BMSCs移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经功能恢复的影响. 方法 从2011年3月至7月,采用全骨髓差速贴壁培养法进行SD大鼠BMSCs的体外分离与培养;利用多中心急性脊髓损伤打击器(MASCIS Impactor)建立大鼠T11脊髓损伤模型,建模成功后将大鼠随机分为4组:对照组(A组)、电针组(B组)、BMSCs移植组(C组)、联合组(D组).SCI后1周,C组与D组大鼠自尾静脉注射移植BMSCs悬液0.1 ml,A组与B组自大鼠尾静脉注射无血清的DMEM/F12培养液0.1 ml,B组与D组接受督脉电针治疗,1次/天.于SCI后1、2、4、8周采用BBB评分法进行后肢运动功能评分;于SCI后8周采用SEP检测脊髓传导功能,采用HE染色观察脊髓空洞大小,采用免疫组化染色检测神经丝蛋白(NF200)的表达.实验中获得的数据采用单因素方差分析. 结果 SCI后2、4、8周,与A组比较,B、C、D组BBB评分均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组BBB评分升高更明显,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,与A组比较,B、C、D组SEP潜伏期缩短、波幅增高,差异有统计学意义(p＜0.05);与R、C组比较,D组SEP潜伏期更短,波幅更高,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,4组大鼠脊髓组织损伤区均可见组织结构紊乱,细胞肿胀,空泡变性,且损伤区均可见瘢痕组织及空洞形成,其中A组脊髓空洞最大,B组和C组次之,D组最小.SCI后8周,4组大鼠脊髓组织均有NF200阳性表达,与A组比较,B、C、D组NF200阳性表达增强,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组NF200阳性表达更强,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 BMSCs移植联合督脉电针对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的促进作用更为显著,优于单纯BMSCs移植和督脉电针治疗.     

BMSCs静脉移植对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响

[目的]探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)静脉移植对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响.[方法]利用多中心急性脊髓损伤打击器(MASCIS Impactor)建立大鼠T11脊髓损伤模型,建模成功后随机分为两组:对照组(A组)、BMSCs移植组(B组).SCI后1周,A组自大鼠尾静脉注射无血清的DMEM/F12培养液0.1ml,B组自大鼠尾静脉注射移植BMSCs悬液0.1ml.两组大鼠于SCI后1、2、4、8周行BBB后肢运动功能评分,SCI后2、4、8周行SEP检测及脊髓组织病理学检查(HE染色与NF200免疫组化染色).[结果]SCI后2、4、8周,与A组比较,B组BBB评分升高,SEP N1潜伏期缩短、P1-N1波幅增高,差异均有统计学意义(P＜0.01);SCI后8周大鼠脊髓组织HE染色显示,两组大鼠脊髓组织损伤区均可见瘢痕组织及空洞形成,但B组脊髓空洞比A组小;SCI后2、4、8周,NF200免疫组化染色显示,两组大鼠脊髓组织均有NF200阳性表达,与A组比较,B组各时间点NF200阳性表达均增强,差异有统计学意义(P＜0.01).[结论]BMSCs静脉移植对大鼠SCI后神经功能的恢复有明显的促进作用.     

经嗅鞘细胞条件培养液诱导的骨髓基质干细胞移植对脊髓损伤修复的影响

[目的]研究经嗅鞘细胞条件培养液诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs)移植对脊髓损伤的治疗作用。[方法]采用脊髓挤压损伤方法,制造SD大鼠脊髓损伤动物模型(共24只),随机分成A、B、C三组(每组8只),立即分别将DMEM、BMSCs和经诱导的BMSCs移植入脊髓损伤部位,分别于移植4、8周后处死动物,均采用HE染色观察脊髓损伤处空洞面积改变情况;并采用抗神经丝(NF)抗体、生长相关蛋白-43(GAP-43)抗体和神经元特异性核蛋白(Neu N)抗体免疫组织化学荧光染色,观察移植的BMSCs存活和分化情况及损伤部位神经纤维再生情况。[结果]移植4、8周后,脊髓损伤区空洞为移植细胞充填,空洞面积明显减少,差异有统计学意义(P0.01),BBB评分结果 C组和A、B组之间存在统计学差异(P0.05)。B、C组均可见再生神经纤维形成,同时部分移植细胞呈Neu N染色阳性,在C组上述改变更加显著。[结论]经嗅鞘细胞条件培养液诱导的BMSCs可以在脊髓损伤区存活,能够显著减小脊髓损伤处空洞面积,并可以促进脊髓损伤区神经纤维的修复再生,促进大鼠双下肢运动功能的恢复。     

神经干细胞-多肽自组装凝胶复合体移植治疗脊髓损伤

目的 观察神经干细胞( NSCs)复合多肽自组装凝胶移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后功能修复的影响.方法 36只SD大鼠造模后1周随机分为3组,分别为DMEM/F12对照组(n＝12)、NSCs移植组(n=12)和NSCs-凝胶移植组(n=12).通过不同时间点BBB评分、病理组织学、免疫荧光技术评价脊髓损伤的修复.结果 移植后2周开始3组大鼠各时间点评分差异有统计学意义(P＜0.01),且组间差异均有统计学意义(P＜0.01);移植后6周,病理切片示C组大量再生的神经纤维桥接脊髓断端,胶质瘢痕不明显;免疫荧光染色示C组5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)/NF-200双标阳性细胞比例(24.83±1.47)％明显多于B组(6.83±1.47)％(P＜0.01),但B组BrdU/GFAP双标阳性细胞比例(42.17±2.71)％明显多于C组(34.33±4.63)％ (P＜0.01).结论 自组装多肽凝胶能提高神经干细胞向神经元分化的比例,复合移植能更有效地促进脊髓功能恢复.     

全反式维甲酸干预鼠胚神经干细胞联合胶质细胞源性神经营养因子及硫酸软骨素酶ABC移植修复大鼠脊髓损伤的研究

目的探讨全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)干预培养的鼠胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neur otrophic factor,GDNF)、硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)移植治疗大鼠脊髓损伤的效果。方法取健康成年雌性SD大鼠60只,体重200~250 g,随机分为5组(n=12),分别为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)、NSCs+GDNF移植组(C组)、NSCs+Ch ABC移植组(D组)、NSCs+GDNF+Ch ABC移植组(E组)。B~E组于T10平面横断脊髓建立脊髓全横断损伤模型,A组仅显露硬脊膜但不损伤脊髓。于术后第8天将Brd U标记的ATRA干预培养的鼠胚NSCs移植至C、D、E组大鼠,第8~14天C~E组每天对应给予10μL GDNF、10μL Ch A BC,A、B组给予等量生理盐水。术后观察大鼠一般情况;于术前1 d、术后7 d及移植后1、2、5、8周采用BBB评分评估大鼠双后肢运动功能,采用体感诱发电位(somatosensory evoked potentials,SEP)评估神经传导功能。移植8周处死各组大鼠,取移植节段脊髓行HE染色和免疫荧光染色观察。结果造模术后共5只大鼠死亡,均补充。造模术后各时间点,B~E组大鼠BBB评分均较A组降低,SEP潜伏期均较A组延长,差异有统计学意义(P0.05);造模术后7 d、移植后1周时,B~E组组间BBB评分、SEP潜伏期比较,差异无统计学意义(P0.05);移植2、5、8周,C~E组大鼠双后肢功能逐步恢复,各时间点BBB评分均高于B组,SEP潜伏期均短于B组,差异有统计学意义(P0.05);移植5、8周,E组BBB评分高于C、D组,SEP潜伏期短于C、D组,差异有统计学意义(P0.05)。HE染色示,A组灰、白质分界清楚,细胞排列规则;B组损伤区血管形态欠完整,细胞排列紊乱,可见囊腔及胶质瘢痕形成;C~E组细胞增生明显,坏死囊腔较B组小。免疫组织荧光染色示,A、B组未见明显Brd U标记阳性细胞;C、D、E组Brd U阳性细胞胞体呈橘红色,E组阳性细胞多于C、D组(P0.05)。C~E组神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞少于A、B组,E组少于C、D组,差异均有统计学意义(P0.05)。C~E组抗微管相关蛋白2阳性细胞多于A、B组,E组多于C、D组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论经ATRA干预培养的NSCs联合GDNF及Ch ABC移植对大鼠脊髓损伤再修复的促进作用优于NSCs分別联合GDNF、Ch ABC,提示GDNF、Ch ABC在治疗脊髓损伤修复过程中具有协同作用。     

活性巨噬细胞移植促进脊髓损伤后功能恢复的实验研究

目的 探讨活性巨噬细胞移植对脊髓损伤修复的促进作用.方法 用改良Allen法制成大鼠脊髓损伤模型.随机分成对照组(A组),脊髓内微量注射生理盐水20μl;活性巨噬细胞移植组(B组),脊髓内注射活性巨噬细胞悬液20μl.移植后7、14、28 d采用斜板试验、脊髓运动功能BBB(Basse,Beattie and Bresnahan)评分法观察大鼠运动功能恢复情况,脊髓诱发电位检测观察神经功能恢复,HE染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况,免疫组化法观察移植的活性巨噬细胞的存活情况及损伤部位神经纤维的再生情况.结果 术后28 d,两组斜板倾斜角度差异有统计学意义(A组44.96°±5.70°,B组52.72°±6.51°,P＜0.05);两组BBB评分差异有统计学意义(A组6.8±1.2,B组11.8±2.2,P＜0.05).同时,两组MEP潜伏期差异也有统计学意义[A组(4.69±0.47)mg,B组(3.62±1.29)ms,P＜0.05],两组SEP潜伏期差异有统计学意义[A组(4.19±1.97)ms,B组(2.01±0.55)ms,P＜0.05].两组神经轴突计数差异有统计学意义[A组(32.8±6.1)条/mm2,B组(40.8±9.0)条//mm2 P＜0.05].实验组可见损伤区巨噬细胞存在,脊髓损伤处空洞面积减小,有明显神经纤维再生.结论 活性巨噬细胞可在脊髓损伤处存活并减轻脊髓损伤,减小脊髓损伤处空洞面积,促进受损轴突的再生和运动功能的恢复.     

BMSCs联合去细胞肌肉生物支架修复大鼠脊髓半切损伤的实验研究

目的以去细胞肌肉生物支架(acellular muscle bioscaffolds,AMBS)接种BMSCs,同种异体移植修复大鼠脊髓半切损伤,观察两者联合移植对脊髓损伤的修复作用。方法取8周龄雌性SD大鼠,采用改良化学方法制备AMBS,并进行复合冷灭菌;密度梯度离心法提取、贴壁法培养BMSCs,取第3代细胞用Hoechst 33342荧光标记,采用注射法制备BMSCs-AMBS复合支架,14 d后扫描电镜及荧光显微镜观察其生物相容性。取成年雌性SD大鼠48只,制备T9～11脊髓半切损伤模型后随机分为4组(n=12),A组于缺损处移植BMSCs-AMBS复合支架,B组单独移植BMSCs,C组单独移植AMBS,D组注射PBS作为空白对照组,分别于术后1、2、3、4周行运动功能评分,术后4周行HE染色观察及免疫荧光检测。结果 Masson染色及HE染色示AMBS内部呈平行结构,主要为胶原纤维,几乎无肌纤维。BMSCs-AMBS复合培养14 d后荧光显微镜观察示Hoechst 33342标记BMSCs大量存活,扫描电镜可见BMSCs贴附于支架内表面生长。术后2～4周,大鼠BBB评分A组均高于其余3组(P<0.05),D组明显低于其余3组(P<0.05);术后4周B组明显高于C组(t=10.352,P=0.000)。术后4周,HE染色示脊髓空洞面积A组明显小于其余3组,免疫荧光染色示A组神经丝蛋白200、巢蛋白阳性细胞表达量高于其余3组,神经胶质原酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)则明显低表达。A、B组荧光示踪的BMSCs移植到体内后主要迁移至对侧灰质前角,部分分化为神经元样细胞。A、B、C、D组GFAP荧光半定量分析积分吸光度(IA)值分别为733.01±202.04、926.42±59.46、1 069.37±33.42、1 469.46±160.53,A组明显低于其余3组,D组高于其余3组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 AMBS具有相对规则的内部结构,与BMSCs有良好生物相容性,能抑制胶质瘢痕,促进BMSCs存活、迁徙、分化,是细胞移植理想的天然载体。两者联合移植修复大鼠脊髓损伤能发挥协同作用,促进运动功能恢复。     

转染胶质细胞源性神经营养因子基因的骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生的影响

目的:探讨转染胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生的影响。方法:取SD雌性大鼠的双侧股骨,冲洗髓腔分离培养得到的BMSCs,通过荧光素标记技术检测细胞表面标志物CD29、CD90、CD34、CD45,以确认是否得到BMSCs。构建GDNF过表达慢病毒用以感染BMSCs,加入感染分数分别为10、50、80、100、150、200的重组慢病毒悬液。在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况以表达细胞数量,评价转染效果,Western blot检测转染后GDNF在BMSCs中的表达,以四唑蓝比色法(MTT)法检测转染GDNF基因的BMSCs的细胞活力。将50只SD大鼠通过Allen′s打击法制备脊髓打击伤模型,造模成功后随机分为三组:A组(20只)为单纯BMSCs组,使用微量注射器移植未转染的BMSCs;B组(20只)为BMSCs转染组,使用微量注射器移植转染GDNF基因的BMSCs;C组(10只)为模型对照组,造模后脊髓内注射DMEM培养基。于造模后7d、14d、28d对大鼠进行BBB运动功能评分。各组均于造模后7d、14d、28d各取5只麻醉处死灌注取材后行HE染色并镜下观察。A、B两组采用免疫组织化学染色观察GFAP、NSE、NF-200在脊髓内的表达,以评估神经轴突生长情况。结果:经分离培养得到的细胞呈长纺锤状,以类似成纤维细胞样集落生长。流式细胞术测定结果示所培养的细胞阳性高度表达CD29、CD90,未表达CD34、CD45,表明分离培养所得细胞为BMSCs。当MOI=100时,转染12h后,BMSCs显著表达GFP,提示转染成功。Western blot结果示GDFP表达情况良好。MTT法显示转染7d后BMSCs组细胞活力明显高于未转染BMSCs组。术后7d时,三组BBB评分无显著差异。术后14d,B组的BBB评分5.80±0.19分与A组3.60±0.18分及C组3.10±0.14分相比均有显著性差异(P0.05)。术后28d,B组的BBB评分11.90±0.28分与A组8.30±0.29分及C组5.70±0.18分相比有显著性差异(P0.05)。GFAP、NSE、免疫组化染色光密度统计结果均显示A组和B组有显著性差异,B组明显优于A组,具有统计学意义(P0.05)。NF-200神经纤维长度统计结果提示B组为89.98±28.31μm,A组为23.64±13.45μm,两组之间存在显著差异(P0.05)。结论:GDNF转染BMSCs具有较高的细胞活性,能够提升BMSCs促进神经轴突再生的能力。     

骨髓基质干细胞移植联合应用G-CSF对大鼠脊髓损伤修复的影响

[目的]探讨骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)移植联合应用粒细胞集落刺激因子(granulocyt colony stimulating factor,G-CSF)对大鼠脊髓损伤的治疗修复作用。[方法]48只Wistar大鼠采用改良的Allen’s装置在T11水平制成大鼠脊髓损伤模型,随机分成4组(n=12):A组为BMSCs移植联用G-CSF组,B、C组为单纯BMSCs移植组和G-CSF治疗组,D组为损伤对照组。术后1、2、3、4周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分评价大鼠后肢神经功能恢复情况,术后4周取材HE染色观察,免疫荧光染色检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF-200)的表达变化。[结果]术后1~4周,A组评分均明显高于其他3组,D组最低,差异均有统计学意义(P0.01);B组术后3、4周高于C组(P0.01)。HE与免疫荧光染色显示,BMSCs联合应用G-CSF对脊髓损伤的修复作用最好,D组恢复最差,B、C组介于A、D组之间。A组在脊髓损伤区及周缘NSE、NF 200阳性细胞均较B组多,C组未见明显的NSE、NF 200阳性细胞,但在损伤周缘有大量的GFAP阳性细胞,并向脊髓损伤空腔内延伸;D组损伤区看见大量结构杂乱的GFAP阳性细胞,瘢痕组织形成明显,损伤区未见明显的脊髓再生现象及NSE、NF-200阳性细胞。[结论]BMSCs移植能在脊髓损伤周围存活并分化;移植联用G-CSF更能促进神经修复及功能的恢复;二者联用具有协同作用。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对脊髓损伤修复的促进作用.方法 用改良Allen法制作大鼠脊髓损伤动物模型.随机分成对照组(A组),脊髓损伤9 d后脊髓内微量注射生理盐水溶液5μl;骨髓间充质干细胞移植组(B组),脊髓损伤9 d后脊髓内注射骨髓间充质干细胞悬液5μl.移植后7、14、28 d采用斜板实验、脊髓运动功能BBB评分法观察大鼠运动功能恢复情况,脊髓诱发电位的检测观察神经功能恢复,苏木素-伊红(HE)染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况,免疫组织化学法观察移植的骨髓间充质干细胞的存活及分化情况,损伤部位神经纤维的再生情况.结果 移植后28 d,两组斜板倾斜角度差异有统计学意义[A组(44.96±5.70)度,B组(53.19±6.51)度,P＜0.05];两组BBB评分差异有统计学意义[A组(6.8±1.2),B组(10.1±3.5),P＜0.05].同时,两组MEP潜伏期差异有统计学意义[A组(4.69±0.47)ms,B组(3.97±0.83)ms,P＜0.05],两组SEP潜伏期差异有统计学意义[A组(4.19±1.97)ms,B组(2.60±0.92)ms,P＜0.05].两组神经轴突计数差异有统计学意义[A组(32.8±6.1)条/mm2,B组(39.0±4.6)条/mm2,P＜0.05].实验组可见明显星形胶质细胞和神经纤维再生,脊髓损伤处的空洞面积明显减小.结论 骨髓间充质干细胞可在脊髓损伤处分化为神经元和神经胶质细胞,能够减小脊髓损伤处的空洞面积,促进受损轴突的再生和运动功能的恢复.     

蛛网膜下腔移植人脐带间充质干细胞修复大鼠脊髓损伤

目的 观察蛛网膜下腔途径移植人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)修复大鼠脊髓损伤的疗效.方法 雌性Wistar大鼠40只建立脊髓损伤模型后随机分为:空白对照组(A组)、蛛网膜下腔DMEM注射组(B组)和hUC-MSCs移植组(C组).通过行为学及电生理学评价损伤大鼠后肢功能恢复情况.免疫荧光染色观察hUC-MSCs存活、迁移、分化,胶质酸性蛋白(GFAP)染色比较各组损伤局部胶质瘢痕面积差异.结果 移植4周后BBB评分,C组(9.19±0.26)高于A组(8.19±0.46)、B组(8.31±0.37),差异有统计学意义(P＜0.05).损伤后12周C组体感诱发电位(SEP)、运动诱发电位(MEP)潜伏期缩短和波幅值增高与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.05).hUC-MSCs到达损伤局部并向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化,分化的少突胶质细胞包绕轴突形成髓鞘.损伤局部胶质瘢痕面积C组(40 261.93±9137.56)均小于A组(203127.88±16448.84)、B组(219 622.47±18 944.89),差异有统计学意义(P＜0.05),A、B组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 hUC-MSCs可经蛛网膜下腔途径到达损伤局部并促进大鼠脊髓损伤的功能恢复.     

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞在急性脊髓损伤大鼠中的迁移和分化

目的观察绿色荧光蛋白转基因大鼠来源的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)在急性脊髓损伤大鼠脊髓组织中的迁移和分化情况。方法全骨髓贴壁培养法培养BMSCs,Allen法制作脊髓损伤大鼠模型,共30只大鼠。于造模1周后进行干预,随机选取造模成功的24只大鼠并随机分为脊髓损伤组、假移植组(生理盐水注射)和细胞移植组(BMSCs注射),每组8只。于移植前、移植后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d及42 d进行BBB(Basso,BeattieBresnahan locomotor rating scale)评分。HE染色、免疫荧光观察脊髓损伤的组织修复和BMSCs的迁移分化情况。结果从第14天始,细胞移植组大鼠的BBB评分较脊髓损伤组和假移植组大鼠高,差异具有统计学意义(P0.05)。HE染色显示细胞移植组大鼠的脊髓结构相对完整,液化和囊泡区缩小,炎性细胞减少。免疫荧光显示BMSCs聚集于脊髓损伤处,且能分化为神经元、神经胶质细胞和神经前体细胞。结论 BMSCs能向脊髓损伤部位迁移和聚集,并分化为相应的神经细胞促进脊髓功能恢复。     

静脉移植骨髓间充质干细胞在大鼠损伤脊髓中的存活与分化

目的:探讨脊髓损伤后静脉移植骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)治疗脊髓损伤的可行性。方法:体外分离、培养、扩增、纯化、BrdU(5-溴尿嘧啶)标记10只同种异体SD大鼠的BMSCs;WD法制成同种SD大鼠完全性截瘫的脊髓损伤动物模型,制模后7d随机分为A、B、C三组,A组22只,为应用BM-SCs移植组,B组22只,作为对照组,C组16只,作为空白对照组。A组经鼠尾静脉注射BMSCs悬液(2×106个/ml)1ml,B组经鼠尾静脉注射1mlL-DMEM液,C组作为空白对照组。注射后2、3、6周用免疫组织化学检测BMSCs在损伤段脊髓的存活、分布、分化情况并作计数观察。结果:A组移植后2、3、6周BrdU阳性的BMSCs主要分布于损伤段及邻近节段脊髓内;移植后2周BrdU阳性的BMSCs约占移植细胞数的4.9%,移植后3周占4.4%,移植后6周占2.9%。移植后2周,BMSCs形态大多变为圆形或椭圆形,部分阳性标记的细胞长出神经元样突起,约12.6%表达星形胶质细胞特异性蛋白GFAP,约5.4%表达神经元特异性核蛋白(NeuN)。B、C组损伤段脊髓内未见有BrdU阳性细胞。结论:脊髓损伤后静脉移植的BMSCs能在脊髓损伤灶内停留、存活,表现出对损伤灶的趋化性,部分存活的BMSCs可向神经元和星形胶质细胞分化,可用于脊髓损伤的细胞移植治疗。     

碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓基质干细胞/乙交酯-丙交酯共聚物复合体对大鼠脊髓损伤的修复作用

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因修饰的骨髓基质干细胞( BMSCs)与乙交酯-丙交酯共聚物(PI(A)构成的复合体移植于大鼠脊髓半横切处对大鼠脊髓修复的疗效。方法 240只T,半横切脊髓损伤大鼠随机平均分成4组（每组60只）后行相关材料移植：A组移植bFGF-BMSCs+PLGA,B组移植bF(F-BMSCs,C组移植BMSCs,D组仅用生理盐水冲洗。术后3d、2周、3周、8周、12周时每个时间点各组随机取12只大鼠先行BBB运动功能评分及SEP监测;后处死大鼠并取损伤区脊髓组织,6只用于RT-PCR检测bFGF基因mRNA的表达,6只用于免疫组化检测神经丝蛋白-200、生长相关蛋白-43、胶质纤维酸性蛋白的表达,并采用HE染色行形态学观察。结果 BBB评分结果：2周之前各组BBB评分均小于2分,差异均无统计学意义(P＞0.05);3周以后各组评分恢复加快且 A组评分高于其他组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。SEP监测结果：术前所有大鼠均可监测剑SEP,术中SEP显示达到潜伏期延长10％或波幅降低50％的脊髓损伤标准,术后3周之前所有大鼠均监测不到SEP,8周之后各组只有部分大鼠能监测到SEP。RT-PCR结果、HE染色及免疫组化结果均显示A组较其他组可明显促进轴突再生。结论 大鼠脊髓半横切损伤后,单纯BMSCs移植可在一定程度上促进神经再生,移植bFGF-BMSCs可改善治疗,而移植bFGF-BMSCs+ PLGA复合体可进一步提高疗效。     

壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤的实验研究

目的探讨壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的可行性。方法取成年SD大鼠胫骨及股骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs,并传代。取第3代细胞行表面抗原CD29、CD45鉴定及BrdU标记。采用冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架,并与BrdU标记的第3代BMSCs进行体外共培养;扫描电镜观察细胞黏附情况,MTT法检测支架内细胞生长情况。取50只成年SD大鼠,随机分为A、B、C、D、E组(n=10)。A～D组大鼠采用Feeney自由落体打击致伤原理制备TBI模型,造模后72 h分别移植BMSCs-壳聚糖多孔支架复合体、BMSCs、壳聚糖多孔支架和完全培养基;E组为假手术组。于造模前及造模后1、7、14、35 d,各组大鼠行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS);造模后进行Morris水迷宫测验,包括定位航行测验(造模后31～35 d连续5 d检测潜伏期)及空间探索测验(造模后35 d检测穿越平台次数);造模后36 d取标本行HE染色、BrdU与高分子量神经丝蛋白免疫组织化学双重染色以及BrdU与神经胶质酸性蛋白免疫组织化学双重染色,观察大鼠脑损伤区BMSCs的迁移与分化情况。结果流式细胞仪检测示第3代BMSCs的CD29阳性率为98.49%,CD45阳性率仅为0.85%;扫描电镜示支架-细胞共培养48 h后,BMSCs呈梭形并分泌细胞外基质黏附于支架上;MTT法检测示壳聚糖多孔支架对BMSCs的增殖分化无不良影响。TBI造模后35 d,A组大鼠mNSS评分、定位航行测验的潜伏期显著低于B、C、D组,空间探索测验的穿越平台次数显著高于B、C、D组,差异均有统计学意义(P0.05);A、E组间上述指标比较差异均无统计学意义(P0.05)。HE染色示A组壳聚糖多孔支架已部分降解,其与脑组织融合良好,修复程度优于B、C、D组。免疫组织化学双重染色结果示,A组移植的BMSCs存活、分化为神经元和神经胶质细胞,并迁移至正常脑组织内,修复程度优于B、C、D组。结论壳聚糖多孔支架介导的BMSCs移植能够明显改善大鼠TBI后的神经功能,亦能抑制大鼠脑损伤区胶质瘢痕形成,并可使BMSCs在脑损伤区存活、增殖和分化为神经细胞。     

骨髓基质干细胞和神经生长因子悬液移植对脊髓损伤修复的影响

目的研究骨髓基质干细胞(BMSCs)移植联用神经生长因子(NGF)对脊髓损伤修复的治疗作用。方法用改良Allen法制成SD大鼠脊髓损伤动物模型(共32只),1周后分别将DMEM、BMSCs、NGF和BMSCs NGF移植入脊髓损伤部位即制成四组(每组8只),移植1、2个月后分别采用神经核蛋白(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和神经丝蛋白(NF)抗体进行免疫荧光染色观察移植的BMSCs的存活及分化情况、损伤部位神经纤维的再生情况。HE染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况。同时采用BBB运动评分观察大鼠运动功能恢复情况。结果移植1、2个月后,部分移植细胞呈NeuN和GFAP阳性,同时实验组可见明显的神经纤维再生。脊髓损伤处的空洞面积明显减小,差异有显著性意义(P＜0．05),BBB评分结果比对照组均有明显增高,差异有显著性意义(P＜0．05)。在BMSCs NGF组上述改变更加显著。结论BMSCs可在脊髓损伤处分化为神经元和神经胶质细胞,BMSCs和NGF能够减小脊髓损伤处的空洞面积,促进受损轴突的再生和运动功能的恢复,两者联合应用在脊髓损伤修复治疗中具有协同作用。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的时效性分析

目的：观察脊髓损伤后不同时间点骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）移植治疗后大鼠行为学变化、脊髓的病理改变及脑源性神经营养因子（brain—derived neurotrophic factor,BDNF）和神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）表达变化,探讨BMSCs的最佳移植时间。方法：80只健康成年SD大鼠随机分为8组,每组10只。A组为假损伤组,暴露胸10段脊髓但不造成冲击伤,B、C、D、E、F、G、H组以改良Allen法建立脊髓损伤模型。造模成功后,C、D、E、F、G、H组分别于损伤后0h、6h、24h、3d、5d和7d,将lxl0。体外培养的BMSCs用微量注射器注入于脊髓损伤局部,B组为单纯造模组,用等量细胞培养液代替。各组分别于损伤后1、2、4周进行脊髓运动功能BBB（Basso,Beattie,Bresnahan）运动学评分;分别取各组脊髓损伤组织0．5cm,制作HE染色病理切片,观察其形态学改变;Elisa法检测各组大鼠脊髓BDNF和NGF表达情况。结果：假手术组1、2、4周大鼠脊髓功能BBB评分均明显高于其余7组（P〈0．01）;术后l周细胞移植各组评分与单纯造模组相比差异无统计学意义（P〉0．05）;术后2周和4周细胞移植各组评分高于单纯造模组（P〈0．05）;损伤后2周BBB评分从高到低依次为F、E、G、D、H、C组,但6组组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）;损伤后4周BBB评分,F组与其余5组（C,D,E,G,H组）比较差异有统计学意义（P〈0．05）,但其余5组组间差异无统计学意义（P〉O．05）。EUSA检测结果显示,F组BDNF和NGF含量均高于其他7组（P〈0．05）。大鼠脊髓标本切片HE染色,假手术组脊髓组织结构完整清楚,无中性粒细胞浸润;其余7组局部组织水肿明显,灰白质交界处模糊,周围可见不同程度胶质细胞增生及炎细胞浸润。结论：大鼠脊髓损伤后同种异体BMSCs移植对脊髓功能恢复有一定疗效,损伤后3d可能是BMSCs最佳移植时间。     

胶原支架结合脑源性神经营养因子移植促进全横断脊髓损伤大鼠轴突再生及运动功能恢复的研究

目的评价胶原支架结合脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)移植修复大鼠全横断脊髓损伤的效果。方法将32只成年雌性SD大鼠随机分成4组(n=8):A组为假手术组,只暴露T_9、T_(10)段脊髓;B、C、D组切除长4 mm的T_9、T_(10)段脊髓后,C、D组分别于损伤处植入相应长度的线性有序胶原支架(linear ordered collagen scaffolds,LOCS)和结合了胶原结合结构域(collagen binding domain,CBD)-BDNF的LOCS。术前及术后3个月内每周对大鼠进行BBB运动功能评分。术后3个月,实施神经电生理检测各组大鼠运动诱发电位(motor evoked potential,MEP);然后于L_2段脊髓组织注射荧光金(fluorogold,FG)实施逆行示踪,1周后取大鼠大脑及胸、腰段脊髓组织,脱水后观察脊髓组织形态;取包含损伤区的胸、腰段脊髓组织作切片。其中,脊髓冠状切片于激光共聚焦显微镜下进行观察,计算FG阳性细胞积分吸光度(IA)值;胸段脊髓组织水平切片采用免疫荧光染色,观察全横断脊髓损伤造模情况、脊髓损伤区轴突再生情况、D组再生轴突的突触形成情况。结果术后各时间点B、C、D组BBB评分均显著低于A组(P0.05);术后2～12周D组BBB评分均明显高于B、C组(P0.05)。电生理检测示,B组未观测到MEP;C、D组MEP潜伏期显著长于A组,C组显著长于D组,差异均有统计学意义(P0.05)。脊髓组织形态观察示,B组脊髓损伤区域向两端延伸,损伤部位组织破坏严重;C、D组脊髓形态恢复较好,D组更接近正常组织形态。逆行示踪结果显示,各组大鼠损伤区以下的腰段脊髓灰质中均充满了FG阳性细胞;在损伤区以上的胸段脊髓中,A组FG阳性区域IA值显著大于B、C、D组(P0.05),C、D组大于B组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。免疫荧光染色示,自同一脊髓背侧至腹侧选出的组织切片显示了明显异于正常组织的全横断脊髓损伤区域。A组NF阳性轴突数明显多于B、C、D组,C、D组多于B组,D组多于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 LOCS结合CBD-BDNF移植可以促进大鼠全横断脊髓损伤后轴突再生以及后肢运动功能恢复。     

人脐带来源Muse细胞培养、筛选、鉴定及其移植治疗大鼠脊髓损伤

目的:应用免疫磁珠筛选方法从人脐带华通胶间充质基质细胞中特异性地分选多系分化持续应激细胞(multilineage-differentiating stress-enduring,Muse),并探讨Muse细胞移植治疗大鼠亚急性脊髓损伤的安全性和有效性。方法:将捐赠的脐带华通胶剥离剪碎、胶原酶/胰酶消化、密度梯度离心获得足量间充质基质细胞,应用免疫磁珠特异性筛选SSEA3+的Muse细胞,并使用流式细胞仪及细胞免疫组织化学方法鉴定。体内实验:使用NYU-Ⅲ代大鼠脊髓损伤打击仪建立垂直打击脊髓损伤模型,分为A组(假手术组)、B组(对照组)、C组(Non-Muse细胞移植组)和D组(Muse细胞移植组)。A组大鼠接受标准化的椎板切除手术,但不进行脊髓打击;B、C、D组大鼠均接受标准化的脊髓打击损伤,10 g撞击杆于12.5 mm高度自由落下。脊髓损伤造模后2周进行细胞移植,A组大鼠仅打开伤口不接受移植操作,B、C、D组大鼠分别接受PBS注射、Non-Muse细胞移植、Muse细胞移植,每只大鼠脊髓接受四点注射法,共4×105个细胞。自脊髓损伤造模术后1 d及1、2、3、4、5、6周分别进行大鼠BBB运动功能评分,造模术后6周(即细胞移植后4周)处死动物,用免疫荧光染色研究大鼠脊髓内移植细胞存活、迁移和分化情况。结果:流式细胞仪显示脐带间充质基质细胞CD105+、CD90+和CD73+的百分比均达到99.5%以上,且CD45、CD14表达均低于0.5%,而SSEA3阳性率仅有1.46%。MACS特异性筛选后的细胞群有92.0%同时表达SSEA3和CD105,且免疫组织化学显示SSEA3呈典型的膜染色、形态特别。动物实验:A组动物在各个时间点的BBB评分均为21。单因素方差分析及LSD检验BBB评分情况:细胞移植后6周,C、D组与B组比较差异均有统计学意义(P=0.004,0.002),C组和D组比较差异无统计学意义。进一步组内配对t检验表明,C组第4周与第3周比较差异有统计学意义(P=0.005);D组第4周与第3周比较差异有统计学意义(P=0.016),且第6周与第5周比较差异有统计学意义(P=0.034),说明大鼠运动功能持续改善。脊髓免疫组织化学染色显示,Muse细胞和Non-Muse细胞均由注射点向损伤区迁移,但Muse细胞存活数量明显多于Non-Muse细胞,且在损伤区均匀分布。结论:特异性免疫磁珠筛选是获得高纯度Muse细胞的良好高效的方法,Muse细胞可在大鼠损伤脊髓内大量存活4周并向损伤区迁移,且能持续改善大鼠运动功能,Muse细胞有望成为治疗脊髓损伤的一种新的种子细胞。     

大鼠脊髓损伤后不同时期移植人脐带间充质干细胞的修复效果观察

目的:观察大鼠脊髓损伤后不同时期局部移植人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchy-mal stem cells,hUCMSCs)修复脊髓损伤的效果,探讨hUCMSCs局部移植治疗脊髓损伤(spianl cord injury,SCI)的最佳移植时机。方法:雌性Wistar大鼠80只,随机均分为A、B、C、D组,以Impactor Model-Ⅱ打击器制备脊髓胸10(T10)损伤模型。A组为单纯损伤组,B组损伤后3d移植hUCMSCs,C组损伤后1w移植hUCM-SCs,D组损伤后3w移植hUCMSCs,分别于造模后24h、移植前1d及移植后8w(A组与D组损伤后相应时间点相同)每周对各组大鼠后肢功能进行行为学评分(BBB评分);移植后8周免疫组化染色观察移植细胞的存活、分化和血管再生情况,10周时用生物素葡聚糖胺(biotin dextran amine,BDA)示踪皮质脊髓束(corticospinaltract,CST)观察轴突的再生情况。结果:SCI后24h各组大鼠BBB评分无显著性差异(P0.05),D组在移植前和移植后1周与A组相应时间点的BBB评分无显著性差异(P0.05),移植后2w起各时间点评分均明显高于A组相应时间点,差异有统计学意义(P0.05);A组在SCI后9w时到达平台期,与实验结束时相比差异无统计学意义(P0.05)。移植各组移植后BBB评分逐渐上升,后一个时间点与同组前一时间点比较差异有显著性意义(P0.05),移植后6w开始C组明显高于B、D组(P0.05)。免疫组化染色A组脊髓中未见Brdu阳性细胞,损伤区血管形态欠完整,未见新生血管;损伤周围星形胶质细胞大量增生,细胞肥大、突起增多、排列不规则,形成胶质瘢痕;未见BDA标记的皮质脊髓束通过损伤区。B、C、D组脊髓中均有Brdu阳性标记的细胞存活,C、D组中细胞数量明显多于B组,但三组中均未见到移植细胞向神经元或神经胶质样细胞分化;B、D组损伤周围的星形胶质细胞较A组减少,但排列仍欠规则;C组损伤周围星形胶质细胞形态趋于正常,排列规则,且有大量星形胶质细胞通过损伤区,血管再生数目及通过损伤区的皮质脊髓束神经纤维也明显多于B、D组。结论:大鼠SCI后局部移植的hUCMSCs能长期存活,抑制胶质瘢痕形成,改善后肢运动功能;SCI后1w移植的效果优于SCI后3d和3w时移植的效果。