PKH26标记法在组织工程神经种子细胞体内示踪中的应用

目的 探讨PKH26标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)的效果及其应用于组织工程神经种子细胞体内示踪实验的可行性.方法 取Wistar大鼠股骨和胫骨的骨髓,用全骨髓贴壁的方法分离、培养BMSCs.用PKH26荧光染料进行标记,荧光显微镜下观察标记效果,流式细胞仪检测荧光标记率,MTT法测定细胞的活性,体外成脂和成骨诱导鉴定细胞的分化能力,并与未标记细胞进行比较;使用显微注射的方法将BMSCs植入去细胞神经支架内制备成组织工程神经,于体外培养3 d、5 d、7 d、14 d,行组织切片,观察BMSCs在支架内存活、迁移的情况.另外,将体外构建组织工程神经桥接Wistar大鼠坐骨神经15 mm的缺损,于术后1周、4周、6周、8周取出移植物,行组织切片观察植入的BMSCs在支架内的存活情况.结果 PKH26能有效地标记BMSCs,标记率达95%以上,标记后细胞活性及诱导成骨成脂分化能力与未标记细胞无明显差异.在体外培养的环境下,BMSCs能在去细胞神经支架里粘附生长,并沿着支架迁移;在体内外周围神经再生的微环境下,BMSCs可存活8周以上.结论 PKH26荧光染料标记法是一种有效的标记BMSCs的方法,可用于组织工程神经种子细胞体内示踪的研究.     

骨髓内皮祖细胞输注后在肝纤维化大鼠肝脏内的示踪研究

目的 建立PKH26荧光标记肝纤维化大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC)的方法,观察PKH26标记的EPC输注后在肝纤维化大鼠肝内的迁移和分化情况.方法 分离和培养肝纤维化大鼠骨髓源性EPC,并在体外进行PKH26荧光标记,通过荧光共聚焦显微镜观察和采用流式细胞仪检测PKH26的标记率,并观察荧光标记对细胞生长状态的影响;将PKH26荧光标记的EPC经尾静脉输注入肝纤维化大鼠体内,观察其在大鼠肝内的迁移示踪情况,并用免疫荧光法检测内皮细胞标志物CD31和血管性假血友病因子(vWF)的表达.结果 PKH26标记的细胞呈红色荧光,标记率为96.65％;PKH26标记的EPC生长状态良好,与未标记的EPC相比,生长曲线基本一致;EPC迁移入肝后主要存在于沿纤维分布的血管内皮和肝小叶内的窦内皮,并表达内皮细胞特异性抗原CD31和vWF.结论 PKH26可在体外成功标记肝纤维化大鼠骨髓源性EPC,该细胞输注入肝纤维化大鼠体内后,可迁移至肝内血管周围,并向成熟的内皮细胞分化.     

不同标记方法对大鼠骨髓间充质干细胞标记的研究

目的 观察Hoechst33342、BrdU、DAPI对大鼠BMSCs标记情况，比较其标记效果的差异性；培养转基因绿色荧光小鼠BMSCs的，观察细胞生长情况和其荧光持续时间，比较其与荧光标记后的干细胞之间的优越性。方法 贴壁筛选提取大鼠BMSCs，培养至第三代，流式细胞仪检测其表面抗原，成骨、成脂诱导后染色；Hoechst33342、BrdU、DAPI标记大鼠BMSCs，检测标记后的大鼠BMSCs增殖率，显微镜下观察其荧光持续时间；观察转基因绿色荧光小鼠BMSCs在培养不同时间段的细胞形态、荧光持续时间以及同上边3种标记方法比较的优缺点。结果 Hoechst33342、BrdU、DAPI可用于对BMSCs的标记；BrdU标记过程较长，在前期不存在荧光猝灭缺点，标记后经过荧光免疫组化处理后可见阳性细胞，Hoechst33342、DAPI标记过程较短，荧光持续时间较长，但此过程中必须避光，对操作带来了一定的困难。3种方法标记后对细胞增殖率无影响；转基因小鼠BMSCs生长较大鼠干细胞生长较慢，其优点是不用标记且荧光持续时间较长，用于细胞追踪研究更为方便可行。结论 干细胞有多向分化的潜能，因此有很好的研究价值和应用价值，对干细胞进行标记，为干细胞迁移、归巢机制的研究提供更好的研究平台。     

荧光微球体外标记大鼠BMSCs的初步研究

目的通过检测荧光微球655(quantum dot655,QD655)标记SD大鼠BMSCs的体外细胞毒性、细胞增殖、细胞贴附性以及标记率,探讨QD655标记BMSCs及其示踪的可行性。方法收集2周龄健康SD大鼠股骨和胫骨骨髓,贴壁培养BMSCs。取第3代BMSCs采用QD655标记作为实验组,以未标记BMSCs作为对照组,采用锥虫蓝拒染法检测细胞存活率,MTT法观察QD655对细胞增殖性的影响;取实验组BMSCs向成骨诱导分化培养2周,采用茜素红、ALP染色定性鉴定细胞成骨分化能力,实时荧光定量PCR鉴定标记对细胞成骨分化的影响;分别在标记后即刻、1、2、4、6周采用荧光显微镜动态检测实验组BMSCs阳性标记率;扫描电镜观察实验组细胞在胶原/生物活性玻璃复合材料上的贴附性。结果实验组与对照组细胞存活率均90%,比较差异无统计学意义(P0.05);培养1、3、5、7、9d,两组细胞增殖率比较差异均无统计学意义(P0.05)。实验组BMSCs经成骨诱导分化2周后,茜素红及ALP染色均呈阳性,实时荧光定量PCR检测实验组BMSCs的骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原、ALP、BMP-2 mRNA较对照组成倍数高表达。实验组BMSCs标记后即刻阳性标记率达96.50%±1.59%,随着标记时间延长标记率下降,标记后1、2、4、6周标记率分别为93.30%±1.51%、72.40%±2.90%、40.10%±3.60%、10.00%±1.70%,对照组各时间点阳性标记率均为0。扫描电镜观察示实验组标记后细胞和材料贴附良好。结论 QD655对大鼠BMSCs标记时间长,标记率及安全性高,是一种良好标记物。     

骨髓基质干细胞与软骨脱细胞基质多孔支架异位构建组织工程化软骨的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与软骨脱细胞基质多孔支架(cartilage ECM-derived porous scaffold,CEDPS)在裸鼠体内异位构建软骨的可行性,并建立利用PKH26荧光和分子荧光活体成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况的新方法.方法 PKH26荧光标记成软骨诱导的BMSCs,接种入CEDPS支架,体外进行电镜、Desd/Live荧光染色观察,然后植入裸鼠背部,4周后利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行组织学以及Ⅱ型胶原免疫荧光检测,与荧光图像比较.结果 体外培养的BMSCs-CEDPS复合体电镜检查结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞基质分泌增加,Dead/Live染色表明BMSCs在支架内部活性良好.4周后活体荧光示踪显示BMSCs在支架内生长良好,无扩散趋势,BMSCs-CEDPS复合体在裸鼠体内生成软骨样组织,番红"O"、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,免疫荧光检查表明构建的软骨样组织内的细胞来源为接种的PKH26标记的BM-SCs.结论 利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织.PKH26标记与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归.     

PKH26标记结合活体荧光成像技术在椎间盘组织工程研究中的应用

目的体外评估PKH26标记对山羊髓核细胞生物学功能的影响,并结合活体荧光成像系统评价种子细胞在裸鼠体内的生物学行为。方法取1岁龄山羊椎间盘分离髓核组织,通过酶消化法获取原代细胞,倒置相差显微镜下观察,传代获取第1代髓核细胞,行PKH26荧光标记,荧光显微镜下观察标记后的细胞荧光强度,并行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色观察,锥虫蓝染色比较标记前后细胞活性,MTT法检测标记前后细胞增殖特性,实时荧光定量PCR检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达。将标记后的髓核细胞接种至一体化纤维化-髓核支架的髓核部分,纤维环部分作为阴性对照,体外培养3 d后植入5只6周龄雄性裸鼠体内,培养6周后活体成像技术检测髓核细胞-支架复合物在体内的荧光强度及范围。结果倒置相差显微镜观察示原代髓核细胞簇状生长,呈卵圆形,第1代髓核细胞呈类软骨样细胞形态;标记后的第1代髓核细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性;标记后荧光强度均匀,标记前后细胞活性均在95%以上;标记前后细胞生长曲线比较差异无统计学意义(P>0.05);实时荧光定量PCR检测示标记前后细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。活体成像技术显示体内髓核支架有强烈荧光,纤维环支架未见荧光。结论 PKH26标记对髓核细胞的活性、增殖及细胞表型的表达无明显影响,结合体内活体荧光成像系统可以追踪细胞在体内的生物学行为。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究北大核心CSCD

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

脱细胞软骨基质来源的多孔支架复合山羊髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的实验研究

[目的]探讨脱细胞软骨基质多孔支架复合PKH26标记的山羊髓核细胞体内异位构建组织工程髓核的可行性.[方法]制备脱细胞软骨基质来源的多孔支架,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察、天狼星红染色、HE染色观察、MTT毒性检测;分离山羊髓核细胞,通过倒置显微镜观察、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色进行鉴定;将PKH26标记的山羊髓核细胞接种支架上,体外培养3d后进行LIVE/DEAD活性染色,将细胞支架复合物置入裸鼠皮下,培养6周,病理切片,荧光显微镜下观察,进行番红O、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色.[结果]扫描电镜观察支架孔隙相连通且分布均匀,天狼星红染色支架呈黄绿相间色,HE支架淡染,MTT检测细胞增殖曲线无统计学差异(P＞0.05);P1代髓核细胞呈软骨样细胞形态,番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色均阳性,PKH26标记后的细胞呈红色荧光;体外LIVE/DEAD染色细胞呈绿色荧光,体内培养6周后,带红色荧光的细胞填满支架孔隙,番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色弱阳性.[结论]以脱细胞软骨基质多孔支架复合山羊髓核细胞在体内能够形成组织工程髓核样组织.     

体内构建组织工程骨的示踪观察：CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性研究

目的探索组织工程骨体内成骨时,CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性,为种子细胞的体内转归研究提供标记方法。方法分离比格犬BMSCs,成骨诱导至第2代,用荧光染料CM-DiI进行细胞标记。荧光倒置显微镜观察标记后的细胞形态,MTT比色法测定标记前后BMSCs的增殖状况,检测标记前后Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、骨形态发生蛋白（BMP-2）、骨钙素（BGLAP）和骨黏连蛋白（SPARC）的表达。最后,CM-DiI荧光标记后的BMSCs与β-TCP复合共培养后植入比格犬背部皮下,8周后取材,荧光显微镜下观察BMSCs体内转归,HE染色观察异位成骨情况。结果CM-DiI标记后早期细胞呈现红色荧光,48 h后荧光增强,72 h内荧光强度无明显减弱。BMSCs在CM-DiI标记前后细胞形态基本一致,两组间细胞的增殖率无明显差别;标记后RT-PCR检测Col-Ⅰ、BMP-2、BGLAP、SPARC表达,显示标记后的BMSCs亦可向成骨方向分化。扫描电镜检测到标记后细胞在β-TCP上增殖良好,细胞基质分泌丰富。细胞-支架复合物植入比格犬皮下,8周后荧光显微镜观察到标记细胞仍存在,且HE染色可见支架孔隙中有类骨基质沉积。结论CM-DiI对BMSCs的生长增殖、成骨分化无明显影响,对体内组织工程骨中BMSCs的示踪时间可长达8周,可用作体内细胞的长效示踪剂。     

成年恒河猴骨髓基质干细胞的体外培养

目的温对猴骨髓基质干细胞(BMSCs)进行体外培养及扩增，观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点。方法 抽取4只成年猴髂骨骨髓，用全骨髓培养法进行体外培养获得BMSCs，胰酶消化传代，用条件培养基培养传代细胞。逐日倒置显微镜观察细胞生长情况，对传代细胞进行HE染色及碱性磷酸酶(ALP)染色。结果 成年雄性恒河猴BMSCs体外培养生长良好，原代细胞10-13d汇成单层，传代后4～7d长满瓶底。HE染色光镜下观察见BMSCs为单核细胞，细胞呈梭形、多角形，传代细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。结论 猴BMSc的体外培养增殖能力强，可诱导为成骨细胞，可作为灵长类动物骨组织工程的种子细胞。     

CEMP1基因修饰骨质疏松大鼠BMSCs与β-TCP体外复合培养实验

目的探讨牙骨质蛋白1(cementum protein 1,CEMP1)基因修饰骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)与β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)体外复合培养的可行性。方法体外培养骨质疏松大鼠BMSCs,将携带有CEMP1基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP转染BMSCs,采用荧光显微镜观察转染情况,通过流式细胞仪检测转染率,通过实时荧光定量PCR检测转染后BMSCs中CEMP1基因的表达,Western Blot及免疫细胞化学染色检测BMSCs中CEMP1蛋白的表达情况。将CEMP1基因修饰的BMSCs与β-TCP体外复合培养,在荧光显微镜和扫描电镜下观察细胞的生长状况。结果LV-CEMP1-EGFP具有较高的转染率,CEMP1基因修饰的BMSCs可高表达CEMP1,且在β-TCP上保持良好的生长状态。结论CEMP1基因修饰骨质疏松大鼠BMSCs与β-TCP复合培养,有望应用于骨质疏松状态下的牙周组织再生研究。     

低温保存对人骨髓基质干细胞在脱钙骨上体外增殖及成骨能力的影响

目的研究低温保存对人骨髓基质干细胞(BMSCs)在脱钙骨(DBM)上生长特性及成骨能力的影响。方法取3例志愿者骨髓(3～5mL),密度梯度离心、差速贴壁法获得BMSCs。第3代BMSCs在-196℃下保存24h,37℃复苏,测定细胞成活率。低温保存前、后的BMSCs分别用成骨诱导液诱导培养,至90%融合时,收集细胞接种在DBM支架上,并测定细胞在DBM上的粘附率。DiI荧光染料标记BMSCs,例置相差显微镜、荧光显微镜和SEM观察低温保存前、后的BMSCs在DBM上的生长及基质分泌情况,MTT法测定细胞在DBM上的增殖活性。通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)含量观察细胞在DBM上的成骨能力。结果复苏细胞的存活率为(90．24±0．02)%。低温保存前、后的BMSCs在DBM上的粘附率分别为(97．25±1．17)%和(97．00±1．09)%。倒置相差显微镜及SEM观察显示低温保存前、后的BMSCs在DBM上粘附、生长良好,有大量细胞外基质分泌、沉积。低温保存前、后的BMSCs在DBM上MTT吸光度值和ALP活性的检测结果差异无显著性意义(P＞0．05)；体外培养12d时,MTT吸光度值及ALP活性同时达到峰值。低温保存前、后的BMSCs在DBM上分泌OCN的量差异无显著性意义(P＞0．05),OCN含量随着培养时间延长而不断上升,在观察期(16d)内未出现平台期。结论低温保存对人BMSCs在DBM上的体外增殖、粘附及成骨能力影响差异无显著性意义,低温保存的人BMSCs可作为组织工程骨的种子细胞。     

骨髓基质细胞体内成骨分化研究

目的探讨将自体骨髓基质干细胞（BMSCs）移植到股骨头缺损坏死部位后能否成活、增殖,并向成骨分化,促进骨修复。方法取狗犬髂骨骨髓,体外培养扩增BMSCs,经5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记,移植到股骨头骨缺损模型。术后5周取材。行大体组织观察,组织化学染色,免疫组化检测骨钙素、骨桥素。结果BMSCs能增加骨缺损区内的成骨量、提高骨基质矿化的程度和骨成熟度,提高成骨细胞分化特异性标记物骨钙素、骨桥素的表达。新骨形成越活跃的地方,BrdU阳性细胞数目越多,很多成骨细胞BrdU阳性,新骨形成区的很多血管壁也分布着BrdU阳性细胞。结论移植的骨髓细胞在股骨头内能成活,并能停留在骨坏死、缺损部位生长增殖。移植的BMSCs能分化成为多种细胞,包括成骨细胞、血管壁细胞等。BMSCs不但能直接通过分化成成骨细胞参与成骨,也能通过参与血管形成而促进成骨。     

成骨诱导的兔骨髓基质干细胞成骨活性的表达及维持

目的观察成骨诱导的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)体内、外环境下成骨活性的表达及维持。方法观察BMSCs在体外成骨诱导培养条件下的成骨分化特性;构建兔BMSCs与活骨组织共培养模型模拟体内“成骨环境”,将成骨诱导的MSCs置于共培养及普通传代培养条件下进行传代培养,观察经成骨诱导的BMSCs在体外及模拟体内的培养条件下细胞的表型维持情况。结果药物成骨诱导培养的BMSCs,其ALP活性及骨钙素均显著高于普通培养组(P<0.05);经过诱导培养的BMSCs,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性。RT-PCR法半定量测定Ⅰ型胶原mRNA,成骨诱导培养的Ⅰ型胶原mRNA表达量明显高于普通传代培养对照组。药物成骨诱导后的细胞在体外普通传代培养传5代后,细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平及Ⅰ型胶原表达稳定维持在较高水平,保持其成骨细胞的表型;在共培养条件下,ALP活性、骨钙素水平Ⅰ型胶原表达保持在高水平,且ALP活性、骨钙素水平在大部分时间点均高于普通传代培养。结论药物成骨诱导培养呈现促BMSCs向成骨方向转化的特点,能使ALP、骨钙素及Ⅰ型胶原表达短期内达到高水平;经成骨诱导的BMSCs在体外或模拟的体内传代培养条件下,均能维持成骨表型,保持成骨活力。     

基于细胞外基质来源的组织工程椎间盘双相支架裸鼠皮下异位构建椎间盘

[目的]探讨椎间盘细胞和细胞外基质来源的一体化纤维环-髓核双相支架在裸鼠体内异位构建组织工程一体化椎间盘的可行性,并采用PKH26荧光标记和小动物活体荧光成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况。[方法]纤维环细胞和髓核细胞分别标记PKH26荧光,分别接种入细胞外基质来源的一体化支架不同相中,扫描电镜、Dead/Live荧光染色观察细胞粘附及活性,植入裸鼠背部皮下,6周后利用分子小动物活体荧光成像系统评价组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行荧光显微镜下观察、组织学染色。[结果]扫描电镜观察细胞粘附在双相支架上且周围有基质分泌,Dead/Live染色示细胞在双相支架上活性良好;6周后,活体荧光成像显示椎间盘细胞在支架内生长良好,从髓核往纤维环荧光强度减弱,细胞支架复合体在裸鼠体内形成椎间盘样组织,HE、番红O染色、甲苯胺蓝染色阳性。[结论]天然骨基质明胶和软骨基质来源的一体化纤维环-髓核支架复合椎间盘细胞能够在裸鼠皮下异位构建椎间盘样组织。     

鹿茸软骨组织脱细胞基质材料的制备及生物相容性研究

目的探讨鹿茸软骨制备脱细胞基质材料的可行性以及生物相容性,为软骨修复重建探索新材料。方法取梅花鹿鹿茸生长中心间充质层,进行由DNA酶、RNA酶、抑肽酶等介导的脱细胞处理;行组织学和DNA含量检测,评价脱细胞效果。取第2代鹿生茸区骨膜(antlerogenic periosteum,AP)细胞,行荧光干细胞标记明确其干细胞特性后,用PKH26荧光标记并与制备的间充质层脱细胞基质进行复合培养;7 d后取材行HE染色观察以及荧光显微镜下观察PKH26标记的AP细胞在基质表面生长情况。以上观测均以未复合AP细胞的脱细胞基质作为对照。将复合培养7 d的样本移植至裸鼠一侧腹股沟(实验组),取空白培养样本移植于另一侧(对照组)。于移植后7、21 d取材行HE染色,同时对组织进行冰冻切片并在荧光显微镜下观察PKH26标记成功的AP细胞在脱细胞基质表面及内部的生长情况,评价含AP细胞的脱细胞基质在裸鼠体内的组织相容性。结果HE和DAPI染色显示脱细胞处理后材料中无细胞残留,DNA含量为(19.367±5.254)ng/mg,较脱细胞处理前的(3 805.500±519.119)ng/mg显著降低(t=12.630,P=0.000),提示成功制备间充质层脱细胞基质。AP细胞与间充质层脱细胞基质复合培养7 d后,AP细胞主要黏附于材料表面,部分进入脱细胞基质内部。植入裸鼠体内后,随观察时间延长,接种AP细胞可以在脱细胞基质材料中增殖并逐渐进入材料内部,并诱导血管生成。结论实验成功制备鹿茸软骨脱细胞基质,该基质材料在离体和活体情况下适于种子细胞(AP细胞)的黏附和增殖,并具有刺激血管生成的功能,为其用于软骨组织修复提供理论依据。     

小剂量阿司匹林对去势大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]检测不同浓度低剂量阿司匹林对去势后(OVX)大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响.[方法]建立SD大鼠去势模型,全骨髓贴壁法培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传代4次后进行成骨诱导,建立对照组和不同浓度阿司匹林组(0.25、0.5、1、2及5mmol/L).于不同的培养时间点,倒置显微镜观察并进行MTT检测细胞增殖生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测培养细胞上清ALP活性;于诱导7d和21d时分别行细胞碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色.[结果]阿司匹林无明显促进BMSCs增殖作用,而大剂量阿司匹林(5 mmol/L)具有抑制BMSCs增殖作用.实验组(0.25、0.5、1、2 mmol/L阿司匹林组)细胞培养上清中ALP浓度较对照组显著增强(P＜0.05);碱性磷酸酶染色(1、2 mmol/L组)阳性表达增强;茜素红染色显示,实验组(0.5、1、2mmol/L组)钙结节数量、钙化面积均高于对照组(P＜0.05).[结论]阿司匹林不能直接促进去势大鼠BMSC增殖活性,但小剂量阿司匹林可显著提高体外培养BMSC成骨活性,增强钙盐沉积,促进钙结节形成.     

Ad-hBMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞体外骨生成的实验研究

目的 观察Ad-hBMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外骨生成中钙化斑形成,并对钙化斑元素构成进行研究。方法 用携带hBMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞,通过RT-PCR检测转染后BMSCs hBMP-2基因的表达,通过倒置荧光显微镜、钙结节茜素红染色观察转染后细胞形态改变和钙化斑的形成,结合扫描电镜和X线能谱分析(SEM/EDS)技术观测钙化斑表面微观形貌及其元素构成。结果RT-PCR检测转染后BMSCs表达hBMP-2目的基因,细胞形态向成骨方向分化,钙结节茜素红染色见红色矿化结节,电镜下见钙化灶点状散布于细胞中,细胞重叠生长,分泌基质旺盛。X射线能谱分析显示其表面为钙、磷沉积物,其钙磷比（Ca/P)为1.53。结论Ad-hBMP-2/GFP能成功转染兔BMSCs,体外诱导BMSCs向成骨方向分化,并具备较好的骨生成能力。     

基于快速成形的磷酸钙多孔陶瓷成骨性能初步研究

目的磷酸钙生物材料由于其优良的生物相容性而具有广阔的应用前景,但传统方法难以制备具有复杂形状的支架。以快速成形方法制备磷酸钙多孔陶瓷支架材料,并对其体外成骨性能进行初步研究。方法采用快速成形方法制备磷酸钙多孔陶瓷支架材料(直径10mm、高度5mm、孔径800μm),取Beagle犬髂骨髓分离培养BMSCs,接种第3代BMSCs于支架材料上。将实验分为4组,A组为成骨诱导培养的细胞/材料复合物组,B组为未经成骨诱导培养的细胞/材料复合物组,另设平皿成骨诱导培养及常规培养为阳性对照组(C组)及阴性对照组(D组)。于接种后第1、3、7天,利用DNA定量检测方法及ALP定量、定性检测方法检测BMSCs在支架材料上的增殖及ALP的表达;并经DiO荧光染色后,应用激光共聚焦显微镜观察BMSCs在材料上的黏附生长情况。结果 DNA定量结果表明,随培养时间增加,C、D组在第3天时细胞生长进入平台期;A、B组细胞呈持续增长趋势,细胞培养过程中增殖速度均略低于C、D组,且未出现明显的平台期。DiO荧光染色示,BMSCs在以快速成形方法制备的磷酸钙多孔陶瓷支架材料上黏附、生长状态良好。ALP染色示,随培养时间延长,A、B组支架上细胞染色均逐渐加深,A组各时间点染色程度均明显强于B组。培养后第1、3天,4组ALP表达均较低,差异无统计学意义(P0.05);培养第7天,各组ALP表达均明显升高,A组比其他各组明显高表达(P0.05),B组及C组均明显高于D组(P0.05)。结论快速成形的多孔磷酸钙陶瓷具有良好的细胞相容性,BMSCs与支架复合在体外诱导培养可以进行成骨分化。因此通过快速成形技术制备的磷酸钙多孔陶瓷是骨组织工程可选的细胞支架。