H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A／Duck／Shantou／2088／01（H9N2）亚型禽流感病毒ns1基因，构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA，将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中，构建重组质粒pGEX-4T-3／ns1，转化BL21（DE3）宿主菌；采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1，基因；并用IPTG诱导工程菌，SDS—PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明，ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中，测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS—PAGE电泳显示，融合蛋白在BL21（DE3）工程菌中以可溶形式表达，重组融合蛋白GST—NS1的表达量占菌体总蛋白的20％左右。经Western blotting分析证实，重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因，构建了融合表达载体，并进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白表达影响因素分析

目的优化高表达禽流感病毒NS1蛋白的实验方法。方法将基因工程菌接种LB培养基,设定IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导温度为37℃,诱导表达6.0h,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,确定最佳诱导时间。以0.1mmol/L为梯度,设置不同IPTG诱导浓度,37℃诱导4.0h,分析融合蛋白表达,确定最佳IPTG诱导浓度。设定IPTG至终浓度为0.6mmol/L,分别于24℃、28℃、32℃、37℃和42℃下诱导表达4.0h,分析融合蛋白表达,确定最适诱导温度。采用最优表达条件,超声裂菌后SDS-PAGE分析融合蛋白,Western blotting对融合蛋白进行鉴定。结果当培养温度为37℃,IPTG浓度为0.3mmol/L时,融合蛋白GST-NS1在IPTG诱导5.0h时的表达量最高,达28.5%;当IPTG诱导浓度为0.6mmol/L,在37℃诱导表达4.0h时,融合蛋白的表达量可达27.9%。选用优化的表达条件,IPTG 0.6mmol/L,37℃诱导表达4.0h,融合蛋白的表达量最高可达33.2%。进一步分析显示,融合蛋白大部分以可溶形式表达,其表达量可占菌体总蛋白的25.1%。经SDS-PAGE电泳、电转移后,用小鼠抗GST单克隆抗体进行免疫印迹分析,出现一条阳性反应带。结论通过实验优化了工程菌诱导表达的最佳IPTG浓度、最适时间和培养温度,实现了融合蛋白的可溶性高表达。     

H5N1亚型禽流感病毒NSl蛋白表达影响因素分析

目的 优化高表达禽流感病毒NS1蛋白的实验方法。方法将基因工程菌接种LB培养基,设定IPTG终浓度为0.3mmol／L,诱导温度为37℃,诱导表达6．0h,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况,确定最佳诱导时间。以o．1mm01／L为梯度,设置不同IPTG诱导浓度,37℃诱导4.0h,分析融合蛋白表达,确定最佳IPTG诱导浓度。设定IPTG至终浓度为0。6mmo1／L,分别于24℃、28℃、32℃、37℃和42℃下诱导表达4．0h,分析融合蛋白表达,确定最适诱导温度。采用最优表达条件,超声裂菌后SDS-PAGE分析融合蛋白,Westernblotting对融合蛋白进行鉴定。结果当培养温度为37℃,IPTG浓度为0。3mmol／L时,融合蛋白GST-NSl在IPTG诱导5．0h时的表达量最高,达28．5％;当IPTG诱导浓度为0。6ram01／L,在37℃诱导表达4。0h时,融合蛋白的表达量可达27．9％。选用优化的表达条件,IPTG0．6mmo1／L,37℃诱导表达4．0h,融合蛋白的表达量最高可达33．2％。进一步分析显示,融合蛋白大部分以可溶形式表达,其表达量可占菌体总蛋白的25．1％。经SDS-PAGE电泳、电转移后,用小鼠抗GST单克隆抗体进行免疫印迹分析,出现一条阳性反应带。结论通过实验优化了工程菌诱导表达的最佳IPTG浓度、最适时间和培养温度,实现了融合蛋白的可溶性高表达。     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒对小鼠致病性的研究

目的用一株鹅源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠,观察其对小鼠的致病性及在小鼠间的传染性。方法将小鼠分为正常组、攻毒组、同居组,攻毒组乙醚麻醉后滴鼻感染AIV,观察各组食欲、反应、呼吸及有无皱毛、弓背、死亡等,测量体温及体重;检测相应抗体水平、小鼠排毒情况及小鼠各器官带毒情况,并观察病理组织学变化。结果攻毒组出现食欲反应下降,呼吸急促,皱毛,死亡;体重、体温下降。同居组未出现感染。攻毒组攻毒后12 h至第9天可从肺组织分离出病毒,第10天始出现相应抗体;感染小鼠的肺、心肌、肝、脾、肾和脑组织都有不同程度的病理改变。结论 AIV对小鼠具有致病性,AIV能跨越种系障碍直接感染哺乳动物, 但在小鼠间无传染性。     

金刚烷胺和奥司他韦体外抗H5N1亚型禽流感病毒的作用

【目的】 观察体外单用金刚烷胺?奥司他韦及两药联合使用对两株H5N1亚型的禽流感病毒分离株(AIV127?AIV174)的抑制作用,了解广东地区分离的不同H5N1毒株之间药物敏感性的差异,为临床合理应用抗病毒药物提供科学依据?【方法】 建立体外H5N1感染模型,根据药物与病毒?细胞的不同作用,通过3种给药方式,使用细胞病变(CPE)?组织培养半数感染量(TCID50)评估抗病毒药物对H5N1的体外抑制作用? 【结果】 三种给药方式金刚烷胺联合奥司他韦,均比单用金刚烷胺体外抑制AIV127及AIV174效果明显(P < 0.01);而仅在治疗给药方式,两者联合比单用奥司他韦效果明显(P < 0.01)?三种给药方式金刚烷胺?奥司他韦及联合用药对同一亚型H5N1 AIV127比AIV174毒株均较敏感(P < 0.01)? 【结论】 抗病毒药物对不同的禽流感病毒毒株之间敏感性存在差异,应根据不同毒株给予相应的抗病毒治疗     

人甲型禽流感病毒（H5N1亚型）感染研究最新进展

甲型禽流感病毒（H5N1亚型）（以下简称H5N1）感染是鸟类流行病，可引起人类致病，其死亡率高，可引起大流行。该文对世界卫生组织2005年版的禽流感报告进行了更新，并介绍了第二届世界卫生组织咨询会议上关于人甲型禽流感病毒（H5N1亚型）感染的临床表现方面的内容。     

H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测方法的初步建立

目的研制H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测试剂盒。方法将所获病毒通过鸡胚扩增，离心，纯化，通过测定最佳抗原工作浓度、最佳酶工作浓度、最佳血清工作浓度来确定ELISA检测方法。结果确定最佳抗原包被浓度为1：20000、酶工作浓度为1：10000、阳性血清最佳工作浓度1：1000。结论初步研制成功了H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测试剂盒。     

中国大陆H5N1亚型人禽流感流行病学分析

人高致病性禽流行性感冒,简称人禽流感(hu-man avian influenza),是由禽甲型流感病毒中某些亚型毒株突破种属感染人而引起的一种急性呼吸道传染病.目前常见的亚型有H5N1、H7N7和H9N2,其中以H5N1毒性最强.自1997年中国香港首次发现人感染高致病性禽流感病毒H5N1病例以来,目前已有15个国家和地区发生了人禽流感病例.本文在对全球人禽流感流行状况调研的基础上,重点对国内2003～2009年1月中国大陆人禽流感流行状况进行分析.     

禽流感H5N1亚型病毒对五个不同品系小鼠致病性的比较

目的 比较了不同遗传背景小鼠对禽流感H5N1亚型病毒的致病敏感性,为H5N1禽流感模型制作和机理研究提供依据.方法 近交系BALB/c、C57BL/6和封闭群ICR、NIH Swiss和KM Swiss共五个不同品系小鼠.每个品系实验动物30只,分接毒组20只,空白对照组10只,每组雌雄各半.病毒株为A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1),经测定TCID50为10-4.875/mL.接毒组通过鼻腔接种0.1 mL病毒液,对照组接种正常鸡胚尿囊液.小鼠接毒后连续观察14 d,观察记录临床症状、体温、体重变化,对在实验期间死亡和实验14 d结束后仍然存活的小鼠均进行组织器官病理取材,进行RT-PCR病毒分离检测、HE染色及H5N1抗原特异性免疫组化染色.结果 ①临床症状:H5N1禽流感病毒能感染五个品系的小鼠,引起呼吸急促等症状和一过性体重、体温下降.②死亡情况:小鼠在接毒后第1天即出现死亡,死亡的高峰期集中在接毒后第3～6天.五个品系小鼠死亡率存在差异,BALB/c为70%,ICR为50%,NIH Swiss为40%,C57BL/6为25%,KM Swiss为10%;③病毒分离:各组接毒小鼠在死亡后均进行了病毒分离,死亡小鼠的肺脏均分离到病毒,其他脏器未分离到病毒.④病理变化:实验期间五个品系死亡小鼠肺脏病理改变相近.大体观:死亡小鼠肺部淤血,呈暗红色,体积增大,局部肺组织实变.镜下观:死亡小鼠的共同病理改变为间质性肺炎,具体表现为肺泡腔及间质出血、炎性细胞浸润;间质增生,肺泡隔增宽;肺泡腔中见纤维素性渗出,透明膜形成.⑤免疫组化结果:在死亡小鼠的气管上皮细胞和肺巨噬细胞可观察到H5N1禽流感病毒阳性表达.结论 小鼠作为H5N1禽流感病毒模型具有普适性,不同品系小鼠感染鹅源H5N1禽流感病毒的临床症状、病程和病理变化与人禽流感病例相似.不同品系小鼠的死亡比例有明显差别,可以根据不同的实验目的,选择不同品系的小鼠制作H5N1禽流感动物模型.不同品系的遗传特性对禽流感易感性产生明显的影响,遗传背景可能与H5N1禽流感病毒感染应答机理存在联系:BALB/c和C57BL/6均为近交系,其中BALB/c小鼠的品系特征之一表现为干扰素产量低,接种H5N1病毒后表现为高死亡率(70%),而C57BL/6小鼠的干扰素产量高,接种H5N1病毒后表现为低死亡率(25%),提示不同遗传背景小鼠的干扰素水平与H5N1感染致死具相关性.为进一步研究H5N1禽流感病毒易感性相关基因以及其与宿主免疫反应的关系提供了一个研究基础.     

H5N1人禽流感病毒HA基因的克隆和表达

目的对人禽流感病毒A/China/GD01/06（H5N1）HA基因进行克隆和表达,为进一步研究GD01/06HA的致病与免疫机制提供有效制剂。方法将H5N1全长HA基因克隆入原核表达载体pET-32a（＋）,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并对表达的重组蛋白进行鉴定。结果经检验重组质粒p32-HA构建成功,表达蛋白分子量介于66.2~94.0kd。经鉴定所表达的特异性条带为HA蛋白片段。结论HA基因在大肠杆菌中表达并获得特异性重组蛋白,为其生物学、免疫学功能的研究提供了基础。     

广州市一起水禽H5N1疫情禽流感病毒血凝素基因分析

目的了解广州市一起水禽H5N1疫情中高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(HA)基因的特点以及与其他毒株序列间的关系。方法自疫点采集97份咽拭子标本及84份环境拭子标本,实时荧光RT-PCR检测H5核酸,从阳性标本中扩增全长HA基因并作序列测定,同2006年广州市及国内其他地区报道的人禽流感病毒HA基因进行比较并作系统发生分析。结果从一份环境拭子中扩增获得一株H5N1禽流感病毒HA基因,系统发生树分析发现与广州市2006年人禽流感病毒HA序列一致性较高,且与国内其他地区报道的H5N1病毒HA基因属于同一组;从基因序列推导出HA的氨基酸序列,发现其受体特异性为禽源的,蛋白酶水解位点含有多个连续的碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒的特征。结论引发此次禽间禽流感的为高致病性H5N1病毒,和广州市人禽流感的H5N1病毒在遗传上有紧密的亲缘关系。禽源性的H5N1病毒仍存在感染人类的可能性,禽类从业人员目前处于感染高致病性禽流感的高危状态,进一步加强对活禽市场和禽类从业人员的监测,对于预防禽流感的流行具有重要意义。     

国内H5N1禽流感文献计量分析

以中国学术期刊网络出版总库和万方医学网为统计源,对国内H5N1禽流感期刊文献从年度发文量、期刊分布、核心作者、单位分布、地区分布几方面进行统计分析,以了解我国H5N1禽流感文献分布特点和研究现状,为相关学者进行研究提供参考信息。     

H5N1型禽流感病毒感染非人灵长类动物的观察

目的观察H5N1型禽流感病毒对中国非人灵长类动物的易感性并建立动物模型。方法将病毒通过滴鼻接种实验猴,观察感染后动物的临床症状,采血、咽拭子及各器官组织进行血清学、病原学及病理学检查,记录抗体变化、病毒分离情况及病理学改变。结果感染后动物表现轻度食欲下降、一过性体温升高及外周血白细胞减少,肺组织病毒分离及RT-PCR阳性,病理检查感染急性期动物肺组织表现为间质性肺炎,肺泡间隔增宽,充血出血明显,肺泡受压变形,间质及肺泡内有大量炎细胞浸润,符合病毒性肺炎的改变,感染后14 d动物血清IgG抗体水平较感染前升高4倍。结论H5N1病毒可感染非人灵长类动物,可以作为感染模型进行H5N1病毒的发病机制、疫苗评价、药物筛选等研究。     

禽流感H5N1型病毒对沙鼠致病性的初步研究

目的 观察禽流感H5N1型病毒对沙鼠的致病性。方法 在生物安全三级实验室，将禽流感H5N1型病毒通过滴鼻接种乙醚麻醉后沙鼠，观察14d，记录沙鼠的体温、体重、临床体征、病理学变化、病毒分离情况及抗体变化。结果 沙鼠感染后发病主要表现在第2～6天，攻毒组沙鼠出现反应迟钝、皱毛、弓背、食欲下降、呼吸急促、打堆等体征，攻毒组沙鼠的体温降低和体重减轻，死亡率为44％，在攻毒后8d检出抗体，主要病理学变化表现为肺出现严重淤血、水肿、出血，镜下可见肺间质充血，血管周围炎性细胞浸润，肝和胸腺淤血，肾出血，肾小管变形。结论 禽流感H5N1型病毒对沙鼠有较强致病性。     

甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化分析

【目的】 了解季节性H1N1流感病毒与2009年新型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化关系,探讨甲型H1N1流感病毒的遗传变异规律&#65377;【方法】 分别从2006年和2009年流感病人标本中分离并鉴定出季节性HIN1流感病毒和新型H1N1流感病毒,用RT-PCR技术扩增了病毒NA基因全序列,并对其分子进化和重要功能位点的遗传变异进行了分析&#65377; 【结果】 2009年新型H1N1流感病毒与2006年季节性HIN1流感病毒比较,NA基因的同源性较低(77.9% ~ 78.8 %),与世界各地不同年代代表株及WHO推荐的1979 ~ 2010年季节性流感疫苗株比较,NA基因的同源性也较低(78.1% ~ 79.3%),但与WHO推荐的2009年新型H1N1流感疫苗株比较同源性则高达99%以上;系统进化分析结果表明,2009年新型H1N1流感病毒NA基因与欧亚猪流感病毒株A/swine/Belgium/1/1983的亲缘关系最近;并发现自2005年以来季节性H1N1流感病毒NA基因的某些抗原位点和神经氨酸酶活性位点已发生了变异&#65377;【结论】 2009年新型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒;接种季节性流感疫苗不能对本次流行的新型流感产生有效的免疫保护作用;季节性H1N1流感病毒在流行过程中NA基因已发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测病毒的变异情况&#65377;     

燕窝提取物抗H5N1禽流感病毒的作用及机理研究

【目的】观察燕窝提取物体外抑制H5N1禽流感病毒的作用。【方法】制备燕窝水提物、燕窝水提物人工胃液消化物、燕窝水提物人工肠液消化物。通过体外293T细胞转染方法,应用荧光素酶检测试剂盒检测3种燕窝提取物对H5N1禽流感假病毒、VSV-G假病毒活性的影响;观察禽流感病毒H5、H7、H9 3种亚型抗原凝血反应及3种燕窝提取物对其抑制作用;应用神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒检测3种燕窝提取物对N1型神经氨酸酶(NA)活性的影响。【结果】3种燕窝提取物对H5N1禽流感假病毒活性均有抑制作用,抑制作用的强度随燕窝提取物浓度增高而增加,其中人工肠液消化物作用最强,水提取物最弱,但对VSV-G假病毒活性均无显著抑制作用。H5、H7型抗原凝血价为1∶128,H9型抗原凝血价为1∶256,3种燕窝提取物在一定浓度条件下对H5、H7、H9抗原血凝反应均有抑制作用,但对NA均没有抑制作用。【结论】燕窝提取物抗病毒的作用可能是通过抑制血凝素的活性而实现的。     

禽流感H5N1病毒感染ICR小鼠的病理变化

 【目的】 通过鼻腔将H5N1禽流感病毒接种ICR小鼠,观察其主要器官组织的病理变化?【方法】 麻醉ICR小鼠后将100 μL H5N1禽流感病毒原液用移液枪滴入接毒组小鼠鼻腔,接毒后14 d内每隔24 h取材一次,采用福尔马林固定,石蜡包埋?切片,HE染色?【结果】 禽流感H5N1病毒感染ICR小鼠后表现出明显的病理改变?ICR小鼠的肺部病变最严重,表现为间质性肺炎,肺间质充血?水肿和淋巴细胞浸润,血管周围淋巴细胞浸润,毛细血管扩张,上皮细胞变性?坏死?脱落,并有充血和单核细胞浸润,肺泡壁明显增宽,血管充血,有的肺泡溶合,呈气肿状?肝?肾?脑等其它脏器也出现病变?【结论】 禽流感ICR小鼠模型能复制出人类禽流感疾病的许多病理特征,禽流感H5N1病毒感染ICR小鼠的肺病理类似于人禽流感严重病例的肺病理?