NDRG2基因与肿瘤的演进

N-myc下游调节基因2(N-myc down stream regalated gene 2,NDRG2)是一个新近发现的分化相关新家族的成员之一,且在多种组织中均有表达,如脑、心脏、骨骼肌和肾等.最近的研究显示NDRG2是一种肿瘤抑制基因,并在多种肿瘤中都存在NDRG2基因杂合性缺失,高甲基化以及核心启动子突变.NDRG2在肿瘤转移中起抑制作用,且可能通过抑制TGF-β1的活性、消除胶原酶的诱导活性和特异性下调层黏连蛋白332通路成分来抑制肿瘤的转移.NDRG2与肿瘤关系复杂,可能用于预后判断,成为一个新的治疗靶点.     

NDRG1基因与乳腺癌转移的关系及其转染对乳腺癌细胞株增殖及侵袭力的影响

目的探讨NDRG1基因与乳腺癌转移的关系及其转染对乳腺癌细胞株增殖及侵袭力的影响。方法免疫组织化学SP法、即时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测10例新鲜乳腺浸润性导管癌和27例石蜡包埋乳腺癌组织中NDRG1蛋白和mRNA的表达。脂质体介导NDRG1基因瞬时转染高侵袭高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231;用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入法、流式细胞术观察NDRG1基因转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;细胞体外侵袭实验和迁移实验观察转染后细胞侵袭和迁移能力的变化。结果NDRG1蛋白和mRNA表达分别为:无转移的乳腺癌组织阳性率为100%(14/14)和0·82±0·14,而有转移的乳腺癌组织中为69·2%(9/13)和0·17±0·11,均明显降低;对两株细胞的检测中,高侵袭高转移的MDA-MB-231细胞株中NDRG1mRNA的表达水平(0·14±0·02)明显低于低侵袭低转移的MCF7细胞株(1·51±0·11)。NDRG1基因瞬时转染MDA-MB-231细胞后,与未转染组和pEGFP-N3组相比,pEGFP-NDRG1-N3转染组中,细胞BrdU掺入率降低,细胞周期G0/G1期比例增高,S期比例明显减低;同时细胞体外侵袭能力下降,而体外迁移能力则差异无统计学意义。结论NDRG1基因的表达与乳腺癌的转移呈负相关关系,提示该基因可望成为早期预测乳腺癌转移的分子生物学标记物之一;NDRG1基因通过脂质体转染高侵袭高转移性人乳腺癌MDA-MB-231细胞株,可抑制肿瘤细胞增殖、降低其侵袭能力,提示其可作为一个候选的肿瘤转移抑制基因,并有望成为乳腺癌基因治疗的新的候选基因。     

NDRG2基因反转录病毒载体的构建及表达

背景：NDRG2(N-Myc Downstream Regulated Gene 2)是一个新的抑癌基因,既可以增强经典抑癌通路的抗肿瘤效应,又可以对正常细胞的癌变起到监控。有关NDRG2在骨髓瘤发生中的功能和作用至今还未见报道。 目的：构建NDRG2基因反转录病毒表达载体,利用包装的病毒感染人骨髓瘤细胞系U266,检测NDRG2的表达情况。 方法：设计与合成引物,提取U266细胞的RNA,反转录和PCR扩增,经BamHⅠ和TaqⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳,切胶回收进行连接转化,并再次酶切鉴定;并将构建的载体包装为反转录病毒,感染U266细胞,筛选出稳定表达NDRG2的U266细胞(U266-NDRG2)克隆扩大培养,利用Western blot实验检测筛选到的U266细胞中NDRG2的表达。 结果与结论：成功构建了携带NDRG2基因表达的重组载体pBaba-puro-NDRG2,并包装为反转录病毒,筛选到的U266细胞(U266-NDRG2)中NDRG2蛋白表达明显高于U266-cherry细胞和U266细胞。结果可见利用反转录病毒载体基因重组技术成功构建出携带相应基因的反转录病毒,为研究NDRG2在人骨髓瘤中的作用奠定了实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

MDA-7/IL-24对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长抑制和凋亡的影响

 摘要：目的 探讨IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制和促凋亡作用。方法 利用脂质体将穿梭质粒pDC316-hIL-24-EGFP瞬时转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR检测转染后hIL-24基因mRNA的转录,Western blot检测转染后IL-24和Caspase-3蛋白的表达,MTT比色法测定细胞增殖的抑制, 流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,Hoechst 33258染色检测细胞的凋亡情况。结果IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达。IL-24可上调MDA-MB-231细胞中Caspase-3蛋白表达。IL-24基因的表达使得乳腺癌MDA-MB-231细胞出现增殖抑制。流式细胞仪检测显示MDA-MB-231细胞DNA 合成受到抑制,细胞周期主要抑制在G2/M期。Hoechst 33258染色显示IL-24基因转染后MDA-MB-231细胞出现凋亡。结论IL-24基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后能够抑制细胞增殖并促进其凋亡,其机制之一可能是上调Caspase-3的表达。     

人肿瘤转移抑制基因1转染对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生物学行为的影响

目的研究人肿瘤转移抑制基因1（TMSG-1）转染引起人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生物学行为的改变及对肿瘤转移表型的影响。方法构建TMSG-1全长编码序列真核表达载体,稳定转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞系,G418筛选挑取TMSG-1过表达阳性克隆。通过MTT比色实验、软琼脂集落形成实验检测体外细胞生长能力;Matrige1穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力。TMSG-1瞬时转染24、48h,分别用Annexin-V碘化丙啶（PI）双标流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况。结果从稳定转染TMSG-1的MDA-MB-231细胞中挑取3个TMSG-1-FLAG融合蛋白表达量较高的阳性克隆株用于下游生物学行为实验。M1Tr比色实验及软琼脂集落形成实验结果显示,TMSG-1正义转染各组（S1、S2、S3）细胞增殖速度及克隆形成数与未转染组及转染空载体组相比均明显减低（P〈0．05）;Matrigel穿膜实验显示,正义转染各组的穿膜细胞数[（72．3±8．1）个、（85．0±4．2）个、（73．5±7．8）个]与未转染组[（187．5±2．1）个]和转染空载体组[（162。3±6．8）个]相比均明显减少（P〈0．01）。TMSG．1瞬时转染MDA．MB-231细胞,转染24和48h均可引起细胞凋亡率的增加（P〈0．05）。结论TMSG．1表达上调可使人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生长速度、锚着不依赖性生长能力及侵袭能力明显降低,细胞凋亡增加。该实验为TMSG-1是一个新发现的肿瘤转移抑制基因提供了证据。     

AT2R基因在体转染抑制大鼠颈动脉新生内膜增生

目的: 探讨AngⅡ 2型受体（AT2R）基因在体转染对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的抑制作用。方法:大鼠颈动脉球囊损伤后，局部转染AT2R重组腺病毒载体（pAdCMV/AT2R）或空病毒载体（pAd-GFP），于术后7、14和21 d用RT-PCR、免疫组织化学及HE染色方法，进行AT2R、AngⅡ 1型受体(AT1R)、PCNA在颈动脉壁中表达的变化及定量组织形态学分析；免疫荧光双标染色和激光共聚焦技术检测血管中AT2R与PCNA表达的关系。结果: pAdCMV/AT2R转染后，大鼠颈动脉AT2R的表达水平显著高于未转染组和pAd-GFP组(P<0.01)，21 d时仍维持较强表达。在14 d时pAdCMV/AT2R组PCNA阳性表达率显著低于未转染组和pAd-GFP组［(27.29±5.81)% vs ( 72.25±4.47)%、(68.43±9.12)%，P<0.01］，在AT2R表达阳性的部位PCNA表达阴性。在21 d时，pAdCMV/AT2R组的内膜面积与中膜面积比显著低于未转染组和pAd-GFP组(0.78±0.06 vs 1.44±0.22、1.36±0.21, P<0.01)，pAd-GFP组和未转染组间无显著差异（P>0.05）；各组颈动脉AT1R表达水平无显著差异(P>0.05)。结论: AT2R基因在体转染可抑制球囊损伤后大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖和新生内膜增生，AT2R基因转染后表达并发挥其生物学作用时，AT1R和AT2R之间不存在表达量上此起彼伏的关系，可能是建立在信号转导基础上的功能调节关系。     

以转染CDMP1基因的BMSCs修复软骨缺损

 目的 探讨CDMP1基因转染的骨髓间充质干细胞（BMSCs）负载于聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架上修复喉软骨缺损的能力,并对其修复效果做出初步评估。方法 用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫印迹法(Western blot)检测hCDMP1mRNA和蛋白的表达;用免疫组织化学方法检测Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)以及糖胺聚糖(GAG)的表达;将转染前后的细胞支架培养体系移植入兔甲状软骨全层缺损处,从大体、组织学方面观察其对软骨缺损的修复作用。结果 腺病毒感染方法可以将外源hCDMP1基因成功转入BMSCs,并使其获得稳定表达;和对照组比较,转染hCDMP1基因的BMSCs分泌ColⅡ、GAG等软骨特异性基质的能力增强,有促进软骨分化趋势;转染细胞支架复合物可更加有效地修复喉软骨缺损。结论 转染hCDMP1基因的BMSCs/PLGA三维生物支架复合物移植动物体内可修复喉软骨缺损。     

siRNA干扰人BMP9重组腺病毒载体的构建及其促进乳腺癌SK-BR-3细胞增殖

 目的 筛选特异性干扰人BMP9基因的siRNA序列并制备重组腺病毒AdsiBMP9,探讨RNAi人BMP9基因后对乳腺癌SK-BR-3细胞增殖能力的影响。方法 设计制备3对干扰人BMP9的双链DNA序列,亚克隆至Pses-Hus质粒中获得Pses-Hus-siBMP9质粒,脂质体转染乳腺上皮细胞HBL-100筛选有效干扰质粒,构建重组腺病毒并感染SK-BR-3细胞,RT-PCR,Western blot 检测BMP9表达,MTT检测细胞增殖能力。 结果 成功构建并筛选出针对人BMP9基因的有效干扰质粒并包装成腺病毒,病毒滴度为1×1010IU/mL,感染SK-BR-3细胞显示BMP9在转录水平和翻译水平表达量显著低于对照组和空白组(P<0.05),第5天AdsiBMP9组细胞的增殖率显著高于AdsiNC组（P<0.05）。结论 成功构建特异性沉默人BMP9基因的siRNA腺病毒载体,可有效抑制SK-BR-3细胞中BMP9基因的表达从而促进该细胞增殖。     

NDRG2对成年大鼠室管膜下区神经干细胞增殖的影响

目的:探讨NDRG2(N-myc downstream regulated gene 2)对成年大鼠侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经干细胞增殖的影响。方法:成年雄性Sprague-Dawley大鼠20只,随机分为对照组(n=10)、实验组(n=10)两组。实验组给予侧脑室注射过表达NDRG2的腺病毒,对照组给予侧脑室注射腺病毒空载体。采用Brd U免疫荧光染色法检测细胞增殖情况,Tunel染色检测细胞凋亡情况。结果:Brd U染色结果显示:实验组大鼠侧脑室室管膜下区Brd U阳性细胞显著少于对照组(P0.05);Tunel染色提示:两组大鼠侧脑室室管膜下区凋亡的细胞数未见明显差异(P0.05)。结论:上调NDRG2在成年大鼠脑内的表达,会抑制其侧脑室室管膜下区神经干细胞的增殖,但不影响其细胞的存活。     

癌相关基因NDRG家族的研究进展

研究证实,NDRG家族在肿瘤的生物进程和发病起源方面起到重要作用,在很多肿瘤细胞系和肿瘤类型中,这些基因表达下降或缺失,说明它可能起到抑癌基因的作用,从这个角度出发,对其现有的研究进行归纳,包括分子构成,细胞和组织分布,生物学功能和在肿瘤方面的作用,试图阐述它们在研究疾病及其治疗方面的潜在意义。     

NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用

目的：探讨NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用。方法：用RT-PCR获取NDRG2基因。测序判断正确后，将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2-EGFP中，并转染NDRG2表达阴性的HepG2细胞。用光镜观察转染细胞的形态变化；荧光显微镜观察NDRG2蛋白的定位；流式细胞仪分析细胞周期的改变；透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变。结果：获得了NDRG2基因，成功地构建了pIRES2-EGFP-NDRG2真核表达载体。转染HepG2细胞后，细胞生长受抑，结构破坏并死亡。荧光显微镜观察到NDRG2在胞质中表达，流式细胞仪检测出现G1期阻滞和凋亡峰，透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征。结论：NDRG2基因具有诱导HepG2细胞凋亡的作用，其机制有待进一步研究。     

IL—2基因转染逆转绒癌耐药细胞系多药耐药性

用RT－PCR的方法克隆人的IL－2基因,将IL－2基因插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,通过阳离子脂质体将IL－2基因转染用足叶乙甙（VP－16）诱导建立的绒癌耐药细胞系JEG－3／VP16,用G418筛选含IL－2 DNA片段的单个细胞克隆,检测转染前后细胞对5－氟尿嘧啶（5－Fu),氨甲喋呤（MTX）,VP－16,更生霉素（KSM）,紫杉醇（TAXOL）耐药指数的变化,用RT－PCR的方法测定转染前后细胞IL－2和多种耐药基因包括肺耐药蛋白（LRP）,多药耐药相关蛋白（MRP）,谷胱甘肽转移酶（GST－π）,二氢叶酸还原酶（DHFR）和多药耐药基因（MDR－1）的mRNA表达情况。结果表明 转染IL－2的细胞中用RT－PCR的方法检测到IL－2 mRNA表达,转染IL－2基因的细胞耐药指数降低,MDR－1 mRNA表达转阴,而其它耐药基因的表达无明显改变。     

转染胃动蛋白2基因抑制人胃癌细胞系MKN28增殖、迁移和侵袭

目的检测胃癌、癌旁组织和胃癌远端胃黏膜组织中胃动蛋白2(GKN2)的表达;分析GKN2转染人胃癌MKN28细胞系后对增殖、迁移和侵袭的影响。方法免疫组织化学技术检测胃癌、癌旁组织和胃癌远端胃黏膜中GKN2蛋白的表达;将GKN2基因真核表达载体(Xhol_GKN3SP-h GKN2-TEV-SBP_Xhol)转入人胃癌MKN28细胞,经G418筛选后获得稳转细胞株,Western blot确定GKN2在MKN28细胞中表达;MTT法测定MKN28细胞增殖;Transwell迁移实验和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭。结果 GKN2在胃癌组织中的表达少于胃癌远端胃黏膜和癌旁胃组织(P<0.05)。GKN2转染人胃癌MKN28细胞后吸光度值(A值)显著低于未转染组和空载体组(P<0.05)。与未转染组及空载体组相比,GKN2过表达致使迁移细胞数(P<0.05)和侵袭细胞数均明显下调(P<0.05)。结论 GKN2表达减低与胃癌的发生有关;GKN2过表达显然可阻抑人胃癌MKN28细胞的增殖、迁移和侵袭。     

基因转染法建立小鼠胸腺基质细胞系

利用基因转染方法使细胞获得不死性，快速建立小鼠胸腺基质细胞（ＭＴＳＣ）系。用含有多瘤病毒ｍＴ基因的重组质粒Ｚｉｐ－ｍＴ以脂质体介导法转染初代培养的ＭＴＳＣ，经过８００μｇ／ｍｌ的Ｇ４１８筛选，得到５个ＭＴＳＣ克隆。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明所得细胞克隆的染色体中整合有ｍＴ基因，说明ｍＴ基因的整合是导致细胞转化的原因。基因转染建系比常规建系所需时间大大缩短，仅需２个月。     

基因转染技术的发展与现状

基因转染技术是基因研究中的重要实验手段。探讨了基因转染的兴起和发展,介绍了6种基因转染方法,其中重点对两种新方法——颗粒轰击技术和光诱导的光化学内在基因转染方法进行了介绍,并对各种方法的优势和不足进行了比较,以便研究人员在研究中更好地选择实验方法。介绍了基因转染技术在基因研究中的应用。     

超声－微气泡介导的基因转染研究进展

能否成功高效地转染靶基因对于基因治疗的效果具有决定性的影响。微气泡是具有稳定的封装壳,直径为微米量级的小气泡,已作为超声造影剂被广泛应用。微气泡在超声脉冲的作用下可以在靶区释放其携带的基因并使之转染,同时超声脉冲产生的热效应和空化效应能提高转染率。若将微气泡与磁性纳米颗粒结合,还可以进一步提高转染率和转染精度,是一种理想、安全的基因载体。本文综述了由超声－微气泡介导的基因转染在近5年的主要研究成果。对影响转染率的主要因素如微气泡种类、超声辐照条件、基因及受体类型等方面做了详细的论述,并对微气泡介导基因转染过程中的安全性、长效性和差异性等问题进行了讨论。     

VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨利用干扰RNA（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计针对VEGF基因的小干扰RNA（siRNA）,合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGF mRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果：所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论：体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

siRNA下调RRM2抑制人乳腺癌细胞增殖与迁移及其裸鼠皮下移植瘤的生长

目的: 探讨siRNA下调核糖核苷酸还原酶M2(ribonucleotide reductase M2,RRM2) 基因对人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖、迁移和体内成瘤的影响。方法: 实时定量荧光PCR (real-time PCR) 及Western blotting技术检测人乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A中RRM2 mRNA及蛋白的表达;用合成的siRNA-RRM2不同时点和不同剂量转染MCF-7细胞,用real-time PCR检测对RRM2基因的沉默效率;用CCK-8方法检测细胞增殖;用Transwell细胞迁移系统检测siRNA-RRM2对MCF-7细胞迁移能力的影响;裸鼠移植瘤实验检测siRNA-RRM2沉默MCF-7细胞的RRM2基因后对肿瘤生长的影响。结果: MCF-7细胞RRM2 mRNA和蛋白比MCF-10A细胞高表达;用siRNA-RRM2转染MCF-7乳腺癌细胞能时间及剂量依赖性下调RRM2基因表达;CCK-8方法结果显示下调RRM2基因会时间及剂量依赖性抑制MCF-7细胞增殖,而人正常乳腺上皮细胞增殖没有显著变化;Transwell细胞迁移系统检测显示下调RRM2基因显著抑制了MCF-7细胞的迁移能力;转染siRNA-RRM2下调RRM2基因能显著抑制裸鼠移植瘤的生长。结论: RRM2的过表达与人乳腺癌细胞的高增殖和迁移能力有关,抑制RRM2的功能是治疗乳腺癌的一个潜在的治疗策略。     

人死亡受体5全长基因的构建及转染胶质瘤细胞

目的构建人死亡受体5(death receptor5,DR5)全长基因真核细胞表达载体pcDNA3.1/DR5,pcDNA3.1/GFP/DR5,并观察其转染胶质瘤细胞U138的效果。方法通过重叠PCR获得DR5全长编码序列,构建pcDNA3.1/GFP/DR5,pcDNA3.1/DR5表达载体,利用脂质体转染试剂盒,分别将2种质粒pcDNA3.1/GFP/DR5、pcDNA3.1/GFP共转染胶质瘤细胞U138,转染后72h,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DR5mRNA的表达,流式细胞术检测DR5的表达强度、检测Anti-DR5对胶质瘤细胞U138生长的影响。结果获得了DR5全长编码序列,成功瞬时转染U138,RT-PCR、流式细胞术检测结果表明,转染后U138细胞DR5mRNA、蛋白水平的表达明显增加,Anti-DR5可以明显抑制U138细胞的生长。结论获得了DR5全长编码序列,探索到成功转染DR5的最佳方法,为稳定筛选高表达DR5的U138细胞提供依据。     

基因枪介导不同真核质粒DNA转染体外细胞系的实验研究

目的:建立基因枪子的弹制备及将不同质粒DNA转染体外培养MCF-7细胞系的方法。方法:以亚精氨-氯化钙沉淀法制备子弹,采用基因枪方法分别将真核表达质粒pEG-FP,Pmcherry转染对照组和实验组MCF-7细胞,转染24h后,利用荧光显微镜观察细胞中红、绿荧光蛋白的表达情况。结果:制备了基因枪子弹,基因枪介导的pEGFP、Pmcherry能够分别和共同转染入体外培养的MCF-7细胞中,转染后24h可检测到红、绿色荧光,而对照组则没有荧光蛋白的表达。结论:基因枪能够有效介导外源基因转移并能够实现两种基因的共同转移,基因枪转染的MCF-7细胞能够有效表达报告基因。