3D打印β-磷酸三钙负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物抗结核药物缓释微球细胞毒性及对BMSCs成骨分化影响的研究

目的研究3D打印技术制备的β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)支架负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide),PLGA]抗结核药物缓释微球的细胞毒性及对BMSCs成骨分化的影响。方法通过复乳溶剂挥发法制备异烟肼、利福平/PLGA缓释微球,3D打印技术制备β-TCP支架,用离心震荡法将微球负载于支架上制备复合材料。采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取第3代细胞分别与成骨诱导培养液(A组)、PLGA抗结核药物缓释微球浸提液(B组)、3D打印β-TCP支架浸提液(C组)、3D打印β-TCP负载PLGA抗结核药物缓释微球复合材料浸提液(D组)共培养。采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞毒性;茜素红染色观察钙沉积情况;实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RTq PCR)检测成骨相关基因ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)的表达。结果 CCK-8法检测示,随培养时间延长A、B、C、D组吸光度(A)值逐渐增加;培养24、48、72 h时,A值按A、C、B、D组顺序递减,除B、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。细胞毒性评价为0～2级,毒性实验合格。成骨诱导21 d茜素红染色示,各组均有红色矿化结节形成,但矿化结节数量C组D组A组B组。RT-q PCR检测示,随培养时间延长,A、B、C、D组OCN和BSP基因相对表达量均呈逐渐增加趋势;ALP基因相对表达量于7、14 d时呈增高趋势,21 d时有所降低。培养7、14、21 d时ALP、OCN和BSP基因相对表达量均为C组D组A组B组,各时间点各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 3D打印β-TCP负载PLGA抗结核药物缓释微球复合材料对BMSCs无明显细胞毒性,同时在一定程度上促进其向成骨细胞分化。     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

具有开放孔结构的左旋聚乳酸/卵磷脂多孔支架的制备及成骨性能研究

目的探讨具有开放孔结构的左旋聚乳酸[poly(L-lactic acid),PLLA]/卵磷脂多孔支架的制备方法及成骨性能。方法采用热致相分离法制备含不同比例卵磷脂(0、5%、10%、20%、30%、40%、50%)的PLLA/卵磷脂多孔支架(分别对应为A、B、C、D、E、F、G组)。扫描电镜观察各支架表面形貌;广角X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)和差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)检测各支架结晶度;测量各组支架吸水率;采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测小鼠BMSCs在各支架表面的增殖情况;通过检测ALP活性观察小鼠BMSCs在各组支架上的成骨分化能力。最后使用SD大鼠颅骨缺损模型观察含不同比例卵磷脂的支架在动物体内的骨修复情况,采用Micro-CT对缺损处进行三维模型重建,并对缺损处的新生骨体积和骨矿物密度进行定量分析。结果扫描电镜观察示,卵磷脂会导致支架孔径略微缩小;当卵磷脂含量为50%时,支架表面会出现片状结构。广角XRD和DSC检测示,支架结晶度随卵磷脂含量的升高而逐渐降低。亲水性测试示,随着卵磷脂含量增加,支架的亲水性逐渐增强。CCK-8法检测示,随培养时间增加,BMSCs在各组支架上均有明显增殖;培养7 d时,C、D、E、F组吸光度(A)值显著高于A、B、G组(P0.05),C、D、E、F组间比较差异无统计学意义(P0.05)。成骨诱导14 d时,随卵磷脂含量增加,各组ALP活性出现了显著差异,D、E、F、G组ALP活性显著高于A、B、C组(P0.05)。大鼠颅骨缺损修复实验中,Micro-CT检测及新生骨体积和骨矿物密度结果均显示,含30%卵磷脂支架修复效果最佳。结论通过热致相分离法制备的PLLA/卵磷脂多孔支架的细胞相容性、成骨分化性能及骨修复能力显著强于单纯PLLA支架;卵磷脂含量适宜的PLLA/卵磷脂多孔支架有望作为骨组织工程支架材料。     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

新型多孔PLGA/HA复合支架体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石(PLGA/HA)支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行体外矿化诱导培养,扩增后与实验A组(含5%HA的PLGA/HA),实验B组(含10%HA的PLGA/HA)及对照C组(仅含PLGA)分别进行体外复合培养;并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性。比较分析各组之间的差异。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长,经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节,A、B组细胞的粘附及增殖能力均强于C组(P<0.05),A、B组之间无差异。结论兔BMSCs与新型多孔PLGA/HA支架材料有良好的相容性。     

新型多孔PLGA/HA复合支架体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔聚乳酸乙醇酸／羟基磷灰石（PLGA/HA）支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞（BMSCs）进行体外矿化诱导培养，扩增后与实验A组（含5％HA的PLGA／HA），实验B组（含10％HA的PLGA／HA）及对照C组（仅含PLGA）分别进行体外复合培养；并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力，验证细胞材料复合体的成骨活性。比较分析各组之间的差异。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长，经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节，A、B组细胞的粘附及增殖能力均强于C组（P〈0．05），A、B组之间无差异。结论兔BMSCs与新型多孔PLGA／HA支架材料有良好的相容性。     

壳聚糖/胡须/磷酸钙骨水泥复合生物材料的力学性能及对诱导多能干细胞成骨潜能的影响

目的观察新型强化型磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)生物支架材料的力学性能以及对诱导多能干细胞(induced potential stem cells,i PS)生物活性及成骨潜能的影响。方法根据制备的支架材料不同,将实验分为4组,A组为单纯CPC支架组,B组为CPC∶10%wt壳聚糖为2∶1比例混合支架组,C组为CPC∶10%wt壳聚糖∶胡须为2∶1∶1比例混合支架组,D组为CPC∶10%wt壳聚糖∶胡须为2∶1∶2比例混合支架组。检测各组支架材料力学性能(抗弯强度、断裂功、硬度及弹性模量)。与第5代i PS-MSCs复合培养1、3、7、14 d采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测各组吸光度(A)值;1、7、14 d行ALP活性检测、Live/Dead荧光染色及定量检测、RT-PCR检测成骨基因ALP、Runx2、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白(osteocalcin,OC)及BMP-2表达;1、7、14、21 d行茜素红染色观察。取3月龄雄性SD大鼠24只,建立8 mm颅骨骨缺损模型,随机分为4组(n=6),分别植入对应的4组支架材料,术后8周取材行HE染色观察骨缺损修复情况,并检测新生骨体积百分比和新生血管密度。结果 B、C、D组抗弯强度、断裂功、弹性模量及硬度均显著高于A组,C、D组高于B组,D组高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。CCK-8法检测示随培养时间增加,细胞活性逐渐增加,3、7、14 d时B、C、D组A值均显著高于A组,C、D组高于B组(P0.05),C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。Live/Dead荧光染色示,7、14 d时B、C、D组活细胞比例均显著高于A组(P0.05),7 d时C、D组显著高于B组(P0.05);RT-PCR检测示,7、14 d时B、C、D组各基因相对表达量均显著高于A组,C、D组显著高于B组(P0.05),C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05);茜素红染色示随培养时间延长,各组支架材料表面的红色钙盐沉积均逐渐加深变厚,14、21 d时B、C、D组A值均显著高于A组,C、D组高于B组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。动物体内修复实验显示,各组新生骨主要填充于支架材料间隙中,成骨细胞和新生血管被基质中的新生骨组织包围,成骨细胞排列在新生骨边界上,B、C、D组新生骨显著多于A组,C、D组显著多于B组。B、C、D组新生骨体积百分比和新生血管密度均显著高于A组,C、D组高于B组,差异有统计学意义(P0.05);C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。结论复合壳聚糖、胡须和CPC制备的新型强化型复合生物支架材料的机械性能明显优于单纯CPC支架材料,可满足皮质骨及松质骨的机械性能要求。i PS-MSCs在新型强化型复合生物支架材料上黏附、增殖,骨组织修复效果良好,可满足骨植入材料的生物活性及成骨活性要求。     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

多巴胺表面修饰/负载软骨源性形态发生蛋白1的3D打印聚己内酯-羟基磷灰石三维多孔支架促进人BMSCs成软骨分化的实验研究

目的探讨利用3D打印技术制备、经多巴胺表面修饰及负载软骨源性形态发生蛋白1(cartilage derived morphogenetic protein 1,CDMP1)的聚己内酯(polycaprolactone,PCL)-羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)三维多孔支架,体外诱导人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)成软骨分化的可行性。方法采用3D打印技术制备PCL-HA支架,经多巴胺表面修饰后,将CDMP-1负载于支架上,扫描电镜观察支架表面微结构,并检测孔隙率和水静态接触角。体外成软骨分化实验:分为A、B、C 3组,A组为PCL-HA支架,B组为多巴胺表面修饰的PCL-HA支架,C组为多巴胺表面修饰及负载CDMP-1的PCL-HA支架;将h BMSCs植入3组支架,成软骨诱导培养后比较细胞黏附率、细胞增殖(MTT法)和细胞活性(Live/Dead染色法),并采用实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的基因表达。结果 3组支架均呈三维多孔圆柱体状,孔洞相互联通,孔径为400~500μm,孔隙率为56%,材料纤维走向为0°/90°。经多巴胺表面修饰后,支架颜色由初始的白色变为棕色;水静态接触角也由76°降为0°。体外培养24 h,A、B、C组细胞黏附率分别为34.3%±3.5%、48.3%±1.5%、57.4%±2.5%,比较差异均有统计学意义(P0.05)。Live/Dead染色显示3组细胞均有较好的细胞活性。MTT检测显示各组h BMSCs均生长良好,吸光度(A)值随培养时间延长而增大;培养4、7、14、21 d时,C组A值显著高于A、B组,B组高于A组,差异均有统计学意义(P0.05)。随培养时间延长,3组Ⅱ型胶原mRNA和Aggrecan mRNA表达均持续增加;培养7、14、21 dⅡ型胶原mRNA相对表达量及培养14、21 d Aggrecan mRNA相对表达量,C组均显著高于A、B组,B组高于A组,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论采用3D打印技术制备、经多巴胺表面修饰及负载CDMP-1的PCL-HA三维多孔支架,体外与hB MSCs共培养,可促进细胞黏附、增殖及成软骨分化。     

血小板裂解液对大鼠BMSCs成骨分化的干预效应

目的 观察血小板裂解液(platelet lysate,PL)对大鼠BMSCs成骨诱导分化的干预效应.方法 成年健康清洁级Wistar大鼠24只,体重250～300 g,雌雄不限.取16只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备PL,ELISA法测定PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量.另取8只大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BMSCs,取第4代细胞按1×104/cm2接种行成骨诱导培养.按诱导培养液的不同,实验分为3组,A、B组基础诱导培养基中分别含终浓度为5%和1%的PL,C组仅含基础诱导培养基.倒置相差显微镜动态观察各组细胞形态变化及生长状况;诱导培养7d,各组行ALP染色;诱导培养2、8、10d,ALP/总蛋白含量确定ALP活性;诱导培养20 d,茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析.结果 PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量分别为(300±30)、(140±25)、(80±35)和(70±20)pg/mL.倒置相差显微镜观察,各组BMSCs形态逐渐发生改变,出现类成骨细胞样形态特征;A组细胞形态变化不及B、C组明显,但细胞增殖较快:20 d A组细胞仍密集生长,ECM中形成的矿物沉积显著少于B、C组.诱导培养7 d,A组细胞胞浆中有少量颗粒,ALP染色呈弱阳性;B、C组细胞胞浆中有大量棕褐色颗粒,ALP染色呈强阳性.诱导培养2、8、10d,ALP活性定量分析示A组显著低于B组和C组(P<0.05).诱导培养20d,茜素红染色显示A、B、C组钙结节数量分别为(7.67±1.10)、(12.87±0.81)和(15.59±1.25)个;矿化结节面积分别为(161 778.70±44 550.80)、(337 349.70±56 083.24)和(415 921.70±71 725.39)像素;A组均明显低于B组和C组(P<0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 PL 是多种生长因子的承载体系,以剂量依赖方式抑制BMSCs成骨诱导中ALP活性和矿化结节形成.     

BMSCs条件培养基改善地塞米松对成骨细胞成骨功能抑制效应的研究

目的探讨BMSCs的旁分泌作用对地塞米松所致成骨细胞成骨功能抑制作用的影响。方法首先通过培养小鼠BMSCs 24 h制备无血清条件培养基备用。将小鼠MC3T3-E1细胞株复苏并传至第3代用于实验,分为4组:A组为对照组;B组于细胞中添加1μmol/L地塞米松;C组于细胞中按1∶1比例添加1μmol/L地塞米松和BMSCs条件培养基;D组仅添加BMSCs条件培养基。培养24 h后收集细胞测定ALP含量,Western blot测定细胞内RUNX2、骨钙素(Osteocalcin)蛋白表达,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)测定细胞内α1-Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ-α1,COL1A1)、RUNX2、ALP、Osteocalcin基因表达;21 d后行茜素红染色观察钙结节形成情况。结果培养24 h后,B、C、D组ALP含量均显著低于A组,B组低于C、D组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,B组RUNX2蛋白相对表达量显著低于A、C、D组(P0.05),A、C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05);B组Osteocalcin蛋白相对表达量均显著低于A、C、D组,A、C组低于D组(P0.05),A、C组间差异无统计学意义(P0.05)。RT-q PCR检测示,B、C、D组RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因相对表达量均显著低于A组(P0.05);D组RUNX2、Osteocalcin、ALP基因相对表达量均显著高于B、C组,C组显著高于B组(P0.05);D组COL1A1基因相对表达量显著高于B组(P0.05),B、C组间及C、D组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。培养6 d时A组细胞死亡;21 d时B、C、D组均可见钙结节阳性染色,且逐渐增强。结论小鼠BMSCs条件培养基能改善地塞米松对成骨细胞成骨功能的抑制效应。     

多孔双相陶瓷复合重组人骨形态发生蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子缓释微球的生物相容性

目的 观察复合重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)缓释微球的多孔双相陶瓷(BCP)组织相容性.方法 A组(rhBMP-2+bFGF缓释微球/BCP)、B组(单纯BCP)、C组(bFGF缓释微球/BCP)、D组(rhBMP-2缓释微球/BCP)和E组(不含BCP).其中bFGF、dlBMP的浓度各为5、15μg,材料均为5 mm×5 mm×1mm.采用体外细胞培养的方法测定细胞黏附能力、浸提液对于兔骨髓基质细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响及体外诱导BMSCs成骨分化的能力.结果 细胞在材料上黏附、生长良好.各组噻唑蓝(MTT)吸光度值、碱性磷酸酶(ALP)值均随培养时间的延长而增大.A组与B、D和E组比较对MSC有显著的促增殖作用,但低于C组(P<0.05).A组ALP活性显著高于B、C和E组,但低于D组(P<0.05).结论 复合rhBMP-2和bFGF缓释微球的BCP具有良好的生物相容性.     

微管仿生人工骨对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

[目的]研究不同微管结构仿生人T骨对犬骨髓基质细胞（BMSCs）增殖和分化的影响。[方法]仿生人工骨分为正交结构（A组）和同心结构（B组），以磷酸钙骨水泥（CPC）／重组人骨形成蛋白2（rhBMP-2）（C组）、单纯CPC（D组）为对照组：梯度密度离心法获取犬骨髓单个核细胞，取第3代与人工骨复合培养。通过荧光显微镜、扫描电镜观察细胞在人工骨表面附壁和生长情况；以MTT实验检测各组细胞增殖能力；测定碱性磷酸酶（ALP）检测BMSCs的成骨活性：[结果]细胞在各组人工骨表面黏附、生长，以A、B组数量较多；MTT法检测显示A、B、C组吸光度（A）值大于D组（P〈0．05）、A、B、C组A值相似（P〉0．05）；ALP测定显示ALP活性A、B组〉C组〉D组（P〈0．05），A、B组间差异无统计学意义（P〉0．05）。[结论]微管结构仿生人工骨与犬BMSCs有良好的生物相容性，是BMP的良好缓释载体，可以促进犬骨髓基质细胞向成骨方向分化.     

壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤的实验研究

目的探讨壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的可行性。方法取成年SD大鼠胫骨及股骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs,并传代。取第3代细胞行表面抗原CD29、CD45鉴定及BrdU标记。采用冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架,并与BrdU标记的第3代BMSCs进行体外共培养;扫描电镜观察细胞黏附情况,MTT法检测支架内细胞生长情况。取50只成年SD大鼠,随机分为A、B、C、D、E组(n=10)。A～D组大鼠采用Feeney自由落体打击致伤原理制备TBI模型,造模后72 h分别移植BMSCs-壳聚糖多孔支架复合体、BMSCs、壳聚糖多孔支架和完全培养基;E组为假手术组。于造模前及造模后1、7、14、35 d,各组大鼠行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS);造模后进行Morris水迷宫测验,包括定位航行测验(造模后31～35 d连续5 d检测潜伏期)及空间探索测验(造模后35 d检测穿越平台次数);造模后36 d取标本行HE染色、BrdU与高分子量神经丝蛋白免疫组织化学双重染色以及BrdU与神经胶质酸性蛋白免疫组织化学双重染色,观察大鼠脑损伤区BMSCs的迁移与分化情况。结果流式细胞仪检测示第3代BMSCs的CD29阳性率为98.49%,CD45阳性率仅为0.85%;扫描电镜示支架-细胞共培养48 h后,BMSCs呈梭形并分泌细胞外基质黏附于支架上;MTT法检测示壳聚糖多孔支架对BMSCs的增殖分化无不良影响。TBI造模后35 d,A组大鼠mNSS评分、定位航行测验的潜伏期显著低于B、C、D组,空间探索测验的穿越平台次数显著高于B、C、D组,差异均有统计学意义(P0.05);A、E组间上述指标比较差异均无统计学意义(P0.05)。HE染色示A组壳聚糖多孔支架已部分降解,其与脑组织融合良好,修复程度优于B、C、D组。免疫组织化学双重染色结果示,A组移植的BMSCs存活、分化为神经元和神经胶质细胞,并迁移至正常脑组织内,修复程度优于B、C、D组。结论壳聚糖多孔支架介导的BMSCs移植能够明显改善大鼠TBI后的神经功能,亦能抑制大鼠脑损伤区胶质瘢痕形成,并可使BMSCs在脑损伤区存活、增殖和分化为神经细胞。     

低氧与低氧模拟剂对BMSCs成骨分化影响的对比研究

目的对比低氧培养与常氧条件下低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠BMSCs成骨分化的影响。方法原代分离培养健康3~4周龄昆明小鼠BMSCs,采用流式细胞术对细胞CD29、CD44、CD90、CD34表面标志进行检测,行成骨、成脂、成软骨诱导分化染色鉴定。取第3代BMSCs分为对照组(A组,常氧条件下培养)、低氧培养组(B组,1%O2低氧条件下培养)及DMOG干预组(C组,常氧条件下加入0.5 mmol/L DMOG培养)。分别于培养1、2、3、4 d采用MTT法检测BMSCs增殖情况,7、14 d检测ALP含量,24 h后采用Western blot法检测低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)蛋白表达,3、7 d采用实时荧光定量PCR检测RUNX2、Osterix基因表达,21 d行茜素红染色观察。结果 BMSCs流式细胞术表面标志鉴定示CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)、CD34(-);成骨、成脂、成软骨诱导分化后茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色均呈阳性。MTT法检测示,培养1 d,3组细胞增殖比较差异无统计学意义(P0.05);2、3、4 d,与A组比较,C组均抑制细胞增殖,但差异无统计学意义(P0.05);而B组则促进细胞增殖,差异有统计学意义(P0.05)。培养各时间点,B、C组ALP含量、HIF-1α蛋白相对表达量及RUNX2、Osterix基因相对表达量均显著高于A组,ALP含量及RUNX2、Osterix基因相对表达量C组高于B组,而HIF-1α蛋白相对表达量B组高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。培养21 d茜素红染色示,A组可见少许结节状红染物质,B组可见中等量红染物质,而C组可见大量红染物质。结论低氧能明显促进BMSCs增殖,DMOG对BMSCs增殖无明显影响;低氧与DMOG均能促进BMSCs成骨分化,且DMOG促BMSCs成骨分化能力更强。     

慢病毒介导骨形态发生蛋白-7基因的干细胞用于组织工程骨构建的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其成骨分化,并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨的可行性.方法 实验分4组:BMP-7和eGFI基因转染组(A组)、eGFP基因转染组(B组)、常规成骨诱导组(C组)、未转染组(D组).用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断转染效率;以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、ELISA检测目的基因表达,四唑盐(MTT)实验检测细胞活力,碱性磷酸酶(ALP)活性和Gomori染色榆测成骨情况;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%.RTPCR检测到A组在1300 bp处出现特异性条带,其他组结果阴性;ELISA检测24 h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/mL,种植支架复合培养8周后BMP-7含量为(76.6±7.4)pg/mL;MTT实验显示细胞活性与未转染组比较差异无统计学意义(P>0.05);ALP活性以16 d最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后黏附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

缺氧状态对骨形态发生蛋白-2诱导分化体外复合富血小板血浆凝胶的骨髓间充质干细胞的影响

目的研究缺氧状态对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化体外复合富血小板血浆(PRP)凝胶的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响。方法取第三代培养的BMSCs细胞与PRP凝胶相混合,通过构建细胞缺氧模型,根据培养条件的不同确定实验分组:常氧BMSCs+PRP组(A组)、常氧BMP-2+BMSCs+PRP组(B组)、低氧BMSCs+PRP组(C组)、低氧BMP-2+BMSCs+PRP组(D组)。反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及Western-blotting检测各组成软骨及成骨基因的表达。结果 RT-PCR检测表明C组和D组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达均较A组和B组明显升高;Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶(ALP)在B组的表达最高;A组与B组runt相关转录因子2(Runx2)的表达较C组和D组明显升高。Western-blotting检测结果表明B组和D组的Ⅱ型胶原表达较A组和C组明显升高;C组与D组的HIF-1α表达较A组与B组显著升高;D组的SOX-9表达较其余3组显著升高。所有结果差异均有统计学意义(P0.05)。结论低氧条件能显著促进BMP-2对BMSCs的成软骨诱导分化,同时抑制BMSCs的成骨分化。HIF-1α可能是这一过程的重要调节因子,其可能通过调节SOX-9的表达来发挥促BMSCs成软骨细胞分化的作用。     

联合培养时诱导的内皮细胞对自体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨由骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的内皮细胞(EC)与自体BMSCs共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离兔BMSCs,培养细胞分为四组：A组(BMSCs组)、B组(BMSCs成骨诱导组)、C组(EC诱导组)及D组(BMSCs和诱导的EC联合培养组),通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性及骨钙素含量从酶学、组织学及生化等不同方面观察诱导的EC对BM- SCs成骨活性及牛长情况的影响。结果细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC。倒置相差显微镜、HE染色均显示EC与BMSCs混合生长良好。MTF检测结果：各组细胞增殖差异无显著性意义(P＞0．05)。碱性磷酸酶活性和骨钙素含量检测结果：D组明显高于其它各组,差异有显著性意义(P＜0．05)。结论由BMSCs诱导的EC能够增强BMSCs的成骨活性,提高BMSCs的增殖能力。     

组织工程骨神经化构建及其修复兔大段骨缺损的实验研究

目的构建功能化组织工程骨是目前骨组织工程研究过渡到临床应用的重要方向。通过组织工程骨的神经化构建,在体内外实验的基础上探讨神经因素在骨组织工程中的作用。方法5～6月龄健康新西兰大白兔54只,雌雄不限,体重2～3kg,从骨髓中分离培养BMSCs;制备兔外周感觉神经匀浆和运动神经匀浆,按1∶10(V/V)加入LG-DMEM培养基,培养第2代BMSCs。对照组以LG-DMEM培养基培养。通过MTT实验、ALP染色和Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色鉴定,观察感觉、运动神经匀浆在体外对BMSCs增殖和成骨分化的影响。将体外经成骨诱导的BMSCs复合β磷酸三钙(βtricalcium phosphate,β-TCP)制备组织工程骨,植入兔体内修复15mm股骨与骨膜缺损。将兔随机分为3组,每组18只,A组在β-TCP生物支架材料的侧槽中植入感觉神经束,B组植入运动神经束,C组为单纯组织工程骨;分别于术后4、8、12周通过X线片、骨密度检测和免疫组织化学染色观察神经化组织工程骨的成骨效应。结果MTT法检测示,各组吸光度(A)值随培养时间延长均逐渐增加,从6d开始,感觉神经组和运动神经组的A值均低于对照组(P0.01);8d和10d时,感觉神经组A值低于运动神经组(P0.05)。培养7d后,感觉神经组和运动神经组ALP染色阳性细胞数均明显少于对照组;培养14d后,感觉神经组和运动神经组的细胞未见Ⅰ型胶原阳性表达,对照组的细胞Ⅰ型胶原表达呈阳性。兔大段骨缺损修复区的术后X线片及Yang评分提示,随着时间延长,各组Yang评分逐步升高,8周后A组评分高于B、C组(P0.01),B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。术后12周骨密度检测显示A组骨缺损修复良好,骨密度值高于B、C组(P0.01),B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。术后12周组织工程骨成骨局部的免疫组织化学染色显示,S-100在A组表达量较高,B组表达量较少,C组偶见表达;降钙素基因相关肽在A组表达量高,B、C组表达量较少。结论感觉、运动神经匀浆抑制BMSCs增殖和成骨分化,神经化组织工程骨的成骨和塑形与感觉神经作用更为密切。