联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

体内构建组织工程骨的示踪观察：CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性研究

目的探索组织工程骨体内成骨时,CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性,为种子细胞的体内转归研究提供标记方法。方法分离比格犬BMSCs,成骨诱导至第2代,用荧光染料CM-DiI进行细胞标记。荧光倒置显微镜观察标记后的细胞形态,MTT比色法测定标记前后BMSCs的增殖状况,检测标记前后Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、骨形态发生蛋白（BMP-2）、骨钙素（BGLAP）和骨黏连蛋白（SPARC）的表达。最后,CM-DiI荧光标记后的BMSCs与β-TCP复合共培养后植入比格犬背部皮下,8周后取材,荧光显微镜下观察BMSCs体内转归,HE染色观察异位成骨情况。结果CM-DiI标记后早期细胞呈现红色荧光,48 h后荧光增强,72 h内荧光强度无明显减弱。BMSCs在CM-DiI标记前后细胞形态基本一致,两组间细胞的增殖率无明显差别;标记后RT-PCR检测Col-Ⅰ、BMP-2、BGLAP、SPARC表达,显示标记后的BMSCs亦可向成骨方向分化。扫描电镜检测到标记后细胞在β-TCP上增殖良好,细胞基质分泌丰富。细胞-支架复合物植入比格犬皮下,8周后荧光显微镜观察到标记细胞仍存在,且HE染色可见支架孔隙中有类骨基质沉积。结论CM-DiI对BMSCs的生长增殖、成骨分化无明显影响,对体内组织工程骨中BMSCs的示踪时间可长达8周,可用作体内细胞的长效示踪剂。     

小剂量阿司匹林对去势大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]检测不同浓度低剂量阿司匹林对去势后(OVX)大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响.[方法]建立SD大鼠去势模型,全骨髓贴壁法培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传代4次后进行成骨诱导,建立对照组和不同浓度阿司匹林组(0.25、0.5、1、2及5mmol/L).于不同的培养时间点,倒置显微镜观察并进行MTT检测细胞增殖生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测培养细胞上清ALP活性;于诱导7d和21d时分别行细胞碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色.[结果]阿司匹林无明显促进BMSCs增殖作用,而大剂量阿司匹林(5 mmol/L)具有抑制BMSCs增殖作用.实验组(0.25、0.5、1、2 mmol/L阿司匹林组)细胞培养上清中ALP浓度较对照组显著增强(P＜0.05);碱性磷酸酶染色(1、2 mmol/L组)阳性表达增强;茜素红染色显示,实验组(0.5、1、2mmol/L组)钙结节数量、钙化面积均高于对照组(P＜0.05).[结论]阿司匹林不能直接促进去势大鼠BMSC增殖活性,但小剂量阿司匹林可显著提高体外培养BMSC成骨活性,增强钙盐沉积,促进钙结节形成.     

miR-21对骨质疏松小鼠骨髓基质细胞增殖的影响

目的探讨miR-21对骨质疏松小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)增殖的影响。方法采用双侧卵巢切除法构建骨质疏松小鼠模型(VOX),分离、培养、纯化小鼠BMSCs并采用si PORT Neo FX转染pre-miR-21、pre-miR-negative control(pre-miR-NC)、antmiR-21、ant-miR-negative control(ant-miR-NC)并进行RT-PCR验证,MTT法检测小鼠BMSCs增殖情况、茜素红与碱性磷酸酶染色法检测小鼠BMSCs成骨能力、Western-blotting检测细胞增殖、成骨分化相关蛋白水平。结果骨质疏松症小鼠BMSCs中miR-21相对表达水平低于Ctrl组(P0.05),OVX-pre-miR-21组BMSCs中miR-21相对表达水平、细胞增殖、PCNA水平、Ki-67水平、ALP染色程度、ALP活性、茜素红染色程度、Runx2水平、Osterix水平均高于OVX-pre-miR-NC组(P0.05),OVX-premiR-NC组BMSCs中miR-21相对表达水平、细胞增殖、PCNA水平、Ki-67水平、ALP染色程度、ALP活性、茜素红染色程度、Runx2水平、Osterix水平均显著低于Ctrl-pre-miR-NC(P0.05); OVX-ant-miR-21组BMSCs中miR-21相对表达水平、细胞增殖、PCNA水平、Ki-67水平、ALP染色程度、ALP活性、茜素红染色程度、Runx2水平、Osterix水平均显著低于OVX-ant-miR-NC组(P0.05),OVX-ant-miR-NC组BMSCs中miR-21相对表达水平、细胞增殖、PCNA水平、Ki-67水平、ALP染色程度、ALP活性、茜素红染色程度、Runx2水平、Osterix水平均显著低于Ctrl-ant-miR-NC(P0.05)。结论提高miR-21表达水平可促进骨质疏松小鼠BMSCs增殖能力与成骨分化能力。     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

PKH26标记法在组织工程神经种子细胞体内示踪中的应用

目的 探讨PKH26标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)的效果及其应用于组织工程神经种子细胞体内示踪实验的可行性.方法 取Wistar大鼠股骨和胫骨的骨髓,用全骨髓贴壁的方法分离、培养BMSCs.用PKH26荧光染料进行标记,荧光显微镜下观察标记效果,流式细胞仪检测荧光标记率,MTT法测定细胞的活性,体外成脂和成骨诱导鉴定细胞的分化能力,并与未标记细胞进行比较;使用显微注射的方法将BMSCs植入去细胞神经支架内制备成组织工程神经,于体外培养3 d、5 d、7 d、14 d,行组织切片,观察BMSCs在支架内存活、迁移的情况.另外,将体外构建组织工程神经桥接Wistar大鼠坐骨神经15 mm的缺损,于术后1周、4周、6周、8周取出移植物,行组织切片观察植入的BMSCs在支架内的存活情况.结果 PKH26能有效地标记BMSCs,标记率达95%以上,标记后细胞活性及诱导成骨成脂分化能力与未标记细胞无明显差异.在体外培养的环境下,BMSCs能在去细胞神经支架里粘附生长,并沿着支架迁移;在体内外周围神经再生的微环境下,BMSCs可存活8周以上.结论 PKH26荧光染料标记法是一种有效的标记BMSCs的方法,可用于组织工程神经种子细胞体内示踪的研究.     

不同组织来源间充质干细胞体外成骨分化能力的比较研究

目的比较成人脂肪间充质干细胞(ASCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)和成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨能力,选择优势干细胞种类作为应用于骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。方法采用含10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12培养液培养3种MSCs。取3种MSCs的P3代,通过CCK8方法检测其增殖能力;通过流式细胞仪进行鉴定;通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测骨分化蛋白ALP的分泌和矿化钙结节的沉积,并对钙结节进行定量分析;通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)方法检测骨再生相关基因的表达。结果 3种P3代MSCs在3~5d之间增殖均处于对数生长期;流式鉴定3种细胞的表面标志物阳性率:CD44、CD90和CD105均高于97%,阴性率:CD14、CD34和CD45均低于1%;ALP染色结果显示3种MSCs成骨诱导9d时,细胞内均表达ALP,茜素红染色结果显示成骨诱导18d时,均呈现较好的矿化能力,BMSCs和UC-MSCs成骨诱导后形成的钙结节无显著性差异;RT-q PCR结果显示3种MSCs成骨诱导组相比较于对照组,成骨再生相关基因Osterix、ALP、I型胶原(COL1)和骨钙素(OCN)均显著性高表达;3种MSCs成骨诱导9d时,UC-MSCs实验组的COLI基因表达显著性高于BMSCs,成骨诱导18d时,ASCs实验组的Osterix基因表达显著性高于BMSCs。结论 ASCs和UC-MSCs具有一定的成骨矿化能力,有望成为骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。     

PKH26与BrdU体外双重标记兔BMSCs在心肌补片中的实验研究

目的观察PKH26与BrdU体外双重标记兔BMSCs的生物学特性,并体外构建组织工程心肌补片。方法取6月龄新西兰大白兔分离培养BMSCs,并用细胞膜荧光染料PKH26和细胞核标记物BrdU对BMSCs进行标记,通过倒置相差显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、MTT法观察细胞生长状态和荧光标记前后细胞生物学特性的变化;ALP、茜素红、油红O染色及骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白等免疫细胞化学技术检测,观察和评价标记前后BMSCs体外分化为成骨细胞和成脂细胞的能力。将标记细胞与小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)复合后共培养5～7d构建组织工程心肌补片,在倒置相差显微镜、荧光显微镜和扫描电镜下观察细胞在SIS上的生长情况,并做活体及石蜡包埋HE染色观察。结果标记后细胞生长状态良好,基本生长特性无明显改变;荧光显微镜下可见标记后细胞膜上红色荧光呈颗粒状分布;细胞表面干细胞标志性抗原表达与标记前无明显差异。标记后的BMSCs成骨诱导后,ALP、茜素红染色阳性,细胞表达骨钙素及Ⅰ型胶原蛋白;成脂诱导后,细胞胞浆内出现明显的脂滴。标记细胞与SIS共培养5～7d后,标记细胞生长状态良好,在材料上呈现出多层细胞结构。活体及石蜡包埋后HE染色可见细胞生长状态良好。结论兔BMSCs能被PKH26和BrdU稳定标记;标记的细胞在体外具有自我更新和多向分化的能力;标记的BMSCs与SIS体外复合培养可以构建组织工程心肌补片。     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

miR-124-3p靶向Axin1 调控糖尿病骨质疏松成骨的研究

目的 研究miR-124-3p靶向Axin1 调控糖尿病骨质疏松症大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs）成骨分化的作用。方法 20只糖尿病大鼠模型-SPF级SD雌性大鼠分为分组对照组10例、实验组10例，经过药物注射，测血生化指标，测骨密度。BMSCs培养，流式细胞学鉴定。检测对照组和实验组miR-124-3p mRNA的表达。过表达miR-124-3p（模拟物）7、14、21 d，检测ALP、茜素红染色成骨能力。第7天检测miR-124-3p mRNA表达水平。实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，分为高糖组和低糖组，检测中Axin1 mRNA水平。构建载体，与模拟物共转染，荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1靶向结合。将实验组BMSCs分为高糖组和低糖组，检测实验组BMSCs高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。检测实验组模拟物在高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。结果 ELISA检测血生化指标，实验组TG、TC、FPG、HbA1C值上调，β-CTX和SOST上调，OC和骨密度下调。BMSCs培养，流式细胞学鉴定显示CD73和CD105的表达为阳性， CD34 和 CD45 的表达呈阴性。符合间充质干细胞的抗原特点，证实为BMSCs。实验组miR-124-3p表达明显低于对照组。过表达miR-124-3p（模拟物）7、14、21 d，ALP、茜素红染色随时间逐渐升高。第7天miR-124-3p表达水平显著升高。实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，结果高糖组Axin1 mRNA表达水平上调，但用miR-124-3p模拟物转染时水平下降。荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1可以靶向结合。RT-qPCR检测实验组BMSCs高糖摄入显著降低了miR-124-3p、Runx2表达；高糖可抑制成骨分化，减少钙沉积，减少ALP表达。高血糖条件下miR-124-3p过表达（模拟物）中Runx2的表达显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。茜素红染色和ALP染色显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。结论 miR-124-3p能通过靶向抑制Axin1促进糖尿病骨质疏松症大鼠BMSC的成骨发生。     

双基因pCDNA 3.1-NGF-IRES-BMP2真核质粒转染大鼠BMSCs诱导成骨的研究

[目的]研究双基因NGF与BMP2转染大鼠BMSCs并诱导BMSCs成骨分化后表达情况。[方法]将第三代大鼠BMSCs,分为五组,单基因pCDNA3.1-NGF转染组(A组),单基因pCDNA3.1-BMP2转染组(B组),双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2转染组(C组),空质粒对照组(D组)、阴性对照组(E组)。运用Lipofectamine2000介导将各组基因转染BMSCs,Western-blot检测目的基因蛋白表达情况,免疫组织化学染色检测I型胶原蛋白表达含量并测定灰度值。ALP试剂盒检测ALP表达含量,茜素红染色测定转染后各组钙结节并计数。[结果]各组基因转染BMSCs后,Western-blot、I型胶原免疫组化染色、ALP试剂盒检测、茜素红染色钙结节及统计学分析均提示双基因转染组的目的蛋白表达量、I型胶原蛋白表达量、ALP表达量、钙结节形成数目均高于单基因转染组、空质粒组及阴性对照组。[结论]转染双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2组BMSCs可同时表达两种目的蛋白,能诱导BMSCs向成骨细胞分化,NGF的加入能够增强BMP2的成骨作用。     

钽涂层对骨髓间充质干细胞的黏附增殖及成骨分化的影响

目的探讨钽涂层金属在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、增殖及成骨分化方面的作用。方法在体外取6只6周龄SD大鼠BMSCs进行原代培养至第3代,使用化学气相沉积系统自行制备钽涂层金属。然后进行流式细胞术鉴定、BMSCs三向诱导、荧光染色、细胞增殖检测及实时荧光定量聚合酶链反应技术(Q-PCR)试验。观察比较BMSCs在钛合金圆片(Ti6Al4V组)和钽金属圆片(Ta组)表面黏附的BMSCs数量、增殖速率、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨粘连蛋白(OSN)和骨桥蛋白(OPN)的表达情况。结果流式细胞术结果显示CD44(94.55%)、CD90(95.01%)、CD34(0.06%)。诱导成骨分化14 d后碱性磷酸酶(ALP)染色阳性;诱导成骨分化21 d后出现茜素红钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色呈阳性;成软骨诱导21 d后阿利新蓝染色评估有软骨形成能力。激光共聚焦显微镜结果显示BMSCs在Ti6Al4V组和Ta组金属圆片表面贴附生长,细胞间互相接触、聚集成片,Ta组金属圆片上黏附的BMSCs数量明显多于Ti6Al4V组,并且具有更好的延展性能。细胞增殖检测结果发现,分别共培养1、3、5、7 d后Ta组BMSCs的增殖速率明显快于Ti6Al4V组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Q-PCR结果发现,与Ti6Al4V组相比,体外培养7 d后Ta组金属圆片更能促进OSN和OPN的表达,差异有统计学意义(P<0.05);体外共培养21 d后,Ta组金属圆片更能促进OSX、RUNX2、OSN和OPN的表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论相比于传统的骨科植入物钛合金而言,钽涂层金属能够更好地促进BMSCs的黏附,增殖和成骨分化。     

脂联素通过调节BMP信号通路促进骨髓干细胞成骨分化

目的 研究脂联素（adiponectin, ApN）对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）成骨分化的作用,并探讨其可能的机制。方法 体外培养BMSCs,构建ApN过表达质粒及干扰质粒,转染至BMSCs中。将BMSCs随机分为5组：对照组、过表达组、过表达空载组、干扰组和干扰空载组。茜素红染色观察各组细胞钙化沉积。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色观察各组细胞成骨分化能力。qRT-PCR检测ApN受体、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号通路及成骨相关基因表达情况。结果 与对照组相比,过表达组BMSCs中钙化沉积和ALP阳性表达增多,AdipoR1、AdipoR2、BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表达量显著升高（P<0.05）;干扰组BMSCs中钙化沉积和ALP阳性表达减少,AdipoR1、AdipoR2、BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表达量显著降低（P<0.05）。结论 ApN可能通过上调BMP信号通路促进BMSCs成骨分化。     

载基因脂多糖胺纳米囊泡诱导BMSCs定向成骨分化

目的制备并优化阳离子载体脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)性能,探讨其负载靶基因后体外诱导BMSCs定向成骨分化能力。方法采用接枝共聚的方法合成LNPs,探讨合成时不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0)对LNPs及LNPs/pBMP-2-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)复合物理化性能的影响;通过体外大鼠BMSCs细胞毒性及转染实验,筛选出具低毒高转染效能的LNPs,再用其负载pBMP-2-GFP基因转染大鼠BMSCs,通过定期观察细胞形态、测定细胞表达BMP-2蛋白水平和ALP活性、钙结节生成情况来评价LNPs/pBMP-2-GFP对BMSCs成骨分化的影响。结果 pH为8.5时合成的LNPs含氮量、粒径及zeta电位均低于其余pH值组,其细胞毒性最低(细胞成活率96.5%±1.4%)、转染效率最高(98.8%±0.1%)。BMSCs经LNPs/pBMP-2-GFP转染诱导处理后,在前4 d内,其BMP-2蛋白表达量均明显高于Lipofectamine2000(Lipo)/pBMP-2-GFP组、支链型聚乙烯亚胺25K/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05)。诱导后14 d其ALP活性高于Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05),与成骨诱导液处理组相当(P0.05);茜素红染色显示其和成骨诱导液处理组细胞出现明显钙结节,而Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组细胞出现凋亡、未见明显钙结节;诱导后21 d镜下观察见细胞中出现透明块状结节,呈成骨细胞形态特点。结论 pH为8.5时合成的LNPs具有低细胞毒性、高转染效率,能高效介导BMP-2基因转染大鼠BMSCs,并成功诱导BMSCs成骨定向分化,其成骨诱导效果与成骨诱导液处理相当。LNPs介导的基因转染可能是诱导干细胞定向分化的一种简便有效的手段。     

KLD-12多肽/重组人BMP-2凝胶诱导兔BMSCs成骨活性的实验研究

目的探讨KLD-12多肽复合重组人BMP-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)诱导兔BMSCs成骨活性的影响。方法取3月龄新西兰大白兔骨髓,采用密度梯度法分离培养BMSCs。取第3代BMSCs分别采用KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶三维培养(实验组)和KLD-12多肽凝胶培养(对照组)。培养7 d倒置相差显微镜下观察实验组细胞在凝胶内的形态;3、7、10、14、21 d检测两组细胞培养基中ALP及骨钙蛋白含量;培养14 d两组行Ⅰ型胶原免疫荧光染色观察,实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白基因相对表达量。结果倒置相差显微镜下观察,培养7 d实验组及对照组凝胶内BMSCs呈圆形,分布均匀。两组培养3、7 d时ALP表达量及骨钙蛋白含量比较差异无统计学意义(P0.05),10~21 d实验组以上指标均明显高于对照组(P0.05)。培养14 d,激光共聚焦显微镜观察示,实验组Ⅰ型胶原免疫荧光染色阳性,且荧光强度较对照组高;实时荧光定量PCR检测实验组Ⅰ型胶原、骨钙蛋白基因相对表达量均显著高于对照组,比较差异有统计学意义(t=15.902,P=0.000;t=12.998,P=0.000)。结论 BMSCs在KLD-12多肽内正常生长并增殖,KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶诱导BMSCs向成骨细胞分化的生物活性良好。     

转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的:用腺病毒载体将人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因导入兔骨髓基质干细胞(BMSCs),种植PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,流式细胞仪和ALP活性检测分析基因转染对细胞增殖分化的影响.然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,S期细胞比例和ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:BMP-2基因转染BMSCs,可促进细胞增殖分化.转染后细胞在PLA/PCL支架上生长良好,BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功.     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化研究的体外实验

目的 分离培养较高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,检测其多向分化潜能.方法 采用密度梯度离心结合差速贴壁法分离培养大鼠BMSCs,观察细胞形态,检测表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90表达情况,及其成骨、成脂、成神经诱导后茜素红染色、油红O染色和NSE、GFAP免疫荧光染色情况.结果 细胞呈典型的成纤维细胞样形态,CD44和CD90呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达,细胞纯度＞98%.成骨、成脂、成神经诱导后,茜素红染色、油红O染色、NSE和GFAP免疫荧光均为阳性.结论 密度梯度离心结合差速贴壁法可分离、培养出高纯度的大鼠BMSCs,该细胞具有成脂、成骨、成神经多向分化潜能,是脊髓损伤修复的一种较理想的种子细胞.     

体外负压培养对hBMSCs成骨活性影响的初步研究

[目的]探讨体外负压培养对hBMSCs成骨活性的影响.[方法]取第3代hBMSCs分为实验组和对照组,实验组进行间歇性负压培养,设置压力为17 kPa,30 min/次,4次/d,干预2周;对照组于普通CO,培养箱中常规培养.倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡,检测ALP活性,茜素红染色观察钙节结形成,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和VEGF的表达.[结果]诱导2周,实验组细胞增殖能力下降,S期细胞百分比为(5.14±1.56)%,较对照组(13.45±3.51)%约下降62.4%,细胞凋亡增加.实验组ALP活性为(15.68±1.97)mU/mg,对照组为(6.344±1.21)mU/mg,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,实验组钙结节形成增多,VEGF表达较对照组显著提高;实验组Ⅰ型胶原表达呈阳性,对照组呈阴性反应.[结论]负压能抑制hBMSCs增殖,促进细胞凋亡,但可以提高细胞成骨活性.