胰岛素基因转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架构建组织工程脂肪的研究

目的 探讨携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细细( human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)与丝素蛋白支架在体外构建组织工程化脂肪(tissue engineering adipose)的可行性.方法 以最适感染复数(MOI)为10重组慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP转染hUCMSCs组为实验组(A组),EGFP基因转染组为对照组(B组);将两组细胞接种于丝素蛋白支架,观察细胞在支架上的生长及黏附情况;尔后行细胞-支架复合物成脂诱导.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测重组慢病毒转染对hUCMSCs生长增殖的影响以及基因转染后的hUCMSCs在丝素蛋白支架上的活性.结果 细胞-支架复合物成脂诱导5～7 d后,见A组支架内脂肪样细胞数量明显多于B组,差异有显著统计学意义(P=0.007,P＜0.01);逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测显示,A组hUCMSCs表达的成脂特异性基因PPARγ-2明显高于B组.MTT法检测结果显示,转染重组慢病毒的hUCMSCs与未转染组各时间点吸光度A值比较,差异均无统计学意义(P=0.056,P＞0.05).细胞组与细胞支架组A值比较,差异无统计学意义(P=0.066,P＞0.05).结论 转染胰岛素基因的hUCMSCs成脂分化能力明显提高,且能有效地与丝素蛋白支架在体外构建组织工程化脂肪.     

产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因和草酰辅酶A脱羧酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建国人肠道来源产甲酸草酸杆菌(OxCF)甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)基因(FRC)和草酰辅酶A脱羧酶(OCoAD)基因(OXC)的重组慢病毒pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,为高草酸尿症的基因治疗奠定基础.方法 采用Taq高保真DNA聚合酶从OxCF基因组中扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接获得FRC和OXC的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并测序,筛选携带完整目的基因质粒pMD18T simple-FRC和pMD18T simple-OXC,用BamH Ⅰ酶切获得目的基因,连接FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6.3/v5DEST-IRES-EGFP,连接OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-DsRED,转化DH5α后挑取阳性克隆并测序.构建的慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染HEK293T细胞,包装并测滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)从OxCF基因组中扩增分获得1.3kb和1.7kb的DNA片段,与Genbank中FRC( U82167)间碱基序列匹配率为95.88％,存在53个碱基的变异;与Genbank中OXC( M77128)间碱基序列匹配率为93.61％,存在109个碱基的变异;测序证实pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED分别含有大小正确的正向FRC cDNA和OXC cDNA,转染HEK293T细胞实验24h后,在荧光显微镜下相应可见大量绿色荧光和红色荧光,两种慢病毒滴度分别为1.15×108 TU/ml和9.75×107 TU/ml.结论 成功构建表达OxCF中草酸分解关键基因FRC和OXC的重组慢病毒载体,并通过转染293细胞制备了高滴度慢病毒.     

慢病毒载体介导的低氧诱导因子-1α在脂肪源性干细胞中的表达

目的 构建携带有增强绿色荧光蛋白(EGFP)和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的重组慢病毒载体,并感染人脂肪源性干细胞(hADSCs).方法 重组慢病毒载体Lenti-hHIF-1α-EGFP转染293T细胞,进行病毒包装并测定病毒滴度.按照MOI=20将Lenti-hHIF-1α-EGFP转染hADSCs,流式细胞仪分选EGFP标记的细胞.对转染后的hADSCs进行多向分化能力鉴定,并检测hADSCs内hHIF-1α的表达.结果病毒滴度为5×107 pfu/ml.Lenti-hHIF-1α-EGFP转染hADSCs后第3天,荧光镜下观察转染效率70％,经流式细胞仪分选后,98％以上的细胞均有EGFP的表达.转染后的hADSCs茜素红染色及油红O染色阳性,表明hADSCs仍具有多向分化的潜能.hADSCs可以高表达HIF-1α.结论成功构建带有报告基因EGFP和目的基因hHIF-1α的慢病毒表达系统,并以慢病毒为载体将hHIF-lα整合到hADSCs中实现其高效表达.     

慢病毒介导兔脑红蛋白基因感染骨髓间充质干细胞的实验研究

[目的]构建携带兔脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)基因的重组慢病毒,感染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs),建立稳定表达兔Ngb的BMSCs/Ngb细胞。[方法]构建携带Ngb基因的重组慢病毒载体,在脂质体Lipofectamine 2000作用下转染293 T细胞,Real-time PCR检测慢病毒滴度;以Ngb重组慢病毒感染BMSCs,通过荧光表达法判定感染复数(multiplicities of infection,MOI),实时荧光定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印迹(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)判定感染后的BMSCs中Ngb的表达情况。[结果]构建Ngb重组慢病毒载体,经酶切及测序鉴定完全正确,能够转染293 T细胞并表达,滴度为2×108 TU/ml,Ngb重组慢病毒感染BMSCs最佳MOI值为100,且Ngb重组慢病毒感染BMSCs能持续稳定高水平表达Ngb mRNA和蛋白。[结论]成功构建Ngb重组慢病毒,并将Ngb基因稳定感染至BMSCs中,实现Ngb的持续稳定高水平表...     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的：构建人LMP-1重组慢病毒载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,检测LMP-1基因在大鼠骨髓间充质干细胞的表达。方法：利用PCR法从cDNA文库中钓取LMP-1基因,将其与经AgeI酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU-EGFP相连接,转化感受态大肠杆菌,筛选出阳性克隆pGC-FU-LMP-1-EGFP,基因测序对其鉴定。经293T细胞包装后,收集富舍病毒颗粒LV-LMP-1-EGFP的细胞上清,浓缩并标定滴度,RT-PCR检测并鉴定。以最佳MOI值体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察转染是否成功,流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR和Westernblot检测转染细胞LMP-1基因的表达。结果：①基因测序及RT-PCR检测证实携带人LMP-1基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为2×10^8 TU／ml的LV-LMP-1-EGFP。②以MOI=100转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率可达93．5％,经RT-PCR与Westernblot检测,被转染细胞内有LMP-1基因表达。结论：成功构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体,可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞,被转染细胞可高效表达LMP-1基因。     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在椎间盘髓核细胞中的表达

目的本研究构建含绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒,并观察其在人椎间盘髓核细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因导人慢病毒载体质粒pLenti6／V5 TOPO,应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒、包膜蛋白质粒等）共转染入293细胞进行包装,48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72h收集病毒上清并感染髓核细胞,在荧光显微镜下感染情况。结果重组慢病毒滴度测定约为10^7U／mL。感染人椎间盘髓核细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了含GFP的慢病毒载体,且能成功将目的基因转入椎间盘髓核细胞并表达。     

人前脑啡肽基因修饰人胚胎肾细胞的构建

目的 构建人前脑啡肽基因(hPPE)修饰的人胚胎肾细胞(HEK293细胞).方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/hPPE经限制性内切酶HindⅢ和Not Ⅰ进行双酶切获得hPPE基因,运用基因重组技术将hPPE基因与表达载体同源重组,转染293T细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,测定病毒滴度,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞.用Western blot法检测hPPE基因在HEK293细胞中的表达.结果 重组慢病毒载体阳性克隆测序结果和基因库的hPPE基因序列完全一致.含有hPPE基因的慢病毒载体,滴度为2.07×108TU/ml.转染慢病毒载体后的HEK293细胞,在荧光显微镜下未见到GFP荧光.转染Ubc-GFP-L.V.空病毒载体的HEK293细胞,可见到较强的荧光.Western blot法检测到经慢病毒载体转染后的HEK293细胞中hPPE基因表达呈阳性.结论 成功构建了hPPE基因修饰的HEK293细胞,使hPPE基因可在HEK293细胞中稳定表达.     

组织激肽释放酶、绿色荧光蛋白双基因共表达载体的构建及其对平滑肌细胞增殖的影响

目的构建人组织激肽释放酶（HKl）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的逆转录病毒双基因共表达载体并探讨其对血管平滑肌细胞（SMCs）增殖的影响。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增人HKl基因，通过基因重组构建HKl和EGFP逆转录病毒双基因共表达载体，经酶切及测序鉴定正确后，包装成为重组逆转录病毒rRV-HKl-IRES-EGFP，病毒感染SMCs细胞后，荧光显微镜和Western blot检测HKl基因的表达情况。结果成功构建了带有EGFP的HKl基因的逆转录病毒表达载体，并将其转入SMCs细胞，感染后SMCs增殖受到抑制。结论构建的HKl基因逆转录病毒可在体外高效表达，为HKl基因治疗的研究奠定了基础。     

携带人VEGF_(165)和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达

[目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pTrack-CMV中,构建携带双基因的腺病毒穿梭载体pTrack-CMV-VIA。进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测制备的腺病毒pAd-VIA感染的大鼠骨髓基质干细胞中外源基因VEGF165及Ang-1的表达。[结果]该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,证明基因序列正确。转染QBI-293A细胞后,可观察到GFP明显表达。重组合腺病毒载体pAd-VIA获得成功包装,扩增后病毒滴度为2×1010PFU/ml,大鼠骨髓基质干细胞转染48 h后,绿色荧光蛋白表达阳性,ELISA结果显示转染组在感染48 h后,培养细胞上清中的VEGF165浓度为(42.5±2.082)ng/105细胞,ANG-1浓度为(16.67±2.08)ng/105细胞,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,有统计学差异(P0.05)。[结论]成功构建携带人VEGF165、ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

人色素上皮衍生因子慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人色素上皮衍生因子(human pigment epithelium-derived factor,hPEDF)慢病毒载体,包装过表达PEDF的慢病毒,构建过表达PEDF的人角质形成细胞(human keratinocyte, Ha Ca T)的细胞株。方法将PEDF基因插入慢病毒载体p LVX-IRES-puro,构建p LVX-IRES-puro-PEDF慢病毒重组质粒并转染293T细胞,包装获得病毒上清,进行病毒扩增,收集病毒上清液,测定扩增后的病毒滴度。扩增后的病毒上清液以最佳感染复数感染体外培养的Ha Ca T细胞作为Ha Ca T-PEDF组(实验组),同时以含有空载体的慢病毒感染Ha Ca T细胞株作为Ha Ca T细胞组(对照组),扩增72 h后收集两组细胞及条件培养基,通过实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(western blot, WB)技术检测各组细胞PEDF基因m RNA以及蛋白的表达情况,通过酶联免疫吸附试验检测两组细胞PEDF蛋白分泌情况。结果经限制性内切酶酶切鉴定、Sanger测序证实,成功构建了携带PEDF基因的重组慢病毒表达载体,且包装的慢病毒滴度可达1×107pfu/ml。RT-PCR和WB检测结果显示,实验组细胞中PEDF的m RNA和蛋白均显著高于对照组(P0.05),并能分泌至细胞外。结论成功构建了表达PEDF基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功感染Ha Ca T细胞,并高表达PEDF蛋白。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控的重组腺病毒的构建及其在膀胱癌细胞中的表达

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的腺病毒系统，观察其在膀胱癌细胞中的表达。方法构建带有hTERT启动子的腺病毒穿梭载体pDC315-Tp—EGFP，细胞重组技术获得腺病毒Ad-hTERT-EGFP，按感染复数（MOI）100体外转染膀胱癌细胞株253J及人胚肺成纤维细胞株MRC-5，通过倒置荧光显微镜和Rt—PCR分别检测EGFP的表达。带有小鼠巨细胞病毒（mCMV）启动子的腺病毒Ad-EGFP作为阳性对照。结果成功构建出重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP，滴度为3．8×10^10空斑形成单位（pfu）／ml，Ad—hTERT-EG-FP感染的253J细胞中，（85．2±3．3）％发出明亮的绿色荧光；而其感染的MRC-5细胞未产生绿色荧光（P〈0．01）；对照病毒Ad-EGFP在253J和MRC-5中分别有（87．1±2．2）％及（92．5±3．1）％的细胞可见到绿色荧光。RT-PCR检测显示：253J细胞转染Ad-hTERT-EGFP、Ad-EGFP后及MRC-5细胞转染Ad-EGFP后均有EGFP基因表达；而MRC-5细胞转染Ad-hTERT-EGFP后未见EGFP基因表达。结论该腺病毒系统中hTERT启动子调控下游基因可选择性地在膀胱肿瘤细胞中表达，在正常细胞中不表达，具有明显的靶向性。     

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠软骨细胞表达的研究

[目的]构建携带绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体系统,通过感染大鼠软骨细胞,观察其感染能力及GFP的表达情况.[方法]以载体质粒pLentiLox 3.7、包装质粒pRSV-REV、pMDL g/p RRE及包膜质粒VSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.分离、培养大鼠关节软骨细胞,将制备好的慢病毒颗粒感染软骨细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况.[结果]重组慢病毒载体系统转染293T细胞96 h后可观测到较强的绿色荧光蛋白的表达,收集上清测得病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,并且在80%大鼠软骨细胞中观察到GFP的表达.[结论]成功构建了携带GFP的重组慢病毒载体系统,对大鼠关节软骨细胞转染效果良好,为将来结合RNA干扰技术对软骨细胞进行基因改造提供了基础.     

人胸腺素β4 RNA干扰载体的构建及其对293T细胞目的基因表达的影响

目的探讨人胸腺素β4（thymosin β4,TMSB4）基因RNA干扰慢病毒载体的构建,观察病毒感染293T细胞后TMSB4 mRNA和蛋白表达,为进一步研究TMSB4基因的功能提供基础。方法设计特异性干扰人TMSB4基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNAoligo,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生慢病毒载体。转化感受态大肠杆菌DH5a并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定。慢病毒载体、包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将获得的慢病毒感染293T细胞,分别采用实时定量PCR和免疫细胞化学染色方法观察TMSB4 mRNA和蛋白的表达情况,利用生成的TMSB4 shRNA慢病毒感染原代成纤维细胞。结果感染重组慢病毒的293T细胞与空病毒转染阴性对照细胞的TMSB4 mRNA表达分别为0.56±0.11和1.00±0.06（P=0.0006）,实验组细胞的敲减率为44%。实验组TMSB4蛋白表达水平0.042±0.007比阴性对照组细胞0.093±0.009的表达降低55%（H=461.342,P〈0.001）。感染重组慢病毒的原代培养的成纤维细胞与空病毒转染的对照细胞相比,TMSB4蛋白表达水平亦明显降低。结论TMSB4基因干扰慢病毒构建成功并能显著降低TMSB4基因和蛋白在293T细胞中的表达,成功感染原代成纤维细胞使其目的基因蛋白减少,为进一步研究TMSB4基因的功能奠定研究基础。     

人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

【摘要】 目的 构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-boxA1,FoxA1)的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法〓设计基因引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出FoxA1的cDNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组FoxA1表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞(HFFs),通过实时荧光定量PCR检测FoxA1 mRNA的表达水平。结果〓重组慢病毒表达载体FoxA1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论〓成功构建了人FoxA1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续FoxA1的功能和机理研究奠定了实验基础。     

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染对人骨髓基质细胞体外成骨诱导的影响

目的 研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染人骨髓基质细胞(MSC)，对其体外诱导后表达成骨表型的影响，探讨EGFP作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，并转染骨髓基质细胞，G418进行筛选。将转染后稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓基质细胞(MSC-EGFP)进行成骨诱导扩增，以未转染的MSC为对照组，分别检测成骨诱导后碱性磷酸酶(AKP)活性，骨钙蛋白(OCN)含量和成骨细胞转录因子(Cbfal)的表达。结果 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，转染后获得稳定表达绿色荧光蛋白的MSC-GFP，其体外经成骨诱导后，同样能表达成骨特征性表型，AKP，OCN，Cbfal表达和未转染组无明显差别。结论 MSC转染EGFP后，不影响其体外成骨诱导后成骨表型的表达，EGFP可作为骨组织工程种子细胞(MSC)良好的示踪剂。     

occludin的RNA干扰慢病毒载体的构建及其在紧密连接中的功能研究

目的:体外分析occludin在紧密连接中的作用。方法:构建RNA干扰慢病毒载体,转染TM4细胞后,用RT-PCR和Western blot检测其对occuldin的抑制能力,用体外TJ细胞模型分析occuldin在TJ中功能。结果:测序结果表明pLenti 6.3-EGFP-occludin-miR表达载体已经成功构建;RT-PCR结果显示pLenti 6.3-EGFP-occludin-miR-3能够显著抑制occludin的表达(P0.05);Western印检测分析发现pLenti 6.3-EGFP-occludin-miR-3转染组occuldin的表达值为0.7534±0.089,经ANOVA比较,较空白对照组和pLenti 6.3-EGFP转染组(1.056±0.025)都低,差异显著(P0.05)。体外细胞TJ模型结果表明pLenti 6.3-EGFP-occludin-miR-3转染组中,TM4表达的occludin的表达受到抑制,紧密连接的紧密程度下降。结论:pLenti 6.3-EGFP-occludin-miR表达载体已经成功构建;occludin是维持紧密连接的功能蛋白之一。     

重组腺病毒相关病毒作为肝癌基因治疗载体的初步研究

目的 探讨重组腺病毒相关病毒（rAAV）的制备以及作为肝癌基因治疗载体的可行性。方法 重组报告基因加强的绿色荧光蛋白（EGFP）基因至质粒载体pSub201,用双质粒共转染方法制备重组腺病毒相关病毒颗粒（rAAV/EGFP),观察其对肝癌细胞系的感染性。结果 用常规的双质粒共转染方法制备高产量的rAAV(10^7-10^8感染单位／10cm板）;当病毒感染多重性（MOI）＝100时,rAAV/EGFP对肝癌细胞HepG2的转染效率可达100％。结论 重组腺病毒相关病毒可有效地转导外源基因至肝癌细胞,其作为肝癌的基因治疗载体具有较好的研究前景。     

hVEGF165基因转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建携带hVEGF165基因的重组腺病毒载体pAdxsi-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165,体外转染大鼠BMSCs,观察转染后hVEGF165的表达情况以及对BMSCs生长增殖的影响,为进行血管再生的基因治疗奠定实验基础。方法将hVEGF165从原始质粒切下连接到pShuttle-巨细胞病毒-EGFP重组穿梭载体,并转移至pAdxsi载体上,获得重组腺病毒载体质粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165,进行酶切鉴定及基因测序。采用PacI限制性内切酶线性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165,并转染人胚肾细胞HEK293,收获重组腺病毒,测定病毒滴度。贴壁法培养Wistar大鼠BMSCs,体外转染携带EGFP基因的重组腺病毒(pAdxsi-EGFP),荧光倒置相差显微镜及流式细胞术确定最佳病毒感染复数(multiplicities of infection,MOI)。依据最佳MOI转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165至BMSCs,采用Western blot、RT-PCR及ELISA法检测转染后hVEGF165的表达;MTT法评价转染后BMSCs生长增殖情况。结果酶切鉴定及基因测序提示重组腺病毒载体质粒含有hVEGF165 cDNA;经多轮感染、扩增后,病毒滴度可达1×1010 pfu/mL。荧光倒置相差显微镜观察转染pAdxsi-EGFP后MOI为150 pfu/cell时转染效果最佳,流式细胞仪检测转染效率约88%。Western blot和RT-PCR检测示,pAdxsi-EGFP-hVEGF165转染BMSCs 48 h后在蛋白质和基因水平均可有效表达hVEGF165;ELISA检测示其含量在7 d达高峰,在20 d时仍有表达,1、3、5、7、9、11、13、15、20 d各时间点hVEGF165含量均显著高于EGFP基因转染组及未转染组(P<0.05)。MTT结果显示,各时间点转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165的BMSCs与未转染组细胞的吸光度(A)值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMSCs是一种较理想的基因载体细胞,成功制备的重组腺病毒载体质粒可在MOI值为150时将hVEGF165基因有效转染至BMSCs;转染后hVEGF165表达水平较高、持续时间较长,且对BMSCs的生长增殖无明显影响。