组织工程皮肤的应用研究

目前，人们对人工活性皮肤替代物（细胞工程或组织工程人工皮肤）的研究已进行了约半个世纪。将表皮细胞培养于经辐照的鼠成纤维细胞（Fb）滋养层，是组织工程皮肤治疗大面积烧伤的里程碑。由于培养基的改良与商品化，促使角质形成细胞的无血清层和无滋养层培养成功，结合早期切痂和应用临时皮肤覆盖物，     

皮肤组织工程研究的新进展

组织工程学是以细胞生物学、工程学和材料学相结合，在体外或体内构建组织或器官替代物，用于修复、维持或改善机体形态和功能的一门新兴的交叉学科^[1]。组织工程皮肤为急性或慢性皮肤损伤提供了全新的治疗理念。然而，目前的皮肤替代物仅仅是结构的模仿，且存在构建时间长、修复有限、无皮肤附件及瘢痕形成等缺陷。     

精氨酸对烫伤小鼠脾淋巴细胞的影响

我们以８周龄，体重２０克左右的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠为实验对象，观察正常小鼠及烫伤小鼠脾淋巴细胞经各种不同浓度精氨酸的培养液体外培养后，对ＣｏｎＡ反应性的变化，同时观察经不同含量精氨酸的饮食饲养后，烫伤小鼠脾淋巴细胞的变化。结果表明：小鼠脾淋巴细胞经各种不同浓度精氨酸体外培养后，对ＣｏｎＡ的反应性在一定的范围内随精氨酸浓度的递增而增加；烫伤小鼠通过不同含量精氨酸的摄入，其脾淋巴细胞对ＣｏｎＡ的反应性呈现     

精氨酸对烫伤小鼠脾淋巴细胞功能的影响

我们以８周龄、体重２０克左右的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠为实验对象，观察正常小鼠及烫伤小鼠脾淋巴细胞经各种不同浓度精氨酸的培养液体外培养后，对ＣｏｎＡ反应性的变化，同时观察经不同含量精氨酸的饮食饲养后，烫伤小鼠脾淋巴细胞功能的变化。结果表明：小鼠脾淋巴细胞经各种不同浓度精氨酸体外培养后，对ＣｏｎＡ的反应性在一定的范围内随精氨酸浓度的递增而增加；烫伤小鼠通过不同含量精氨酸的摄入，其脾淋巴细胞对ＣｏｎＡ的反应性呈现不同的变化，其中以摄入占总卡量２％精氨酸组的淋转功能最佳。实验提示：小鼠脾淋巴细胞的功能在一定浓度范围内对精氨酸存在剂量依赖关系，淋巴细胞最佳功能的表达需要一个最合适的精氨酸浓度，烫伤后脾淋巴细胞需要更高的精氨酸浓度才能表达其最佳功能。     

精氨酸对烫伤小鼠脾淋巴细胞功能的影响

我们以8周龄、体重20克左右的 BALB/C 小鼠为实验对象,观察正常小鼠及烫伤小鼠脾淋巴细胞经各种不同浓度精氨酸的培养液体外培养后,对 ConA 反应性的变化,同时观察经不同含量精氨酸的饮食饲养后,烫伤小鼠脾淋巴细胞功能的变化。结果表明;小鼠脾淋巴细胞经各种不同浓度精氨酸体外培养后,对 ConA 的反应性在一定的范围内随精氨酸浓度的递增而增加;烫伤小鼠通过不同含量精氨酸的摄入,其脾淋巴细胞对 ConA 的反应性呈现不同的变化,其中以摄入占总卡量2%精氨酸组的淋转功能最佳。实验提示:小鼠脾淋巴细胞的功能在一定浓度范围内对精氨酸存在剂量依赖关系,淋巴细胞最佳功能的表达需要一个最合适的精氨酸浓度.烫伤后脾淋巴细胞需要更高的精氨酸浓度才能表达其最佳功能。     

组织工程皮肤修复皮肤缺损的初步实验研究

目的:探讨组织工程皮肤移植的手术方法、注意事项及临床效果。方法:2.5～3月龄约克猪6只,制备全厚皮肤缺损创面48个,随机分为三组,每组16例。A组:组织工程全层皮肤移植组;B组:组织工程真皮和自体表皮复合移植组;C组(对照组):自体全厚皮片移植组。观察实验组与对照组间的治愈率。结果:A组治愈率75.00%,B组治愈率87.50%,C组治愈率93.75%,三组比较无显著性差异(χ2=2.34,P>0.05)。结论:组织工程皮肤修复皮肤缺损是可行的。     

利用人源化小鼠研究组织工程材料的体内免疫原性

目的建立并利用人源化小鼠模型,研究组织工程材料的体内免疫原性。方法利用NOD／SCID小鼠（非肥胖型糖尿病鼠与重症联合免疫缺陷鼠反交鼠模型）．通过腹腔注射人外周血单个核细胞（PBMC）（100×10^6）建立人源化小鼠,在人源化小鼠皮下植入异体人皮肤（阳性对照）、人体脂肪干细胞与脱钙骨构建的组织工程骨（实验组）、单纯脱钙骨材料（阴性对照）。在植入后1周、2周、3周、4周,取小鼠尾静脉血,流式细胞仪检测人CD4^＋和CD8^＋淋巴细胞比例。4周后,取小鼠的移植局部皮肤进行HE染色分析,同时检测脾细胞人CD4^＋和CD8^＋淋巴细胞比例。结果NOD／SCID小鼠腹腔注射人PBMC4周内,在外周血和脾中均可测到人CD4^＋和CD8^＋淋巴细胞。病理分析结果显示：在人源化小鼠皮下植入的组织工程材料及成体干细胞构建的组织工程骨组未见炎性细胞浸润;而单独植入人皮肤组可见明显的炎性细胞浸润。结论人源化小鼠可作为组织工程材料体内免疫原性的研究的良好模型。     

脾组织植入:消化道大出血的一个原因

脾组织植入是脾损伤或手术后脾组织的自体移植,并认为是脾细胞在腹腔内或在腹腔外的种植性生长,可引起某些并发症.本文报告1例脾组织植入引起消化道大出血并加以讨论.     

组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的 探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性. 方法 将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养.将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5 mL与纤维蛋白支架(0.5 mL)混合凝固构建组织工程皮肤.取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3 g,平均20.0 g,制备背部全层皮肤缺损模型.随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤.术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察. 结果 细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6 d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞.构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞.移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻.术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为(0.460 ±0.049)、(0.480 ±0.055)、(0.540 ±0.043)、(0.510 ±0.032)及(0.60 ±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P＜0.05).术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见. 结论 用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤.     

构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究

目的 探讨运用组织工程方法构建含有黑色素细胞的组织工程皮肤。方法 以包皮组织作为细胞来源，采用消化法获得角朊细胞、成纤维细胞和黑色素细胞，在自行设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。行Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测构建的皮肤中黑色素细胞的分布和状态。结果 构建的组织工程皮肤结构完整，细胞状态良好，Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测均显示含有大量黑色素细胞并处于良好状态。结论 构建了含黑色素细胞的组织工程皮肤，可用于下一步的动物实验和临床实验。     

人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建

目的：改良传统人表皮干细胞（hESCs）分离、培养方法,为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法：应用改良的酶消化法（改良法）及传统酶消化法（传统法）分离、培养hESCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19（K19）和β1整合素的表达,并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果：台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个,传统法细胞消化分离数为68.50±26.91个（P〈0.01）;改良法活细胞比率是（94±0.01）%,传统法活细胞比率是（75±0.04）%（P〈0.05）。在8天时改良法细胞MTT法OD值为1.300,传统法为0.779,改良法较传统法活力好,增殖快;细胞免疫组织化学染色显示表皮干细胞标志物角蛋白19（K19）和β1整合素均为阳性染色;HE染色结果显示采用改良法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐,传统法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3～4层、基底细胞排列散乱。结论：利用改良的酶消化法可获得数量更多、活力更好的人表皮干细胞,为以hESCs为种子细胞构建组织工程皮肤奠定基础。     

组织工程椎间盘体内原位植入的实验研究

目的:观察组织工程椎间盘原位植入Beagle犬腰椎间盘后支架与种子细胞的转归及犬腰椎间盘的形态与功能变化。方法:应用聚乳酸聚酯(polyL-lactic-co-glycolicacid,PLGA)可吸收多孔支架复合犬髓核细胞构建组织工程椎间盘。将18只Beagle随机分为3组,均摘除L4/5椎间盘髓核,A组单纯髓核摘除,B组植入空白PLGA支架,C组植入组织工程椎间盘。术后定期行X线片及MRI检查,分别于术后4、8及12周处死动物行组织病理及免疫组化观察。结果:全部动物术后存活。4周后,X线片示3组椎间盘高度均有下降,C组下降幅度较小,与A、B组比较有显著性差异(P0.05);A组和B组手术节段屈伸活动度(ROM)明显大于C组(P0.05);MRI示A组与B组椎间盘退变明显,呈"黑间盘"改变,而C组椎间盘退变程度较轻,呈灰色,MRIT2加权像上椎间盘信号灰度值测量结果示A、B组明显低于C组(P0.05)。术后4周B、C组组织学观察未见到支架材料结构,A、B组椎间盘内纤维组织增生形成瘢痕样组织,C组于术后8周仍能观察到植入的红色荧光细胞,有大量类软骨细胞增生伴丰富的细胞外基质。术后8周免疫组化显示三组均有Ⅰ、Ⅱ型胶原着色,其中C组Ⅱ型胶原染色强度高于Ⅰ型,A、B组Ⅰ型胶原染色强度高于Ⅱ型。结论:PLGA组织工程椎间盘支架在体内可降解吸收;种子细胞可存活并分泌Ⅰ、Ⅱ型胶原,能阻止纤维组织侵入及瘢痕形成;维持了脊柱节段稳定及生理活动功能。     

舌下神经植入组织工程骨骼肌的体内实验研究

目的构建高表达胶质源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)的成肌细胞(myoblast,Mb)并作为种子细胞,以去细胞胶原海绵为支架,体内构建组织工程骨骼肌,观察构建组织能否与舌下神经断端发生连接。方法取7只2日龄雄性Lewis大鼠四肢肌肉体外分离培养Mb,采用携带GDNF基因的重组腺病毒Ad-GDNF转染第3代Mb(MbGDNF)。将Mb及MbGDNF与去细胞胶原海绵支架体外复合培养构建细胞支架复合物,24 h后扫描电镜观察细胞黏附情况。取8周龄雌性Lewis大鼠54只,解剖分离舌下神经,取1.0～1.5 cm舌下神经离断其远心端,用Mb支架复合物(Mb组,n=27)和MbGDNF支架复合物(MbGDNF组,n=27)包裹并固定其近心端,术后1、6及12周分别行HE染色,myogenin、slow skeletal myosin及乙酰胆碱受体α1(actylcholine receptorα1,AchRα1)免疫组织化学染色检测植入物生长情况,并行霍乱毒素B标记的过氧化物酶逆行示踪染色检测损伤后舌下神经核运动神经元存活情况。结果构建的MbGDNF能高表达转染基因。Mb及MbGDNF在支架上黏附和生长状态良好。HE染色:术后12周,两组植入物与周围组织紧密连接,有新生肌纤维从周围正常肌组织长入,与正常组织分界渐不明显。免疫组织化学染色:术后1、6及12周均可检测到细胞质呈myogenin及slow skeletal myosin阳性的肌源性细胞,以及AchRα1呈弥散性阳性细胞。Y染色体染色阳性细胞随时间延长而减少。术后1、6及12周,MbGDNF组阳性标记的神经元数量分别为261.0±6.6、227.3±8.5及173.3±9.1;Mb组分别为234.7±5.5、196.0±13.5及166.7±11.7;术后1、6周MbGDNF组神经元数量多于Mb组(P<0.05),术后12周两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论构建的组织工程骨骼肌与舌下神经断端发生了直接物质联系,MbGDNF产生的重组GDNF能通过逆行运输方式保护损伤后舌下神经核团内运动神经元的存活。     

组织工程皮肤血管化策略及研究进展

组织工程皮肤作为皮肤缺损治疗的替代解决方案,其核心思想是利用支架、种子细胞或者生物活性分子来促进皮肤的修复重建。在过去几十年里,该领域发展迅速,各种改善皮肤再生的策略层出不穷。然而,尽管有诸多组织工程皮肤产品已经被商业化生产并应用于临床,但仍存在诸多问题需要进一步研究解决。其中,组织工程皮肤的血管化是关键挑战之一。目前,已有大量基础研究致力于解决组织工程皮肤的血管化难题,可以分为两大类,即基于各种生长因子、种子细胞或活性纳米颗粒的促血管生成策略,以及基于组织工程皮肤支架的体内、外预血管化策略。本文将从上述两个方面分别概述其促进组织工程皮肤血管化的优缺点,并介绍最新进展。     

组织工程皮肤构建的研究进展

组织工程学是生物工程领域的一门新兴学科,是目前学术界的研究热点。利用组织工程的原理构建人工皮肤替代物,用于皮肤移植,可以有效解决临床上皮肤缺损修复,供皮不足的难题。文中从表皮、真皮、复合皮三个方面就近年来组织工程皮肤构建的研究进展及干细胞在这一领域的应用作一综述,并分析组织工程皮肤目前存在的问题,展望未来发展方向。     

人胚胎成纤维细胞作为组织工程皮肤种子细胞的可行性研究

目的：评估人胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblasts,HEF）作为组织工程皮肤种子细胞的可行性和优越性。方法：取人流产胚胎皮肤、正常儿童皮肤,相同条件下分离培养成纤维细胞,比较两组细胞镜下、超微结构以及增殖特性,异体淋巴细胞混合实验对比其抗原性。以第三代细胞复合鼠尾胶原构建三维培养,ELASA法分别测定两组三维构建培养液中IL-6,TGF-β1含量。结果：与普通成纤维细胞相比,胚胎成纤维细胞扩增后具有更好的细胞形态和功能,生长速度快,分裂指数高,几乎不刺激异体淋巴细胞增殖。在鼠尾胶原支架中成纤维细胞生长状态良好,并且具有一定的组织强度。胎儿成纤维细胞组培养液中的TGF-β1和IL-6在各个时相上分别显著低于和高于普通成纤维细胞组。结论：胚胎成纤维细胞是组织工程皮肤较理想的种子细胞。     

高功率微波对小鼠免疫组织淋巴细胞影响的初步研究

目的：观察不同强度高功率微波(HPM)对小鼠免疫组织和外周血淋巴细胞的影响及其作用机制。方法：应用TUNEL和FCM(Annexin—V/PI双标法)技术研究小鼠胸腺、脾脏、淋巴结和外周血淋巴细胞凋亡的发生规律。结果：①10～30mW/cm~2 HPM辐照后,C57小鼠外周血WBC出现降低,而淋巴细胞凋亡率明显升高,与WBC的变化呈较好的对应关系,且在0～15mW/cm~2内呈一定的剂量效应关系。②照后7d,C57小鼠免疫组织淋巴细胞凋亡率均出现明显升高,而在0～15mW/cm~2范围内与辐照剂量呈一定的量效关系。③不同剂量辐照后3d,129小鼠免疫组织淋巴细胞凋亡率均出现明显升高,而以脾组织淋巴细胞凋亡率与剂量呈一定的量效关系。淋巴结经15mW/cm~2辐照后3、7和14 d,其凋亡率的升高与照后时间显示一定的时效关系。结论：虽然对非热效应的生物学影响及其机制仍存在争议,然而本研究结果明确指出,微波对机体免疫机能影响的非热效应还是比较明显的,有关机制尚需进一步阐明。     

含表皮干细胞组织工程皮肤的构建研究

目的用表皮干细胞和成纤维细胞作为种子细胞研制一种增殖能力强的具有表皮、真皮的组织工程化人工复合皮肤。方法从幼儿包皮中分离表皮干细胞,用胶原Ⅳ纯化、富集表皮干细胞,接种在3T3细胞滋养层上,将体外传代培养的表皮干细胞和真皮成纤维细胞分别接种在经冷冻干燥及戊二醛交联的Ⅰ型胶原基质网架的两侧,在液面下培养3周后,改为气-液界面培养,构建含表皮干细胞的复合皮肤,并进行组织学、免疫组织化学及电镜观察。结果表皮干细胞呈克隆状生长,G0/G1期细胞和α6briCD71dim细胞百分率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),实验组K19免疫细胞化学染色呈阳性,对照组呈阴性。光镜下观察可见体外培养的含表皮干细胞的人工复合皮肤,具有表皮和真皮,表皮层由基底至浅层可见3~5层细胞,角蛋白免疫组化染色阳性。结论表皮干细胞种植于胶原海绵膜上,可生成全层组织工程皮肤,具备了同正常皮肤类似的结构,表明其具有在体外分化成表皮的能力。