM组脂肪组织中高分子量脂联素表达水平比较差异有统计学意义(P0. 05)。结论脂肪组织通过抑制脂联素多聚化基因Ero1-Lα、Dsb A-L的表达,减少高分子量脂联素的表达,在GDM发病机制中发挥重要作用。