北京地区2007-2008年G9型A组人轮状病毒VP7和VP4基因分析

目的 了解北京地区2007-2008年检测到的G9型A组人轮状病毒外壳蛋白VP7和VP4的基因特征.方法 选取经过轮状病毒核酸杂交方法检测为G9型轮状病毒的12份儿童腹泻患儿的粪便标本,应用针对VP7全长基因的特异引物对进行RT-PCR扩增,对所获得的VP7全长基因进行克隆和测序,将所获得的序列与GenBank中的G9型原型病毒株和近期流行株的VP7基因进行序列和种系进化分析;经巢式PCR对G9型的VP4进行P基因分型.结果 12株G9型轮状病毒经VP7基因的序列比较分析得到确认.P基因分型结果显示北京地区近年来存在G9P[8]和G9P[6]型两种组合的轮状病毒感染.序列和种系进化分析发现北京G9型株VP7基因与世界范围内近期流行的G9型株一样都属于进化分支Ⅲ,彼此间的核苷酸和氨基酸同源性较高,而与国内最早报道的G9型T203进化关系较远,且北京G9P[8]和G9P[6]型株分别与国内近期报道的新疆G9P[8]和G9P[6]型株及相应的武汉G9型株VP7基因,在氨基酸位点上存在一些共同的氨基酸残基取代.结论 北京地区近年存在G9P[8]和G9P[6]两种不同基因组合的G9型轮状病毒感染,需要进一步加强对G9型轮状病毒的分子流行病学监测.     

宁波市一起新生儿轮状病毒腹泻爆发的调查

目的 了解宁波市轮状病毒(Rotavirus,RV)地方株的基因型,为中国轮状病毒疫苗的研制提供资料.方法 通过逆转录-聚合酶链反应获得宁波市RV流行株VP7基因全序列并进行序列测定.结果 Ningbo 06-1和Ningbo 06-3 VP7氨基酸同源性为90.2%,且均与G1型的标准株Wa同源性较高,分别为95.1%和87.7%,而与其它血清型代表株同源性均<85%.在VR5和VR8两个高变区域,Ningbo 06-1和Ningbo 06-3与Wa的同源性分别为89.3%和75.0%,与其它血清型代表株同源性分别低于67.9%和60.7%.结论 宁波市A组RV以G1血清型第一亚组为主.     

柯萨奇病毒A24型变异株VP1基因变异分析

目的:从分子水平探讨2002年-2008年柯萨奇病毒A24型变异株(Coxsackie virus type A24 vari-ant,CoxA 24v)VP1基因变异情况。方法:在GenBank基因库上下载26株2002年-2008年引起AHC的CoxA 24v病毒株VP1基因核苷酸和氨基酸全序列,分析各株之间核苷酸和氨基酸序列差异;并与CoxA24原型株Joseph株核苷酸和氨基酸序列进行比较。结果:各株之间VP1基因核苷酸全序列的同源性为94.3%～100%,氨基酸全序列的同源性为97.7%～100%;与Joseph株比较,核苷酸全序列的同源性为76.4%～77.9%,氨基酸全序列的同源性为90.5%～91.8%。结论:2002年-2008年CoxA 24v病毒株VP1基因在核苷酸水平上存在着一定的变异,在氨基酸层面上也存在变异,但变异幅度相对较小。     

宁波地区新生儿轮状病毒VP7基因序列分析

目的研究宁波地区新生儿轮状病毒流行株VP7基因的分子生物学特点以及遗传变异规律。方法通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测新生儿病毒性腹泻便样中的轮状病毒核酸;选择特殊电泳带型样品通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增VP7全基因并测序;测序结果利用DNAstar和Blast软件进行比对。结果通过PAGE发现11份样品中有9份阳性样品,其中带型为4-2-3-2的有7份,带型为3-2-2-2和4-2-1-2的各1份。3种带型各选一株进行VP7基因的扩增并测序,测序结果经分析发现,06NB3和06NB9与G1型标准株Wa的核苷酸同源性为84.4%和91.5%,氨基酸同源性分别为87.4%和94.8%,06NB2与G3型标准株YO的核苷酸同源性为95.3%,氨基酸的同源性为96.6%。结论宁波地区在新生儿中有A组轮状病毒流行,其电泳带型以典型的4-2-3-2为主,也可见特殊带型。06NB3和06NB9的VP7基因片段属G1型,06NB2则属于G3型。06NB3与国内外近几年流行的G1型毒株基因序列有较大差异,06NB9和06NB2则差异较小。     

金山区柯萨奇病毒A组6型基因特征分析

目的分析上海市金山区2017—2018年分离的柯萨奇病毒A组6型(Cox A6) VP1基因特征和氨基酸位点突变,为手足口病防控提供依据。方法对金山区2017—2018年采集并分离到16株Cox A6分离株VP1全长基因进行扩增、测序、序列比对,构建系统发生树,分析核苷酸和氨基酸同源性以及氨基酸位点突变。结果金山区16株Cox A6分离株均属于E2亚型同一个进化分支,16株间VP1基因核苷酸同源性为92.3%～97.7%,氨基酸同源性为98.4%～100.0%。与金山区16株分离株同源性最高的是2018年山东分离株MK357081/CHN/SD/JN/2018,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.7%～99.3%和98.7%～99.7%。13株Cox A6分离株VP1氨基酸序列存在氨基酸位点变异,涉及8个氨基酸变异位点,但在抗原表位重要位点201D、243H、245R、247Y、248M和249R均未检测到抗原漂移。结论 16株Cox A6分离株核苷酸和氨基酸序列高度同源且位于E2亚型同一进化分支;Cox A6 E2亚型可能是金山区2017—2018年流行的主导基因型,金山区Cox A6 VP1存在氨基酸突变位点但未涉及关键的抗原表位。     

开封地区病毒性脑炎病原分离株Echo30的分子流行病学分析

目的研究开封地区2008年病毒性脑炎病原分离株Echo30VP1区基因特征及其分子流行病学特点。方法对开封地区2008年病毒性脑炎监测病例脑脊液标本中分离到的8株Echo30病毒进行VP1区全基因序列测定,与GeneBank上发表的ECHO30型VP1区进行同源性比较,通过构建进化树对其进行遗传进化分析。结果所测8株Echo30VP1区基因全长均为876bp,翻译的氨基酸全长292aa。8株病毒VP1区核苷酸同源性为92.8%～99.7%,氨基酸同源性为93.0%～99.7%;与GenBank相关毒株基因组序列比对显示开封地区2008年分离株均与江苏省2003年分离株同源性较高;进化分析表明属于第7组。结论 2008年开封地区Echo30分离株与2003年江苏省分离株亲缘关系最近,可能具有相同来源。     

济南市轻重症手足口病患儿肠道病毒71型结构蛋白基因特征分析

目的 比较分析济南市轻重症手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)病原肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)结构蛋白基因及氨基酸变异情况。方法 对2017年济南市轻重症手足口病患儿EV71细胞分离株结构蛋白基因序列进行RT-PCR扩增测序,应用EditSeq和MegAlign等软件对结构蛋白基因进行序列拼接及核苷酸、氨基酸同源性比对,应用Mega 5.2软件构建VP1基因系统进化树。结果 轻重症患儿EV71分离株结构蛋白基因核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%～98.8%和99.0%～99.8%,均属于C4a基因亚型。经VP1基因同源性分析,济南市EV71分离株与2017年江苏株（GenBank ID: MG520666,同源性99.3%）、2015年河南株（KU744452,同源性99.2%）、2015年北京株（KU376386,同源性99.2%）及2016年山东潍坊株（MG588036,同源性99.0%）亲缘关系较近。死亡患儿EV71分离株VP1蛋白出现E145Q突变,重症EV71分离株分别出现VP1蛋白A19V、T101I,VP3蛋白M150I突变。结论　济南市轻重症HFMD患儿EV71分离株均属于C4a亚型,与江苏、河南、山东及北京等地的EV71株亲缘关系较近,其VP1蛋白145位氨基酸残基可能是影响病毒毒力的重要位点。     

江苏省近期急性胃肠炎暴发中诺如病毒分子特征分析

目的 了解江苏省胃肠炎暴发疫情中诺如病毒(NoV)感染状况,并对其病原分子流行病学特征进行初步研究.方法 收集江苏省2012年10月至2013年3月7起胃肠炎暴发疫情患者肛拭子标本共67份,采用实时荧光RT-PCR定性检测,NoV阳性标本用RT-PCR扩增其聚合酶区及VP1区基因片段进-步测序分型.结果 7起疫情均为NoV感染引起的暴发,检测阳性率为67.2％(45/67).全部45株阳性毒株序列分析表明7起疫情中除-起是由GⅡ.3型感染引起外,其余6起均由新GⅡ.4感染引起,其中38株毒株与2012年澳大利亚参考株GⅡ.4/Sydney株同源性均在99％以上.进-步对6株新型Sydney变异株的衣壳蛋白VP1区扩增测序,并与9株近年流行株的VP1区氨基酸序列比对,发现该6株毒株的VP1区部分氨基酸已出现突变,而氨基酸位点的突变是与病毒抗原性密切相关.结论 江苏省7起疫情暴发聚集且感染毒株型别单-,说明已出现新NoV变异株,其原型株GⅡ.4/Sydney已在国外多地引起暴发和流行,提示该毒株将是今后防控监测的重点.     

东莞地区诺如病毒ORF2基因克隆与进化树分析

目的探讨东莞地区婴幼儿感染的诺如病毒ORF2基因序列特性,分析东莞地区诺如病毒的基因型。方法收集2004年和2009年东莞地区婴幼儿腹泻标本66份,参考诺如病毒Farmington Hills株(AY502023)基因组序列,自行设计了引物两段扩增ORF2基因的引物,短片段作为检测标本的片段,分段扩增病毒ORF2全长基因,PCR产物克隆于T载体上,序列测定,用ClustalW/X和MEGA5.0等软件进行序列特性分析和基因型分析。结果获得了3株ORF2全长基因,全长为1623bp,ORF2编码主要结构蛋白衣壳蛋白(VP1),VP1蛋白有两个主要区域:P区(protruding)和S区(shell);将病毒株NVdgsl0902、NVdgsl0910的P2区与诺如病毒GⅡ-4基因型中a、b、c、d、e、f 6个亚型的P2区氨苷酸序列进行同源性比较,同源性为86.0%～91.0%,而与2006b新变株为97.0%,病毒株NVdgsl0412的P2区与诺如病毒GⅡ-4基因型中a、b、c、d、f5个亚型的P2区氨苷酸序列进行同源性比较,同源性为88.0%～93.0%,与e亚型的同源性为98.1%。结论 NVdgsl0412属于GⅡ-4e型,NVdgsl0902、NVdgsl0910属于GⅡ-4f亚型的2006b新变异株,2004年与2009年东莞地区的诺如病毒流行株发生了变异,目前是以2006b新变异株作为主要的流行株。     

浙江省临海市2004年病毒性脑膜炎暴发疫情的病原学及其分子特征研究

目的 为确证2004年浙江省临海市病毒性脑膜炎暴发疫情的病因,分析病原的遗传变异及进化关系.方法 采集患者脑脊液样本60份,采用RD和Hep-2细胞同时分离病毒,中和试验法鉴定病毒型别;对分离株VP1和VP4/VP2基因测序,进行同源性与进化分析.结果 从60份脑脊液样本中分离到埃柯病毒30型(E30)19株,分离率为31.7％;对4株E30分离株VP1区核苷酸序列测定,其长度均为876个核苷酸(nt),编码292个氨基酸(aa).临海分离株与E30原型株Bastianni在VP1区的nt和aa同源性分别为82.4％～84.1％和93.5％ ～ 94.2％;4株临海E30株之间nt和aa的同源性分别为87.1％～99.9％和97.9％ ～ 100.0％.临海分离株分成两类,同类病毒株间的差异很小,而两类病毒株间的差异很大,nt和aa的最大差异率分别为12.9％和2.1％.与临海E30株同源性最高的为2002-2003年浙江E30株.在VP1基因进化树上,临海E30株分别位于G和H基因亚型分支上,其中临海G基因株与2003年浙江、江苏和山东E30株位于同一进化分支,临海H基因株与2002年浙江诸暨株位于同一进化分支.VP4/VP2区进化分析结果与VP1区相似.结论 2004年临海市病毒性脑膜炎暴发疫情由E30G和H不同基因亚型的E30流行株引起;临海E30株与2002-2003年浙江、江苏和山东E30株具有密切的亲缘关系;H基因亚型株推测为新的E30变异株,首先分离于2002年浙江省.     

一例重症手足口病死亡患儿柯萨奇病毒B5型VP4区基因特征分析

目的:对一例重症手足口病死亡患儿肠道病毒型别进行鉴定,分析VP4区基因特征,了解其变异情况。方法:提取病毒RNA,用肠道病毒VP4区分型引物进行半巢式RT-PCR(RT-nPCR),通过测序和Blast比对确定肠道病毒型别;并对其VP4区进行序列和进化分析。结果:RT-nPCR扩增目的片段测序结果经Blast比对确定为柯萨奇病毒B5型(CoxB5),命名为BJ09-237(Genbank登录号为JF430480)。其VP4区全长207bp,与CoxB5参考序列在VP4区的核苷酸同源性为79%～98%,氨基酸同源性为95%～100%,与广东株HQ005438及俄罗斯株GQ281602在同一进化树分支上。BJ09-237在VP4区无氨基酸的缺失和插入,未发现其所特有的氨基酸置换。结论:该重症手足口病死亡患儿CoxB5的VP4区基因序列未发生明显变异。     

昆明地区22株人轮状病毒VP7及NSP4基因分析

目的研究昆明地区轮状病毒（RV）不同VP7血清型及NSP4基因变异与腹泻的流行及症状严重程度的关系。方法对2002年和2003年分离于昆明地区的RV，用PCR分型法对四种主要的VP7血清型进行分型，并对从150份RV腹泻标本VP7血清型为G1、G3、（34型RV株中挑出的14份一般腹泻株和8份重症腹泻株的NSP4基因序列进行了分析，与来自GenBank Database的4株人RV（Wa、KUN、AU-1、Hochi）和3株动物RV（EW、OSU、SA11）以及中国不同地区流行株NSP4的基因变异情况进行了比较。结果2002年昆明地区RV流行株以G1型为主，2003年RV腹泻株以G3型为主；昆明地区RV流行株间的氨基酸同源性高达98．9％～99．4％，22株流行株全都属于Wa组；NSP4变异与地域及VP7血清型无关；NSP4基因变异与RV腹泻临床症状严重程度不相关（P〉0．05）。结论不同年份相同季节不同地域流行的RVVP7血清型变异较大，而NSP4基因的相对保守性及其免疫原性使其有可能成为发展疫苗的候选基因。     

宁波市肠道病毒71型分离株全基因序列对比分析

目的探讨浙江宁波地区2010年分离的肠道病毒71型(EV71)中神经毒性相关位点。方法采集宁波地区2010年手足口病不同症状患者粪便标本,进行荧光聚合酶链反应检测,阳性标本病毒分离;分8个片段对EV71全基因序列和VP1区进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、克隆、测序、拼接、同源性比较,用DNAstar推导其内含子编码的氨基酸序列并比对分析。结果 6株分离株基因全长均为7 406 bp,核苷酸同源性为97.9%～99.4%,其中3株死亡病例标本内部核糖体进入位点(IRES)中的124、272及408位,碱基分别为T、G、A,区别于其他3株手足口轻症患者分离株的A、A和G;3株死亡病例标本位于主要衣壳蛋白VP1区的第715位氨基酸和3C蛋白酶的第1 704位及1 706位的氨基酸分别为甲硫氨酸(met)、精氨酸(arg)及异亮氨酸(ile),区别于3株轻症病例的亮氨酸(leu)、赖氨酸(lys)及缬氨酸(val)。结论宁波地区2010年分离的EV71 IRES、VP1与3C位点变异与EV71神经毒性相关。     

2014年龙岩市手足口病患者CVA10病毒基因特征分析

目的了解2014年龙岩市手足口病病例中分离到的CVA10病毒VP1区基因特征。方法 2014年共收集221份采用实时荧光RT-PCR法判定为其他EV的HFMD患者样本,经RD细胞分离培养后,再次进行特异性核酸检测。通过引物486-489进行肠道病毒A组完整的VP1序列分段扩增,采用ClustalX2、Mega6.0进行核苷酸及氨基酸序列同源性分析和构建进化树。结果通过测序获得3株CVA10完整的VP1区基因序列,通过分析计算,LY2014116与LY2014163氨基酸相似性为100%,3株分离株与原型株Kowalik(AF081300)的核苷酸(nt)同源性均为76%,氨基酸(aa)同源性为89%-90%。结论 3株分离株均位于进化树D亚型的同一分支上,与国内其他地方分离的D亚型流行株亲缘关系较近,与俄罗斯、法国等地分离的病毒差异较大。     

肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析

目的 了解2008年北京地区肠道病毒71型(EV71)分离株的全基因序列特点.方法 收集北京地区手足口病患儿的咽拭子样本12份,对其中1份样品08YM-3,经Vero细胞分离培养,提取病毒RNA.利用RT-PCR和5'、3'RACE扩增EV71全长基因.对PCR产物克隆和测序.利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树.结果 分离的EV71病毒株经过扩增后克隆得到3个涵盖EV71全基因组的阳性质粒,测序后拼接为EV71全基因组,命名为BJ08株.BJ08的5'非编码区(UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的参考序列同源性均最高,分别为95.6%～96.7%、88.3%～96.1%、78.1%～94.0%、90.8%～94.6%、85.9%～94.1%和90.9%～93.9%.BJ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%.在全基因序列与VP1区构建的系统进化树中,BJ08株均与C4亚型在同一分支.BJ08株与C4亚型参考株VP1区的6个亚型相关氨基酸序列一致,VP1抗原性表位(92～107aa)无变异.结论 北京BJ08 EV71病毒分离株为C4业型.     

肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析

目的 了解2008年北京地区肠道病毒71型(EV71)分离株的全基因序列特点.方法 收集北京地区手足口病患儿的咽拭子样本12份,对其中1份样品08YM-3,经Vero细胞分离培养,提取病毒RNA.利用RT-PCR和5'、3'RACE扩增EV71全长基因.对PCR产物克隆和测序.利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树.结果 分离的EV71病毒株经过扩增后克隆得到3个涵盖EV71全基因组的阳性质粒,测序后拼接为EV71全基因组,命名为BJ08株.BJ08的5'非编码区(UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的参考序列同源性均最高,分别为95.6%～96.7%、88.3%～96.1%、78.1%～94.0%、90.8%～94.6%、85.9%～94.1%和90.9%～93.9%.BJ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%.在全基因序列与VP1区构建的系统进化树中,BJ08株均与C4亚型在同一分支.BJ08株与C4亚型参考株VP1区的6个亚型相关氨基酸序列一致,VP1抗原性表位(92～107aa)无变异.结论 北京BJ08 EV71病毒分离株为C4业型.     

肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析

目的 了解2008年北京地区肠道病毒71型(EV71)分离株的全基因序列特点.方法 收集北京地区手足口病患儿的咽拭子样本12份,对其中1份样品08YM-3,经Vero细胞分离培养,提取病毒RNA.利用RT-PCR和5'、3'RACE扩增EV71全长基因.对PCR产物克隆和测序.利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树.结果 分离的EV71病毒株经过扩增后克隆得到3个涵盖EV71全基因组的阳性质粒,测序后拼接为EV71全基因组,命名为BJ08株.BJ08的5'非编码区(UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的参考序列同源性均最高,分别为95.6%～96.7%、88.3%～96.1%、78.1%～94.0%、90.8%～94.6%、85.9%～94.1%和90.9%～93.9%.BJ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%.在全基因序列与VP1区构建的系统进化树中,BJ08株均与C4亚型在同一分支.BJ08株与C4亚型参考株VP1区的6个亚型相关氨基酸序列一致,VP1抗原性表位(92～107aa)无变异.结论 北京BJ08 EV71病毒分离株为C4业型.     

肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析

目的 了解2008年北京地区肠道病毒71型(EV71)分离株的全基因序列特点.方法 收集北京地区手足口病患儿的咽拭子样本12份,对其中1份样品08YM-3,经Vero细胞分离培养,提取病毒RNA.利用RT-PCR和5'、3'RACE扩增EV71全长基因.对PCR产物克隆和测序.利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树.结果 分离的EV71病毒株经过扩增后克隆得到3个涵盖EV71全基因组的阳性质粒,测序后拼接为EV71全基因组,命名为BJ08株.BJ08的5'非编码区(UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的参考序列同源性均最高,分别为95.6%～96.7%、88.3%～96.1%、78.1%～94.0%、90.8%～94.6%、85.9%～94.1%和90.9%～93.9%.BJ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%.在全基因序列与VP1区构建的系统进化树中,BJ08株均与C4亚型在同一分支.BJ08株与C4亚型参考株VP1区的6个亚型相关氨基酸序列一致,VP1抗原性表位(92～107aa)无变异.结论 北京BJ08 EV71病毒分离株为C4业型.     

福州地区2009-2014年腹泻儿童轮状病毒特征

目的 了解轮状病毒在福州地区腹泻儿童中的流行情况.方法 收集2009-2014年5岁以下腹泻住院儿童粪便标本,用ELISA法检测轮状病毒抗原,RT-PCR法确定基因型别.对G9轮状病毒阳性标本的VP7基因全长测序及进化分析.结果 福州地区腹泻儿童轮状病毒高峰期在10～12月,呈单峰流行态势.G9轮状病毒在2011年后成为福州地区优势流行型别,毒株VP7基因核苷酸序列相似性92.5％～100％,毒株间有较高的同源性,进化分析都属于G9第3亚型.结论 G9轮状病毒在福州地区流行强度逐渐加强,目前已成为优势流行型别.毒株同源性高,属G9型3亚型.     

肠道病毒71型北京分离株全基因组序列分析

目的 了解2008年北京地区肠道病毒71型(EV71)分离株的全基因序列特点.方法 收集北京地区手足口病患儿的咽拭子样本12份,对其中1份样品08YM-3,经Vero细胞分离培养,提取病毒RNA.利用RT-PCR和5'、3'RACE扩增EV71全长基因.对PCR产物克隆和测序.利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树.结果 分离的EV71病毒株经过扩增后克隆得到3个涵盖EV71全基因组的阳性质粒,测序后拼接为EV71全基因组,命名为BJ08株.BJ08的5'非编码区(UTR)、P1、P2、P3、3'非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的参考序列同源性均最高,分别为95.6%～96.7%、88.3%～96.1%、78.1%～94.0%、90.8%～94.6%、85.9%～94.1%和90.9%～93.9%.BJ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%.在全基因序列与VP1区构建的系统进化树中,BJ08株均与C4亚型在同一分支.BJ08株与C4亚型参考株VP1区的6个亚型相关氨基酸序列一致,VP1抗原性表位(92～107aa)无变异.结论 北京BJ08 EV71病毒分离株为C4业型.