体外构建可注射式组织工程髓核的初步研究

目的 研究兔髓核细胞在温敏性壳聚糖水凝胶支架上的生长情况,探讨其构建可注射式组织工程髓核可行性. 方法 取3周龄新西兰乳兔,体重150～200 g,雌雄不限,分离培养兔髓核细胞.以壳聚糖、β-甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液为原料制备壳聚糖水凝胶支架,并行物理性状及大体观察.将支架与兔髓核细胞复合构建组织工程髓核.复合培养2d,观察髓核细胞在壳聚糖水凝胶中的存活情况;复合培养1周,扫描电镜观察髓核细胞在支架上的生长情况;复合培养3周后,行组织学、免疫组织化学检测,并用RT-PCR检测其分泌的聚集蛋白聚糖、Col Ⅱ mRNA表达. 结果 制备的温敏性壳聚糖水凝胶室温呈液态,37℃放置15 min可发生交联反应成为同态凝胶.吖啶橙/碘化丙啶染色示壳聚糖水凝胶中大多数髓核细胞存活,少数死亡,细胞存活率>90%;扫描电镜示髓核细胞分布于网状支架中,细胞表面有分泌的ECM;HE、甲苯胺蓝、番红O染色及免疫组织化学染色结果 显示软骨细胞具有分泌ECM的功能;RT-PCR检测示髓核细胞在壳聚糖水凝胶支架中立体培养3周后Col Ⅱ、聚集蛋白聚糖mRNA分别为0.631±0.064、0.832±0.052,较单纯培养(0.528±0.039、0.773±0.046)分泌基质的能力更强,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 温敏性壳聚糖水凝胶材料具有良好的细胞相容性,髓核细胞与其复合培养后可保持正常形态及分泌功能,有望成为髓核细胞载体构建组织工程髓核.     

新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的实验研究

[目的]观察以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的可行性。[方法]分离培养兔髓核细胞,与丝素蛋白多孔支架在体外复合培养,建立组织工程化髓核模型,通过扫描电镜、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化以及酶联免疫吸附测定观察细胞在支架上1周和3周的生长及增殖情况。[结果]培养1周后,扫描电镜显示细胞呈球状均匀地贴附在支架内部。细胞-支架复合体HE染色可见支架内部有大量髓核细胞,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。培养3周后,扫描电镜显示细胞成层黏附于支架表面,细胞重叠生长,分泌大量细胞外基质,HE染色可见支架内部有大量髓核细胞填满支架孔隙并分泌大量细胞外基质,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。酶联免疫吸附测定:3周组蛋白多糖含量(52.4±4.5)ng/ml明显高于1周组(29.3±3.6)ng/ml,P<0.05,3周组的II型胶原含量(24.3±1.8)ng/ml明显高于1周组(15.16±1.5)ng/ml,P<0.05。[结论]新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外培养生长良好,分泌大量类似髓核样细胞外基质,可以用于体外构建组织工程化髓核。     

BMSCs-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究

目的 探讨兔BMSCs-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘髓核缺损退变的效果,为临床应用提供实验依据. 方法 6只健康1月龄新西兰白兔,雌雄不限,体重1.0～1.5 kg.取骨髓2 mL,分离培养BMSCs.取第3代BMSCs,5-BrdU活细胞示踪剂标记,与壳聚糖凝胶混匀,制备BMSCs-壳聚糖凝胶复合体.将6只动物建立兔椎间盘髓核缺损退变模型,并随机分为3组(n=2):正常对照组仅分离暴露椎间盘,不作任何处理;移植治疗组将30 μL自体BMSCs-壳聚糖凝胶复合体注射入缺损椎间盘中心;缺损退变组仅注射入0.01 mol/L PBS液30 μL.移植后4周处死动物,取出移植修复的椎间盘,行细胞5-BrdU标记检测、HE、aggrecan番红.染色及Col Ⅱ免疫组织化学染色;Col Ⅱ免疫组织化学染色切片行灰度值测定. 结果 细胞标记检测发现,自体BMSCs移植后继续存活并增殖,形成细胞克隆.正常对照组及移植组椎间盘HE染色示椎间盘结构清晰,髓核组织及外周纤维环分界清晰,细胞核及细胞浆染色明显;缺损退变组示椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清.aggrecan番红O染色示正常对照组及移植治疗组椎间盘染色明显,椎间盘结构清晰;缺损退变组椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清.Col Ⅱ免疫组织化学染色示正常对照组以中央髓核组织染色为主,呈黄褐色阳性反应,椎间盘结构清晰;移植治疗组中央髓核组织呈阳性反应,细胞间质可见明显黄褐色,大体结构仍保持完整;缺损退变组染色较前两组浅,且结构不清.3组Col Ⅱ免疫组织化学染色切片行灰度值测定,正常对照组为223.84±3.93,与移植治疗组(221.03±3.53)比较差异无统计学意义(P>0.05),但两组与缺损退变组(172.50±3.13)比较,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 兔BMSCs-壳聚糖凝胶复合体可修复椎间盘缺损退变,为临床应用可注射式组织工程髓核移植治疗椎间盘退变奠定实验基础.     

胶原凝胶构建神经组织工程支架的实验研究

目的研究胶原凝胶支架对大鼠BMSCs增殖和分化的影响,探讨其作为神经组织工程支架的可行性。方法利用Ⅰ型胶原制备胶原凝胶支架。采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,取第5代细胞制备胶原凝胶-BMSCs复合体。采用扫描电镜、HE染色观察胶原凝胶支架的形态结构及复合培养后细胞形态;MTT检测该支架对BMSCs增殖的影响。取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性(GFP~+)BMSCs于胶原凝胶支架中培养24 h,通过激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察细胞生长及与材料的黏附情况。结果激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察示,GFP~+BMSCs均匀分布于胶原凝胶支架内,大部分GFP~+BMSCs呈梭形,部分细胞伸出突起,部分细胞间形成连接,提示BMSCs在三维空间中生长良好。扫描电镜示胶原凝胶支架为多孔纤维网状结构,BMSCs可黏附于该支架材料上,细胞形态良好。MTT检测示,BMSCs于胶原凝胶支架中培养后3、5、7 d的吸光度(A)值均高于单纯BMSCs培养,其中5、7 d时组间差异有统计学意义(t=4.472,P=0.011;t=4.819,P=0.009)。HE染色示,胶原凝胶支架呈均质淡粉染细丝样物质。BMSCs在胶原凝胶内培养24 h后均匀分布其中;7 d时BMSCs形态多样,部分细胞伸出细长突起,具有体外培养的神经元样形态。结论胶原凝胶支架制备简便,具有良好的生物相容性,可作为神经组织工程支架材料。     

修饰有BMP-7功能片段的功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS制备及其生物相容性研究

目的制备并评价载有BMP-7功能片段的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS的生物相容性,为其在退变髓核再生领域中的体内研究提供实验依据。方法以自组装多肽RADA16-Ⅰ为原料,通过化学键链接BMP-7功能片段构建功能化自组装多肽RADA-KPSS,再与RADA16-Ⅰ等比例混合制备新型功能化自组装多肽RADKPS。通过大体观察、原子力显微镜评估RADKPS支架材料的结构特点。分离培养3月龄新西兰大白兔BMSCs,取第3代BMSCs与RADKPS复合培养7 d,通过扫描电镜、细胞荧光素二乙酸盐/碘化丙啶活性染色、MTT法检测RADKPS的细胞相容性;于6月龄新西兰大白兔离体椎间盘内注射1%RADKPS后培养并观察其髓核内细胞活性。采用溶血实验检测RADKPS的血液相容性。将RADKPS植入6~8周龄昆明小鼠皮下28 d,行大体观察及HE染色观察RADKPS组织相容性。结果 RADKPS在L-DMEM中成胶后呈均匀透明水凝胶状;原子力学显微镜示纳米纤维相互连接呈三维网状结构,纤维直径(25.68±4.62)nm,纤维长度(512.42±32.22)nm。RADKPS支架复合BM SCs 7 d后,扫描电镜示细胞在支架上黏附良好,细胞活性维持在90%以上;MTT检测示0.1%、0.05%、0.025%RADKPS溶液均不同程度促进新西兰大白兔BMSCs增殖。溶血实验结果示,不同浓度RADKPS溶液相对溶血率均5%,符合医用生物材料的溶血实验要求。小鼠皮下注射实验结果示,28 d后注射局部皮肤无水疱、红斑及焦痂形成;HE染色示淋巴细胞等炎性细胞浸润,大量纤维组织取代水凝胶支架,材料组织相容性良好。结论新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS具有良好的生物相容性和安全性,适合于髓核的组织工程修复与再生研究。     

非接触共培养条件下人BMSCs对氧化应激环境中退变髓核细胞凋亡的保护研究

目的BMSCs移植可修复椎间盘退变,但确切修复机制尚不明确。探讨非接触共培养条件下人BMSCs对氧化应激诱导退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)凋亡的保护作用,了解BMSCs移植修复椎间盘退变的可能机制。方法密度梯度离心联合贴壁法分离、培养正常人BMSCs,并鉴定CD34、CD45、CD13细胞表面分子。胶原酶消化法分离、培养人退变椎间盘NPCs,HE染色、倒置相差显微镜观察NPCs细胞形态,甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色鉴定NPCs的类软骨细胞表型。取第3代BMSCs和第1代NPCs按共培养体系不同分为4组:A组单纯NPC(s1×106个)培养,不行凋亡诱导;B组BMSCs(1×106个)与NPCs(1×106个)共培养;C组BMSCs(3×105个)与NPCs(1×106个)共培养;D组单纯NPCs(1×106个)培养,行凋亡诱导。B、C、D组分别于共培养3、7d加入0.1mmolH2O2作用20min诱导NPCs凋亡。胰蛋白酶消化收集各组NPCs,行DAPI染色观察细胞核形态,Annexin-V/碘化丙啶染色、流式细胞仪计算凋亡率,半定量RT-PCR检测Bcl-2、Bax基因转录水平,Western-blot检测Caspase-3蛋白含量。结果成功分离并培养人BMSCs和人退变椎间盘NPCs;BMSCs鉴定呈CD34-、CD45-、CD13+;第1代NPCs呈梭形或多角形,于胞质内表达Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖。DAPI染色示凋亡的NPCs可见细胞核固缩;共培养3、7d后,B组(29.26%±8.90%,18.03%±2.25%)及C组(37.10%±3.28%,13.93%±1.25%)细胞凋亡率均低于D组(54.90%±5.97%,26.97%±3.10%),高于A组(15.67%±1.74%,8.87%±0.15%),比较差异均有统计学意义(P0.05)。半定量RT-PCR检测示B、D组髓核细胞Bcl-2的转录水平提高(P0.05),Bax的转录水平无显著变化(P0.05);Western blot检测示B、C组NPCs的Cas-pase-3蛋白表达量低于D组,高于A组,差异有统计学意义(P0.05)。结论非接触共培养条件下人BMSCs可一定程度保护氧化应激诱导的退变NPCs凋亡,BMSCs共培养预处理的NPCs可能通过降低Bax/Bcl-2的转录比例来增强抗凋亡能力。     

兔骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养后的营养效应和类髓核分化效应

目的:探讨兔骨髓间充质于细胞(BMMSCs)与髓核细胞(NPCs)共培养时BMMSCs的营养效应和类髓核分化效应及其动态变化规律.方法:应用1月龄新西兰大白兔的骨髓和髓核进行BMMSCs及NPCs的分离培养与鉴定,建立3个细胞培养组,BMMSCs与NPCs共培养组(实验组),BMMSCs单独培养组和NPCs单独培养组作为对照组.在培养的不同时间点(3、6、9、12、15、18、21d)分别检测细胞培养上清液中转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板衍化生长因子(PDGF)的含量变化及BMMSCs与NPCs的增殖能力,采用RT-PCR法检测培养不同时间点BMMSCs与NPCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达变化.结果:分离培养的两种细胞经鉴定分别为BMMSCs及NPCs.从第3天开始的各个时间点,实验组上清液中TGFβ1、PDGF的含量较两对照组明显增高(P<0.05),且随时间的延长而逐渐增高,第15天达最高,TGFβ1、PDGF分别达815.81±25.69pg/ml和494.28±20.01pg/ml,此后第18d、21d逐渐下降.实验组细胞DNA含量在各个时间点上均较两对照组明显升高(P<0.05).从第3天开始的各个时间点,实验组NPCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原mRNA的表达较对照组高(P<0.05);同时从第15天开始至第21天,实验组BMMSCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原mRNA的表达较对照组高(P<0.05).结论:BMMSCs与NPCs共培养时BMMSCs可通过表达TGFβ1、PDGF等细胞因子发挥其营养效应,激活NPCs.促进其增殖及细胞外基质的合成;在共培养后期,BMMSCs在髓核局部微环境下,可发挥其类髓核分化效应,开始合成蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原蛋白.     

非接触性共培养BMSCs和髓核细胞时间差异性的实验研究

目的探讨在非接触性共培养环境下,BMSCs定向分化为类髓核细胞在共培养时间上的差异性,寻找适合体内移植的最佳时间。方法取6只8周龄健康新西兰大白兔(体重1.5～2.0 kg)骨髓及椎间盘髓核,分离、培养BMSCs和髓核细胞并进行免疫细胞化学鉴定。取原代髓核细胞和第2代生长良好的BMSCs体外建立非接触性共培养模型。观察共培养后第1、3、5代BMSCs的形态学变化并绘制生长曲线;RT-PCR检测共培养5、10、15 d BMSCsⅡ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达;Western blot检测共培养5、10、15、20、25、30 d BMSCsⅡ型胶原和蛋白聚糖蛋白的表达。结果 BMSCs相对特异性标记物CD44、CD90表达阳性,造血细胞表面标记物CD34、CD45表达阴性。髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达阳性。共培养后2周BMSCs形态发生明显变化,呈多角形、不规则形;共培养后3代内,BMSCs生长速度无明显差异,随着传代次数增加,细胞增殖明显减慢。RT-PCR检测示共培养后10、15 d BMSCs蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于5 d时(P<0.05),而10 d与15 d时差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测示共培养后随时间延长细胞表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖蛋白逐渐增加,5、10、15 d间差异有统计学意义(P<0.05),15 d后各时间点间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论在非接触性共培养环境下,BMSCs在髓核细胞诱导下可向类髓核细胞分化,表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖,在共培养15 d时达到相对稳定,此时较适合进行体内移植。     

髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用

目的:探讨人髓核细胞(NPCs)外泌体对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用。方法:取腰椎间盘突出症患者手术切除的髓核组织,体外分离培养人NPCs,采用差速离心法提取NPCs的外泌体,利用透射电镜及Western blot对外泌体进行大小形态及标志蛋白的检测,同时用PKH67荧光染料标记外泌体后与BMSCs共孵育0.5h、2h、4h,在激光共聚焦显微镜下观察BMSCs对NPCs外泌体的摄取情况;取人BMSCs经NPCs外泌体诱导3d、7d、10d、14d后应用RT-PCR检测BMSCs中蛋白聚糖(ACAN)、SOX-9、Ⅱ型胶原(COL2A1)、角蛋白19(KRT19)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的m RNA表达情况。结果:提取的人NPCs外泌体为直径为30~100nm的圆形或椭圆形结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白。经PKH67标记的NPCs外泌体可以被BMSCs摄取;经NPCs外泌体诱导后7d开始BMSCs中的ACAN、SOX-9、COL2A1、KRT19及HIF-1α基因m RNA表达均显著性高于未经诱导的BMSCs(P0.05)。结论:在体外实验中,人NPCs可以分泌外泌体并被BMSCs所摄取,诱导BMSCs分化为髓核样细胞,可为椎间盘退变的组织工程修复提供更为简单有效的NPCs来源。     

经碱性成纤维细胞生长因子修饰骨髓基质干细胞注射式修复全层软骨缺损

目的 探讨经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)修饰的骨髓基质干细胞(BMSCs)注射式修复全层软骨缺损的可行性.方法 体外培养家兔自体骨髓基质干细胞,并以bFGF处理修饰细胞,免疫组织化学Ⅱ型胶原蛋白表达、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测蛋白聚糖表达.将其与藻酸钙凝胶支架复合注射式植入兔股骨髁全层软骨缺损处,同时设立凝胶支架对照组和空白对照组.术后8周取材观察修复效果,并行苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色检测;透射电镜观察修复组织的微观结构.结果 BMSCs的细胞群体倍增时间(PDT)为33.8 h,经bFGF处理的BMSCs可检测到Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达.至术后8周可见质硬的类白色修复组织完全充填软骨缺损处,组织学检查可见大量软骨样细胞分布于深染的细胞外基质中,检测到Ⅱ型胶原的表达.透射电镜可见丰富的细胞器和胞外基质.凝胶支架对照组和空白对照组仅有部分质软组织充填缺损处,未检测到Ⅱ型胶原的表达.结论 经hFGF修饰的自体骨髓基质干细胞藻酸钙凝胶复合物可用于修复全层软骨缺损.     

兔骨髓间充质干细胞在壳聚糖支架上的诱导培养

目的观察存壳聚糖(Chitosan)三维支架上诱导兔骨髓间充质干细胞(rMSCs)向髓核样细胞分化的情况,探讨应用其制作组织工程髓核的可能性.方法将体外培养的第3代rMSCs接种于经冷冻干燥法构建的壳聚糖三维支架上,在主要含有转化生长因子β1(TGF-β1)、胰岛素 转铁蛋白 亚硒酸钠(ITS)、地塞米松、丙酮酸钠的培养液中培养(实验组),同时设立对照组(非诱导组).在培养7d、14d、21d时取标本行组织学检测,观察三维支架上rMSCs的生长及分化情况,对支架细胞复合物行Ⅱ型胶原免疫组化检测,测定培养液中糖胺聚糖(GAG)含量及Ⅱ型胶原的表达量,计算细胞外基质GAG含量.结果rMSCs在壳聚糖三维支架上生长状态良好,体外培养7d、14d、21d时,实验组培养液中细胞外基质GAG含量分别为55.8±4.6、86.7±5.8、83.2±3.41μg/cm2,对照组培养液中细胞外基质GAG含量分别为34.2±5.6、42.6±4.8、40.8±4.4μg/cm2,两组间相同时间点比较有显著性差异(P＜0.05);Ⅱ型胶原蚩白电泳及Western-blot检测实验组在培养14d与21d时可见到Ⅱ型胶原电泳条带,21d时Ⅱ型胶原蛋白含量多于14d时;对照组未见Ⅱ型胶原表达.结论rMSCs在壳聚糖三维支架上培养生长良好,在特定的诱导培养液诱导下可以向髓核样细胞分化.     

转化生长因子β1诱导永生化人前软骨干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

  目的 研究转化生长因子β1 (TGF-β1) 诱导永生化人前软骨干细胞 (IPSCs) 向髓核样细胞分化的可行性。方法 将体外培养的IPSCs 接种于温敏型壳聚糖水凝胶 (C/GP) 三维支架上,加入含TGF-β1的诱导培养基,低氧条件下进行诱导培养,观察三维支架上IPSCs的生长及分化情况。7 d后行Alcian Blue染色,分析细胞外基质糖胺聚糖（GAG）合成情况,并收集细胞,提取RNA。RT-PCR检测诱导前后髓核样细胞标志基因Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（Aggrecan）的表达情况,Western Blot 检测诱导前后细胞内β-catenin蛋白表达水平的变化。结果 IPSCs在三维支架上生长状态良好,诱导7 d 后,Alcian Blue染色表明,细胞外基质GAG的合成明显增多,实验组（诱导培养基）明显多于对照组（普通培养基）。RT-PCR证实Ⅱ型胶原和Aggrecan的基因表达水平明显增高,实验组明显高于对照组;Western Blot证实细胞内β-catenin蛋白表达水平明显上调,实验组明显高于对照组。结论 IPSCs经TGF-β1诱导可在体外定向分化为髓核样细胞,诱导分化后的细胞具有良好的分泌功能,能够有效地分泌细胞外基质成分。TGF-β1可能通过上调细胞内β-catenin的表达诱导IPSCs向髓核样细胞分化。     

细胞共培养法诱导兔脂肪来源干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的利用软骨细胞与脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)共培养,观察ADSCs是否能向软骨细胞定向分化。方法 4月龄健康新西兰大白兔8只,雌雄不限,体重2.2～2.7 kg,分离、培养兔软骨细胞和ADSCs,取第2代细胞用于实验。将实验分为两组,实验组各取将1 mL细胞密度为2×104个/mL的软骨细胞和ADSCs分别接种至Transwell小室6孔板上、下层共同培养,对照组单独培养ADSCs。倒置相差显微镜观察两组ADSCs形态变化;培养14 d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,实时荧光定量PCR检测两组ADSCsⅡ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达。结果倒置相差显微镜观察示,随培养时间延长,实验组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,呈圆形;对照组ADSCs仍以梭形为主,呈束状或漩涡状生长。培养14 d,实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均为阳性;对照组均为阴性;实时荧光定量PCR检测示,实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA相对表达量分别为1.43±0.07、2.13±0.08、1.08±0.08,显著高于对照组(0.04±0.03、0.13±0.04、0.10±0.02),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过与软骨细胞共同培养,ADSCs可定向分化为软骨细胞。     

软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架和骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨

[目的]探讨软骨细胞外基质和壳聚糖制备复合多孔支架,同时并对小鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的可行性进行观察.[方法]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料,采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架.通过扣描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率,MTT方法检测支架浸提液毒性.将小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养并用TGF-β1成软骨诱导后,与材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况.[结果]软骨细胞外基质/壳聚精复合支架具有疏松多孔结构,孔径大小(159±36)μm,孔隙率为90.5%±2.3%,复合支架中的软骨细胞外基质成分甲苯胺蓝染色、番红O染色均呈阳性,MTT结果显示支架无细胞毒性.诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好.[结论]软骨细胞外基质/壳聚糖复合材料具有合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是组织工程软骨的良好支架载体.     

转化生长因子β1缓释载体诱导骨髓基质干细胞成软骨分化

目的探讨转化生长因子β1（TGF—β1）缓释对骨髓基质干细胞诱导成软骨分化的影响。方法乳化交联法制备TGF—β1壳聚糖缓释微球并将其与壳聚糖支架复合，将骨髓基质干细胞置于复合载体中立体培养，通过HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、扫描电镜观察复合载体对细胞的增殖、分化及功能的影响。结果骨髓基质干细胞于复合载体中培养，细胞形态类似软骨细胞，并可见细胞增殖及细胞外基质分泌，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示基质中有Ⅱ型胶原表达，其细胞增殖率及Ⅱ型胶原分泌功能均较对照组明显增强。结论复合载体能够控制TGF-β1的释放并保持其活性，可促进骨髓基质干细胞的增殖并诱导其向软骨细胞分化。     

兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外三维培养的实验研究

目的探讨兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外培养的可能性,寻找修复椎间盘退变的理想种子细胞和支架。方法胰蛋白酶消化法提取6月龄新西兰大白兔纤维环细胞,培养至第3代,复合于KLD-12多肽制备KLD-12多肽/纤维环细胞凝胶。倒置显微镜观察凝胶内细胞形态变化;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖活性;钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色观察凝胶内活、死细胞,计算活细胞比率;阿尔新蓝法检测培养基中糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;免疫荧光染色观察Ⅱ型胶原分泌情况;实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)检测纤维环细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖(Aggrecan)基因表达情况。结果复合于凝胶中的纤维环细胞呈圆形,少部分在凝胶边缘处贴壁的细胞呈多角形。CCK-8结果显示,细胞增殖活性随培养时间延长呈增加趋势,培养14 d活性显著高于其余各时间点(P0.05),且各时间点活性均显著高于空白凝胶对照组(P0.05)。Calcein-AM/PI双荧光染色观察示,培养5、14 d凝胶内细胞活细胞比率分别89.32%±8.58%和97.81%±1.09%,比较差异无统计学意义(t=—1.962,P=0.097)。GAG检测示,细胞中GAG含量随培养时间延长逐渐增加,8 d达峰值,之后逐渐下降;培养5、8、11 d时GAG含量显著高于2、14 d时(P0.05)。免疫荧光染色示细胞中Ⅱ型胶原正常分泌。RT-q PCR检测示,培养5、14 d凝胶内纤维环细胞均可见Ⅱ型胶原和Aggrecan基因表达,14 d时基因相对表达量均显著高于5 d时(P0.05)。结论纤维环细胞能够在KLD-12多肽纳米纤维凝胶中正常生长增殖,主要细胞外基质成分可正常表达,细胞生物活性良好。     

两种同源间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学影响的比较

【摘要】 目的：比较两种人间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学功能的影响。方法：取同一例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织、脂肪组织和骨髓组织,分别分离培养退变髓核细胞（NPCs）、脂肪间充质干细胞（ADSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）。取3种细胞传代至第3代的细胞进行接触式共培养。共培养前,利用PKH26对第3代退变NPCs进行染色标记,然后按1∶1的细胞比例,将NPCs分别与ADSCs和BMSCs在普通6孔板内进行接触式共培养。实验分为3组,A组为单独培养的NPCs,为对照组;B组为与ADSCs共培养的NPCs;C组为与BMSCs共培养的NPCs。共培养第7天时,利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养的细胞进行分选,获取各组NPCs。然后提取各组NPCs的总RNA,进行反转录后,再利用Real-Time PCR技术检测各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。将Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量按分组进行组间t检验,P＜0.05为有统计学差异。结果：从退变髓核组织、骨髓组织和脂肪组织中,均成功分离培养出NPCs、BMSCs和ADSCs。待各细胞传至第3代时,成功利用PKH26对NPCs进行染色标记。按实验分组将各细胞进行接触式共培养后第7天,成功利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养细胞进行分选,获取各组NPCs。经提取各组NPCs的总RNA,反转录并进行Real-time PCR后,获取各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量,A组分别为1.03±0.04,1.05±0.07,1.04±0.17;B组分别为5.26±0.24,7.71±0.21,3.84±0.25;C组分别为9.33±0.39,11.07±0.34,5.64±0.26;B、C组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量与A组比较显著性增加（P<0.05）;C组与B组比较,各指标基因相对表达量显著性增加（P<0.05）。结论：在接触式共培养条件下,BMSCs和ADSCs对退变NPCs均具有营养激活效应;BMSCs对退变NPCs的激活效应比ADSCs更好,对于椎间盘退行性疾病的生物学治疗可能更具优势。     

PKH26标记结合活体荧光成像技术在椎间盘组织工程研究中的应用

目的体外评估PKH26标记对山羊髓核细胞生物学功能的影响,并结合活体荧光成像系统评价种子细胞在裸鼠体内的生物学行为。方法取1岁龄山羊椎间盘分离髓核组织,通过酶消化法获取原代细胞,倒置相差显微镜下观察,传代获取第1代髓核细胞,行PKH26荧光标记,荧光显微镜下观察标记后的细胞荧光强度,并行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色观察,锥虫蓝染色比较标记前后细胞活性,MTT法检测标记前后细胞增殖特性,实时荧光定量PCR检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达。将标记后的髓核细胞接种至一体化纤维化-髓核支架的髓核部分,纤维环部分作为阴性对照,体外培养3 d后植入5只6周龄雄性裸鼠体内,培养6周后活体成像技术检测髓核细胞-支架复合物在体内的荧光强度及范围。结果倒置相差显微镜观察示原代髓核细胞簇状生长,呈卵圆形,第1代髓核细胞呈类软骨样细胞形态;标记后的第1代髓核细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性;标记后荧光强度均匀,标记前后细胞活性均在95%以上;标记前后细胞生长曲线比较差异无统计学意义(P>0.05);实时荧光定量PCR检测示标记前后细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。活体成像技术显示体内髓核支架有强烈荧光,纤维环支架未见荧光。结论 PKH26标记对髓核细胞的活性、增殖及细胞表型的表达无明显影响,结合体内活体荧光成像系统可以追踪细胞在体内的生物学行为。     

骨形态发生蛋白2和富血小板血浆凝胶对兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的影响

目的观察富血小板血浆(PRP)凝胶及腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的影响。方法取新西兰大白兔骨髓培养BMSCs,抽取静脉血制备PRP,以Ad-GFP-hBMP-2(BMP-2-BMSCs组)及Ad-GFP(对照组)转染的BMSCs分别与PRP凝胶复合,继续培养。用扫描电镜、MTT检测PRP凝胶的生物相容性,RT-PCR检测各组的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、蛋白聚糖、SOX-9表达。结果扫描电镜及MTT检测证实PRP凝胶具有良好的生物相容性。RT-PCR分析表明,单层培养的BMP-2-BMSCs组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX-9的表达水平均高于对照组(P0.05),但Ⅰ型胶原表达水平较对照组明显下降(P0.05),同时Ⅹ型胶原表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P0.05);与PRP复合后,BMP-2-BMSCs组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX-9表达水平较对照组升高(P0.05),而Ⅰ型胶原和Ⅹ型胶原表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论转染BMP-2的BMSCs在PRP凝胶中生长良好,BMP-2基因转染能促进BMSCs的体外成软骨分化。     

大鼠椎间盘器官整体培养条件下髓核组织的变化

目的对大鼠椎间盘包括上下软骨终板、纤维环及髓核组织进行整体培养,观察髓核组织的变化,探索椎间盘器官整体培养的实用技术。方法取健康清洁级5～6周龄SD大鼠60只,体重约150g,雌雄不限,完整取出腰段椎间盘器官共335个,用含肝素的高渗PBS液充分冲洗后置入含有渗透压为410mOsmol/kg高渗培养液的12孔培养板内,每天换液1次。于培养第0、3、7、14、21天行髓核细胞成活率检测(n=15)、免疫组织化学染色观察(n=2)、HE染色(n=15)、番红O染色观察(n=15),培养第0、3、7、14天行RT-PCR检测(n=5)。结果培养14d内髓核细胞成活率无明显变化(P0.05),21d时显著低于其余各时间点(P0.01)。各时间点免疫组织化学染色均显示髓核细胞内含大量Ⅱ型胶原。培养14d内HE染色和番红O染色示髓核和基质组织结构完整。图像分析显示,培养14d内各时间点间髓核组织灰度值比较差异均无统计学意义(P0.05),21d与其余各时间点比较差异均有统计学意义(P0.05)。RT-PCR检测显示,随着培养时间延长,Ⅰ型胶原mRNA表达呈上升趋势,而Ⅱ型胶原、核心蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖均呈下降趋势;各基质蛋白mRNA表达的相对强度各时间点间两两比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论利用高渗培养液可对椎间盘器官进行整体培养,为椎间盘生理与病理研究提供了一种理想模型。