重组外源性人热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定

背景：热休克蛋白70的肿瘤免疫作用近年来受到国内外学者的广泛关注,然而目前常用的诱导内源性热休克蛋白70表达的方法,如热应激、缺血预处理等均存在一些弊端。 目的：拟构建携带并正确表达外源性人热休克蛋白70基因的重组真核表达载体。 方法：外源性热休克蛋白70基因连接入真核表达载体pDC315-EGFP中,转化大肠杆菌感受态细胞,重组真核表达载体外源基因测序及PCR检测鉴定阳性克隆后转染人胚肾293细胞,荧光显微镜及western blot鉴定外源基因在细胞中的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实外源性人热休克蛋白70基因正确重组入真核表达载体pDC315-EGFP,转染293细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,Western blot检测到热休克蛋白70在293细胞中有效表达。     

人14-3-3β蛋白的原核表达、抗血清制备及真核表达载体的构建

目的 纯化原核表达的14-3-3β(YWHAB)重组蛋白并制备多抗血清,构建适用于哺乳动物细胞的真核表达载体.方法 将重组蛋白表达载体pET30a(+)/YWHAB转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,镍-四齿螯合剂(Ni-NTA)亲和层析柱纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用ELISA和Western blot方法分别检测抗血清的效价和特异性;应用PCR扩增添加BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点把YWHAB的ORF亚克隆至真核表达载体pEGFP-N1,添加BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点把YWHAB的开放阅读框(ORF)亚克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+),对重组载体进行酶切和PCR鉴定.结果 YwHAB重组蛋白以可溶性形式表达,分子量为32 000,与预期分子量一致;纯化后的重组蛋白纯度达90%以上,ELISA结果显示其抗血清的效价为1:50 000,Western blot结果表明抗血清的特异性较好;酶切和PCR鉴定结果表明真核表达载体pEGFP-N1/YWHAB和pCDNA3.1(+)YWHAB构建成功.结论 通过亲和层析纯化获得人14-3-3β重组蛋白,进而免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,为进一步研究人14-3-3β的功能成功构建了其真核表达载体.     

人NR2B基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人NR2B基因,构建其真核表达载体,获得暂态表达NR2B的CHO细胞.方法 RT-PCR方法克隆人NR2B基因,并插入真核表达载体pcDNA3.1中,将该重组载体转染至CHO细胞.通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光鉴定细胞中NR2B的表达,通过流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 成功获得人NR2B基因,转染的CHO细胞可检测到NR2B的表达,表达NR2B的CHO细胞并不会凋亡.结论 成功克隆和构建了人NR2B基因的真核表达载体,并在CHO细胞中得到了表达.     

pEGFPN1-GDNF真核表达载体的构建及其表达

目的 构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达.方法 应用RT-PCR从U251细胞总RNA中扩增GDNF cDNA,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1,经酶切鉴定及序列分析后,以Fugene HD介导转染COS-7细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定其在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650bp和4.7kb的片段,测序分析结果与文献报道结果完全一致.将其转染COS-7细胞后,免疫细胞化学、Western blot结果表明GDNF蛋白能在COS-7细胞中正确表达.结论 成功构建了pEGFPN1-GDNF真核表达载体,为进一步开展帕金森病的基因治疗研究奠定了基础.     

携带绿色荧光蛋白基因的APP695真核细胞表达载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠淀粉样前体蛋白(APP)695基因真核细胞荧光表达载体,进行细胞转染、表达,为阿尔茨海默病(AD)治疗药物的研究提供一种有效的细胞模型.方法 设计并合成APP695基因的引物,以携带APP695基因的真核细胞表达载体pCB6质粒为模板,PCR扩增得到APP695基因全序列:将APP695基因连接到携带绿色荧光蛋白基因的载体pIRES2-EGFP上;应用酶切分析、PCR检测及DNA测序分析等鉴定所构建的真核细胞表达载体.结果 以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知APP695基因大小相同,酶切也得到目的 基因片段,测序结果显示与已知APP695基因序列相同.结论 成功构建了携带绿色荧光蛋白基因的APP695基因真核细胞表达载体,为AD治疗药物的研究提供了一种有效的分子工具.     

Notch1 expression is upregulated in glioma and is associated with tumor progression

Notch signaling plays a complex role in human malignancies. It can affect cell proliferation, differentiation and apoptosis either positively or negatively, depending on cell type. In the present study we measured the expression of Notch1 in clinical glioma specimens and investigated a possible association between Notch1 expression and World Health Organization grade. Ninety-eight gliomas plus adjacent normal tissue and 26 specimens of normal control tissue were collected, and expression of Notch1 mRNA and protein were assessed using quantitative real-time polymerase chain reaction, western blot and immunohistochemical analysis. We found that Notch1 mRNA and protein were expressed at higher levels in gliomas than in the adjacent tissue or in control brain tissue (p < 0.05). Moreover, expression of Notch1 was closely associated with glioma progression, since expression levels increased from grade I to grade IV disease (p < 0.05). Notch1 expression was also significantly associated with Karnofsky performance scale (KPS) score: Notch1 expression was significantly higher in patients with a lower KPS score (p < 0.05). These findings confirm that Notch1 expression is upregulated in glioma and suggest it is related to tumor progression. If Notch1 plays an important oncogenic role in glioma progression, it may be a potential diagnostic and therapeutic target.     

增强型绿色荧光蛋白-神经标识真核表达载体构建及在细胞内的表达

目的 构建可转染神经胶质细胞和神经元的增强型绿色荧光蛋白-神经标识(EGFP-ID)真核表达载体,为神经突起损伤活体研究提供技术方法. 方法 采用PCR方法分别从质粒pEGFP-N1载体和大鼠脑组织基因组DNA中扩增EGFP和ID序列.通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物EGFP与经过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的pcDNA4.1-hisB载体连接.将经克隆测序确定的pcDNA4.1-EGFP经由NotⅠ和Xba Ⅰ双酶切并与纯化的PCR产物ID连接,再次克隆测序确定为pcDNA4.1-EGFP-ID.将pcDNA4.1-EGFP与pcDNA4.1-EGFP-ID在转染试剂Fugene6 介导下转染人神经胶质瘤U87细胞和小鼠原代培养神经元,通过倒置荧光显微镜观察EGFP在2种细胞内的分布.此外,用50 μmol/L核苷类似物司他夫定处理神经元8d,第8天末观察EGFP-ID 示踪细胞突起发育情况,并与免疫荧光检测结果作比较. 结果 成功扩增得到EGFP和ID基因片段,重组得到EGFP-ID真核表达载体,该载体携带的EGFP基因在U87细胞和神经元内表达并布满细胞突起,示踪神经元突起形态变化的结果与免疫荧光观察结果一致. 结论 pcDNA4.1-EGFP-ID能够介导EGFP基因在神经元和胶质细胞突起内表达,从而直观再现神经突起形态特征.     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建☆

背景：脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。 目的：拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。 方法：采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10 g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoR Ⅰ、xho Ⅰ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。 结果与结论：RT-PCR产物为749 bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生 749 bp和5 446 bp的片段,DNA测序证实749 bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

人类GAD67基因扩增及pEGFP-C2-GAD67真核表达载体的构建

目的扩增人类谷氨酸脱羧酶（GAD）67基因，并构建pEGFP-C2-GAD67真核表达载体。方法应用基因重组技术，采用反转录PCR方法对来自人类脑组织cDNA中编码GAD67的基因片段进行扩增，插入PUC57克隆载体，经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切出GAD67基因片段，再克隆入真核表达载体pEGFP-C2后构建pEGFP-C2-GAD67重组载体，经PCR扩增、酶切后测序鉴定。结果人类GAD67基因扩增产物大小为1785bp，编码594个氨基酸残基。重组真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，PCR正确扩增出目的条带。与GenBank中人类GAD67基因序列比较，核苷酸和氨基酸水平的同源性分别达99．78％和99．66％。结论人类GAD67基因克隆后，可成功构建真核表达载体pEGFP-C2-GAD67为进一步该基因转染神经干细胞移植治疗癫痫提供了实验基础。     

心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建*☆

背景：有研究表明心脏转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)与先天性心脏病的发生有密切的关系,但其机制不明,而目前尚未查及GATA4真核表达质粒构建类的报道。 目的：构建人类心脏特殊转录因子GATA4的真核表达质粒。 方法：对重组质粒pUC57-GATA4进行酶切获得GATA4基因编码区序列,将真核表达载体pCMV-Myc和GATA4基因在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-Myc-GATA4,转化至大肠杆菌,提取质粒后经聚合酶链反应、双酶切及测序鉴定。 结果与结论：实验成功酶切重组质粒获得GATA4基因编码区约1.3 kb的目的片段,聚合酶链反应和酶切鉴定以及基因测序结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的GATA4基因序列,证实成功构建了含有GATA4基因的真核表达重组质粒。     

人血管生成素1真核表达载体的构建及测序★

背景：血管生成素1具有抑制内皮细胞凋亡，促进血管出芽、迁徙、 趋化，维持血管稳定，防止液体渗漏和减轻局部炎症等作用。应用载体携带血管生成素 1基因表达血管生成素 1治疗各种损伤正被广泛研究。 目的：构建人血管生成素1（human angiopoietin 1,hAng-1）真核表达载体pcDNA3.1+-hAng1。 设计、时间及地点：单一样本观察。实验于2007-10/2008-03在唐都医院中心实验室完成。 材料：人血管生成素1基因为中国医科大学马腾博士赠送；pcDNA3.1+为Invitrogen公司产品；JM109感受态细胞为TAKARA公司产品。 方法：血管生成素1基因片段经巢式聚合酶链反应方法扩增，血管生成素1基因片段及载体pcDNA3.1+分别经HindⅢ和XhoⅠ双酶切，之后经T4连接酶连接，构成pcDNA3.1+-hAng1。 主要观察指标：①酶切鉴定。②合成载体测序鉴定。 结果：所构建的pcDNA3.1+-hAng1载体经HindⅢ和XhoⅠ酶切，TBE胶电泳可得1.5 kb的hAng1片段及5.4 kb的pcDNA3.1+片段。合成载体送北京奥科测序，结果正确，与GenBank中AY121504一致。 结论：利用基因重组和双酶切构建出了pcDNA3.1+-hAng1，为进一步研究其功能和活性奠定了基础。     

变异链球菌表面蛋白SpaP P区真核表达质粒的构建及表达

背景：变异链球菌是龋病的主要致龋菌,针对介导变异链球菌非蔗糖依赖性黏附的重要毒力因子SpaP的基因疫苗在理论上能对抗变异链球菌黏附于牙面和进一步破坏牙体硬组织。 目的：构建变异链球菌表面蛋白P 区(SpaP/P)真核表达质粒pVAX1-spap/P,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。 方法：通过基因重组技术,构建真核表达质粒pVAX1-spap/P,并经酶切分析、测序分析鉴定正确后,采用脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,然后经免疫组织化学SABC法检测其在细胞中的表达。 结果与结论：真核表达质粒pVAX1-spap/P经 EcoR Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切分析,证实携带1.2 kb的目的基因spap/P片段,经测序分析,目的基因正向插入到预先设计的载体位点处。pVAX1-spap/P转染的细胞胞质呈褐色,pVAX1空载体质粒转染的细胞胞质中无着色。证实实验成功构建真核表达质粒pVAX1-spap/P,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白。