半胱氨酰白三烯受体2通过介导小胶质细胞激活诱导缺血性神经元损伤

目的探索半胱氨酰白三烯(CysLT)受体在大鼠皮层神经元缺氧缺糖损伤中的调节作用及作用机制。方法培养大鼠原代皮层神经元或大鼠原代皮层混合培养细胞,以缺糖缺氧(OGD)模拟脑缺血损伤,以MTT还原法/LDH释放检测确定神经元存活/损伤,以免疫组化做神经元(抗MAP2)、星形胶质细胞(抗GFAP)、小胶质细胞(抗Iba1)特异性染色,观察各细胞数量变化,以PI/Hoechst染色确定细胞凋亡/坏死。以受体激动剂LTD4,NMLTC4,CysLT1拮抗剂孟鲁司特、CysLT2拮抗剂HAMI3379/CysLT1-siRNA及CysLT2-shRNA为药理学干预/基因干扰工具。结果 LTD4(0.1～1000 nmol·L-1),NMLTC4(0.1～1000 nnmol·L-1)不能诱导单纯神经元损伤;CysLT1-siRNA及CysLT2-shRNA不能减轻OGD诱导的神经元损伤;LTD4(1～1000 nnmol·L-1),NMLTC4(0.1～1000 nnmol·L-1)能诱导皮层混合细胞损伤;HAMI3379(0.001～1μmol·L-1)和CysLT2-shRNA能减轻OGD,LTD4或NMLTC4诱导的皮层混合细胞损伤及其诱导的小胶质细胞激活,CysLT1-siRNA无此作用。结论 CysLT2受体可能参与OGD诱导神经元损伤的调节,CysLT2拮抗剂可通过减轻小胶质细胞激活而减轻OGD诱导的神经元损伤。     

中华眼镜蛇毒神经生长因子对PCI2细胞κ阿片受体蛋白质表达的影响

目的 探讨中华眼镜蛇毒(Naja NaBAtra)神经生长因子(nNGF)对PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的影响.方法 PC12细胞分为正常对照组和给药组,采用Western blot方法检测各组PCI2细胞κ阿片受体蛋白质的表达.结果 ①nNGF的25、50、100 μg·L-13个剂量中,50和100μg·L-1nNGF下调PC12细胞κ阿片受体蛋白质的表达,50μg·L-1剂量组下调最明显(P<0.01),100 μg·L-1剂量组下调(P<0.05).②50μg·L-1nNGF分别处理PC12细胞1、3、5、7、10 d后,其κ阿片受体蛋白质表达呈降低趋势,其中d 5、7下调(P<0.05),d 10下调明显(P<0.01).③10μmol·L-1吗啡可上调PC12细胞κ阿片受体蛋白表达,而10 μmol·L-1纳络酮对其无影响,二者分别都能逆转nNGF的下调效应,但是二者共存时不能逆转nNGF的下调效应.结论 nNGF诱导PC12细胞分化中,可引起PC12细胞κ阿片受体蛋白质表达的下调效应,该效应能被吗啡或纳络酮逆转,但二者共存不能被逆转效应.     

PACAP27抑制鱼藤酮诱导细胞凋亡的实验研究

目的探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽27(PACAP27)对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法诱导分化后的PC12细胞,经不同浓度的鱼藤酮处理后,观察其形态改变;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性及代谢状态;磷脂酰丝氨酸外翻法(AnnexinV)检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果经鱼藤酮处理24h后PC12细胞活性明显下降,且呈剂量依赖性(P<0.01);PACAP27(10-12～10-7mol·L-1)对鱼藤酮诱导的细胞凋亡具有明显的抑制作用;与鱼藤酮处理组(250nmol·L-1)相比,PACAP27保护组(10-8mol·L-1)AnnexinV和碘化丙啶(propidiumiodide,PI)呈双阳性的晚期凋亡细胞数明显减少;流式细胞仪结果显示,PACAP27可明显减少凋亡细胞的比值,提高细胞的生存率(P<0.01);而PACAP/VIPⅠ型受体拮抗剂PACAP627可逆转这一效应。结论PACAP27可通过PAC1受体介导对鱼藤酮诱导的细胞凋亡进行有效抑制。     

西罗莫司对鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的抑制作用

目的观察西罗莫司干预鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的作用,以探讨西罗莫司用于治疗帕金森病的可能性及机制。方法 PC12细胞处理分为正常对照组、鱼藤酮50nmol.L-1组和西罗莫司25,50,100和200μg.L-1组。PC12细胞加入西罗莫司25,50,100和200μg.L-1预处理12h后,再加入鱼藤酮50nmol.L-1作用24h。采用4′,6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)免疫荧光实验检测细胞凋亡形态变化;AnnexinⅤ-FITC/PI染色法检测细胞凋亡率;罗丹明123检测线粒体膜电位;吖啶橙荧光染色法检测自吞噬体形成;Western印迹法检测胱天蛋白酶3和微管相关蛋白轻链3(LC3)表达。结果与鱼藤酮模型组比较,西罗莫司50,100和200μg.L-1组细胞凋亡率分别降低了20.6%,35.4%和40.2%(P<0.05,P<0.01);西罗莫司25,50,100和200μg.L-1组可以升高鱼藤酮导致的线粒体膜电位降低,分别为1.8,2.2,2.4和3.2倍。西罗莫司100μg.L-1预处理促使LC3由Ⅰ型向Ⅱ型转变,胱天蛋白酶3的20ku活性片段降低16.2%。结论西罗莫司通过增强失调线粒体的自吞噬降解作用,降低线粒体相关的促凋亡因子的释放和激活,进而抑制依赖胱天蛋白酶凋亡途径的激活而对鱼藤酮诱导的细胞凋亡具有保护作用,提示西罗莫司有治疗帕金森病的可能。     

Survivin在PC12细胞对抗化学性缺氧损伤中的作用

目的探讨存活素(survivin)在PC12细胞对抗氯化钴(CoCl2)诱导损伤中的作用。方法应用不同浓度的CoCl2处理PC12细胞不同时间,建立化学性缺氧诱导PC12细胞损伤的实验模型。应用CCK-8比色法检测细胞存活率;Western-blot法检测CoCl2诱导缺氧与survivin表达间的量效(200～1000μmol·L-1)和时效(0～48h)关系。结果CoCl2可明显抑制PC12细胞的存活率,且呈浓度和时间依赖性。应用不同浓度CoCl2处理PC12细胞24h,在200～600μmol·L-1浓度范围内,呈浓度依赖性地促进survivin表达,600μmol·L-1CoCl2诱导survivin表达达高峰,超过此浓度,则随着CoCl2浓度的增加,survivin表达逐渐下降,CoCl2浓度达1000μmol·L-1时,survivin基本不表达;应用600μmol·L-1CoCl2处理PC12细胞,在0～36h时间范围内,呈时间依赖性地促进PC12细胞survivin的表达,但随着处理时间的延长,survivin的表达逐渐下降;加入2μmol·L-1Hsp90抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG),不仅可以降低600μmol·L-1 CoCl2诱导的survivin高表达,而且加重了600μmol·L-1 CoCl2对PC12细胞的损伤作用,使细胞存活率降低。结论survivin表达上调可能是PC12细胞对抗化学性缺氧损伤的内在防御机制之一。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鱼藤酮诱导的嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法将培养的大鼠PC12细胞分别加入EGCG1,5和10μmol.L-1预处理30 min后加入鱼藤酮250 nmol.L-1继续作用24 h。MTT比色法检测细胞存活率,Hoechst33258染色观察细胞核形态的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,JC-1染色检测线粒体膜电位变化。结果与鱼藤酮模型组存活率(77.0±1.3)%相比,EGCG1,5和10μmol.L-1组细胞存活率显著增加(P<0.05),分别为(79.8±2.3)%,(82.4±2.2)%和(88.3±2.0)%。Hoechst33258染色发现,EGCG组细胞核形态明显改善。与正常对照组比较,模型组细胞凋亡率增加8.2倍;与鱼藤酮模型组比较,EGCG组细胞凋亡率分别下降46%,25%和63%,差异具有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测鱼藤酮组凋亡率为33.8%,EGCG 1,5和10μmo.lL-1组的凋亡率下降至30.6%,14%和15.7%。与模型组相比,EGCG1,5和10μmol.L-1组线粒体膜分别增高了2.48,3.96和4.04倍,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 EGCG具有抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡作用,其机制可能与其稳定线粒体膜电位有关。     

地塞米松和淀粉样β蛋白片段25-35对PC12细胞损伤和凋亡的影响

目的探讨地塞米松(DEX)和淀粉样β蛋白片段25-35(Aβ25-35)联合作用对PC12细胞损伤和凋亡的影响。方法采用单独或联合应用DEX 0.1～10μmol.L-1和Aβ25-35 1～5μmol.L-1作用PC12细胞24 h,MTT法测定细胞活力;膜联蛋白-Ⅴ,PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,PI单染流式细胞仪检测细胞凋亡峰;逆转录-PCR检测胱天蛋白酶3 mRNA的表达水平。结果 MTT结果显示,与正常对照组相比,DEX 5和10μmol.L-1,Aβ25-35 1,5和10μmol.L-1,DEX 5+Aβ25-35 1,5和10μmol.L-1及DEX 10+Aβ25-35 5,10μmol.L-1组均可明显降低PC12细胞存活率,而DEX联合Aβ25-35能明显减少PC12细胞数(P<0.01)。流式细胞仪结果显示,DEX 5μmol.L-1和Aβ25-35 1μmol.L-1单独作用对PC12细胞凋亡率和亚二倍体凋亡峰有一定的增加作用(P<0.05),两者联合作用能明显增加PC12细胞早期和中晚期凋亡率,增加亚二倍体凋亡峰(P<0.01);RT-PCR结果显示,DEX 5μmol.L-1和Aβ25-35 1μmol.L-1单独作用对PC12细胞胱天蛋白酶3 mRNA的表达水平没有明显影响,它们联合作用能明显增加PC12细胞胱天蛋白酶3mRNA的表达水平(P<0.05)。结论 DEX和Aβ25-35联合作用能明显增加对PC12细胞的损伤,促进胱天蛋白酶3 mRNA表达,诱导PC12细胞凋亡。     

PACAP27对鱼藤酮诱导细胞凋亡抑制作用机制的研究

目的探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽27(PACAP27)对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤保护作用的胞内分子机制。方法诱导分化后的PC12细胞,经鱼藤酮(250 nmol.L-1)和(或)PACAP27(10-7~10-8mol.L-1)处理后,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性及代谢状态;Apo-ONE均质荧光法检测Caspase-3活性变化,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化。结果PKA刺激剂db-cAMP(10-4mol.L-1),Forskolin(10-6mol.L-1)可模拟PACAP27的保护作用,而PKC刺激剂TPA(10-7mol.L-1)则无此作用(P>0.05);PKA抑制剂H-89(10-6mol.L-1)可明显削弱PAC-AP27的保护作用,而PKC抑制剂Myr-ΨPKC(10-6mol.L-1)则无此作用(P>0.05);ERK抑制剂PD98059(2×10-5mol.L-1)和p38抑制剂SB203580(5×10-5mol.L-1)可削弱PACAP27的保护作用,而JNK抑制剂SP600125(4×10-5mol.L-1)则无此作用(P>0.05);PACAP27可以明显抑制鱼藤酮诱导的Caspase-3活化;但PACAP27却无法逆转鱼藤酮诱导的线粒体膜电位减低(P>0.05)。结论PACAP27通过PAC1受体介导,激活了PKA和MAPK信号通路,对鱼藤酮诱导的细胞凋亡进行了有效抑制,同时鱼藤酮诱导的这种细胞凋亡与非线粒体依赖的Caspase-3活化有关。     

5-脂氧酶及其抑制剂在MPP~+诱导PC12细胞损伤中的作用

目的探究5-脂氧酶及其抑制剂在MPP~+诱导的PC12细胞损伤中的作用。方法以MPP~+诱导PC12细胞构建细胞损伤模型,以不同浓度的咖啡酸、齐留通预处理PC12细胞,光镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞活性,细胞免疫组化法测定5-脂氧酶的表达情况。结果成功建立MPP~+诱导得PC12细胞损伤模型。免疫组化结果显示,MPP~+1 mmol·L-1可激活细胞内5-脂氧酶蛋白,使其发生核膜移位。光镜和MTT结果表明,咖啡酸50μmol·L~(-1)和齐留通75μmol·L~(-1)可增加正常细胞数量,显著抑制MPP~+诱导的PC12细胞活性降低。此外,50μmol·L~(-1)咖啡酸可以抑制MPP~+诱导的5-LOX激活(抑制了核膜移位),但75μmol·L~(-1)齐留通对MPP~+诱导的5-LOX激活的无明显抑制作用。结论 5-脂氧酶抑制剂对MPP~+诱导的PC12细胞损伤有保护作用,5-LOX激活可能参与PD的发生。     

活性氧激活的ERK1/2通路在化学性缺氧损伤PC12细胞中的作用

目的探讨胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在化学性缺氧损伤PC12细胞中的作用。方法应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞建立化学性缺氧损伤模型。应用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)比色法检测细胞存活率;罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照像检测线粒体膜电位(MMP);流式细胞术检测凋亡细胞百分比;Western blot法测定caspase-3、ERK1/2和p38MAPK蛋白的表达水平。结果应用600μmol.L-1处理PC12细胞60 min可使磷酸化(p)ERK1/2的表达明显升高;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用500μmol.L-1N-乙酰半胱氨酸(NAC,为活性氧的清除剂)预处理1 h可抑制CoCl2对p-ERK1/2表达的上调作用;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用10μmol.L-1U0126(ERK1/2抑制剂)预处理2 h可保护PC12细胞对抗CoCl2引起的损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数目和cleaved caspase-3表达及线粒体膜电位(MMP)丢失均减少;10μmol.L-1U0126预处理还能抑制CoCl2对p-p38MAPK表达的上调作用。此外,应用20μmol.L-1SB203580(p38MAPK抑制剂)预处理能抑制CoCl2对p-ERK1/2表达的上调作用。结论活性氧激活的ERK1/2通路介导CoCl2对PC12细胞的损伤作用,并与p38MAPK通路存在相互的的激活作用。     

配伍红花籽油对大鼠嗜铬细胞瘤细胞抗氧化损伤的保护作用

目的研究配伍红花籽油(CSSO)对过氧化氢(H2O2)诱导PC12细胞损伤的影响。方法建立H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤模型用不同浓度的配伍红花籽油(CSSO)进行药物干预,用MTT法和流式细胞技术检测细胞损伤和凋亡情况,倒置荧光显微镜下进行一般形态学观察。结果200μmol.L-1H2O2诱导PC12细胞6h,细胞呈现明显损伤形态,配伍红花籽油(CSSO)0.3～0.5g.L-1处理24h后,其存活率显著增加(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.05)。结论CSSO可显著的抑制H2O2诱导PC12细胞损伤,其作用机制可能与细胞内的氧化-抗氧化环节有关。     

基于细胞代谢组学的柴胡皂苷b2对皮质酮诱导PC12细胞损伤的保护作用研究

目的 研究柴胡皂苷b2(SSb2)对皮质酮(CORT)诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法 (1)将细胞分为细胞对照组(RPMI-1640培养基培养24 h),CORT(100～800μmol·L^-1孵育24 h)组和SSb2(1.5625,3.125,6.25,12.5,25,50和100μmol·L^-1孵育24 h)组,MTT法检测细胞存活率。(2)将细胞分为细胞对照组(RPMI-1640培养基培养24 h),模型组(CORT 400μmol·L^-1孵育24 h)和模型+SSb2组(SSb2 1.5625,3.125,6.25,12.5和25μmol·L^-1预处理3 h,去上清,然后加入CORT 400μmol·L^-1及对应浓度SSb2共孵育24 h)。MTT法检测细胞存活率,微板法检测PC12细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率。(3)将细胞分为细胞对照组、模型组和模型+SSb2 12.5μmol·L^-1组,采用AnnexinV-FITC/PI流式...     

木豆素A对皮质酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用

利用皮质酮诱导PC12细胞损伤模型,研究木豆素A对皮质酮诱导的PC12细胞的保护作用并探讨相应的保护途径。采用100μmol.L1皮质酮与PC12细胞作用48 h,诱导PC12细胞损伤,然后与不同浓度的木豆素A孵育24 h。检测细胞存活率、LDH渗漏量、细胞内Ca2+浓度及caspase-3活性。结果显示,PC12细胞与皮质酮孵育48 h后细胞存活率明显降低,而LDH漏出量、细胞内Ca2+浓度及caspase-3活性均显著升高;木豆素A(4.0、8.0及16.0μmol.L1)具有改善作用,但量效关系不明显。研究表明,木豆素A对皮质酮诱导的PC12细胞损伤具有明显的保护作用,其保护作用可能是通过降低Ca2+浓度及caspase-3活性来实现的。     

吗啡对μ阿片受体介导的ERK磷酸化的影响

目的：利用表达μ阿片受体的中国仓鼠卵巢细胞,研究吗啡急慢性处理下对细胞外信号调节激酶（ ERK）磷酸化的影响。方法免疫印迹检测磷酸化ERK水平,获取1 h急性处理的ERK磷酸化变化时程和36 h慢性处理以及纳洛酮催促下的ERK磷酸化变化。结果1μmol·L-1吗啡可以快速诱导ERK磷酸化水平短暂升高,5 min时达峰（ P〈0.01）,吗啡诱导的ERK磷酸化水平升高具有显著的浓度依赖性。10μmol·L-1吗啡慢性处理36 h后ERK磷酸化水平与对照组比较,差异无统计学意义,但纳洛酮急性催促5或10 min均导致ERK磷酸化显著下降（与对照比较,P〈0.01）。结论吗啡急慢性刺激下以及纳洛酮催促下ERK磷酸化表现出不同的变化形式,提示μ阿片受体介导下ERK相关的信号通路发生了代偿。     

灵芝孢子多糖LPS3对Lactacystin诱导PC12细胞损伤的影响

目的探讨灵芝孢子多糖LPS3对蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导PC12细胞损伤的影响。方法体外培养PC12细胞,建立Lactacystin诱导PC12细胞损伤的模型,用CCK-8法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI流式细胞法检测细胞调亡,免疫荧光法检测胞浆中α-synuclein聚集物的生成。结果模型组经20μmol·L-1Lactacystin处理24 h后,PC12细胞活力比空白对照组降低,仅为64.7%;经不同浓度的灵芝孢子多糖LPS3预处理后,细胞活性明显提高,且其细胞活性随多糖浓度升高而升高;Lactacystin可以诱导PC12细胞凋亡,处理24 h后细胞凋亡率为45.40%,经灵芝孢子多糖LPS3预处理后,细胞凋亡率明显降低;PC12细胞经Lactacystin处理后,胞浆内可见明显的颗粒状、小团块状α-synuclein聚集体的生成;而经灵芝孢子多糖LPS3预处理后,胞浆中α-synuclein的聚集体明显减少。结论灵芝孢子多糖LPS3对Lactacystin诱导的PC12细胞损伤有一定的保护作用,其作用机制可能与抑制α-synuclein聚集体的生成有关。     

白藜芦醇对星形胶质细胞氧化损伤的保护作用

目的：探讨白藜芦醇( RES)对过氧化氢诱导星形胶质细胞氧化损伤的保护作用及其机制。方法星形胶质细胞传代培养,随机分为阴性对照组(以正常培养液培养),模型对照组(100μmol·L-1的过氧化氢作用12 h),RES小剂量组(20μmol·L-1 RES孵育24 h后,加入过氧化氢作用12 h)和RES大剂量组(40μmol·L-1 RES孵育24 h后,加入过氧化氢作用12 h),采用MTT比色法测定细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hochest33258染色观察凋亡细胞形态,比色法检测凋亡相关因子caspses-3及caspase-9的表达。结果 MTT结果显示5,10,20,40μmol·L-1 RES孵育24 h后细胞活性分别为(100.46±3.17)％,(101.33±3.14)％,(101.33±1.30)％,(99.67±2.62)％,与阴性对照组(98.33±2.13)％比较,差异无统计学意义(P>0.05)。表明RES对星形胶质细胞活性无影响。用20及40μmol·L-1 RES处理后,星形胶质细胞在过氧化氢作用12 h后引起损伤,其活性分别提高到(54.67±4.11)％和(70.33±2.61)％,与模型对照组比较,差异有统计学意义(t=3.59,7.13,P<0.01)。 RES可以抑制过氧化氢诱导的细胞活性的下降,流式细胞计数结果显示用20,40μmol·L-1RES处理后,星形胶质细胞凋亡率分别下降到(35.51±3.56)％和(14.12±3.19)％,与模型对照组(46.31±4.16)％比较,差异有统计学意义(t=4.26,6.33 P<0.01)。 Hochest33258染色结果显示RES可以抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡。此外,RES还可以减少过氧化氢所致星形胶质细胞内caspses-3及caspase-9的表达,并且伴随RES作用时间的延长其表达量呈下降趋势。结论 RES通过抑制caspses-3及caspase-9的表达有效抑制了过氧化氢对星形胶质细胞的损伤,从而为其用于治疗中枢神经疾病提供实验依据。     

胱硫醚-β-合酶/硫化氢系统在鱼藤酮诱导PC12细胞损伤中的变化

目的动态研究胱硫醚-β-合酶/硫化氢(CBS/H2S)系统在鱼藤酮诱导PC12细胞损伤中的变化。方法鱼藤酮诱导具有多巴胺能神经元特性的PC12细胞损伤作为帕金森病(Parkinson's disease,PD)细胞模型,免疫印迹法(Western blot)检测CBS的表达;亚甲基蓝分光光度计法检测细胞内CBS酶活性及硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)的生成;应用CCK-8比色法检测细胞存活率;GSH检测试剂盒检测细胞内GSH含量。结果鱼藤酮损伤6和12 h组,PC12细胞内CBS的表达和活性升高,H2S生成量增加;而在24和48 h组,CBS表达和活性则明显降低,H2S的生成量明显减少;鱼藤酮可以时间依赖性的降低细胞存活率及减少细胞内GSH的含量。结论鱼藤酮刺激引起内源性CBS的表达和活性先升高后降低,H2S的生成先增加后减少,这可能与PC12细胞对抗鱼藤酮诱导的氧化应激损伤有关。     

RNA干扰高迁移率族蛋白1对Aβ_(25-35)刺激HT22细胞中晚期糖基化终末产物受体/Toll样受体4信号通路相关蛋白表达的影响

目的研究RNA干扰高迁移率族蛋白1(HMGB1)对β淀粉样蛋白片段25-35(Aβ25-35)刺激HT22细胞HMGB1、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、Tol样受体4(TLR4)、NF-κB、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等蛋白表达的影响。方法 Aβ25-350,2.5,5,10,20和40μmol·L-1作用HT22细胞24 h后,MTT法检测细胞存活,计算半数抑制浓度(IC50)。将对数生长期的HT22细胞分为5组:正常细胞对照组、Aβ25-3540μmol·L-1组、小干扰RNA(siRNA)50μmol·L-1组、siRNA或scramble siRNA+Aβ25-35组(HT22细胞转染si RNA或scramble si RNA 50μmol·L-1作用24 h后,再加入终浓度为40μmol·L-1人工合成的Aβ25-35处理24 h),显微镜观察细胞形态变化,免疫荧光检测HMGB1在细胞中位置的改变,Western印迹法检测细胞内HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平。结果Aβ25-35作用HT22细胞24 h,IC50为41.17μmol·L-1。后续采用Aβ25-3540μmol·L-1进行实验。Aβ25-3540μmol·L-1作用24 h后,细胞大量死亡,聚集成团,突起减少,细胞间隙增大,且HMGB1从核内转移至核外。细胞内的HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65表达均显著升高(P<0.05),细胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平显著升高(P<0.05);经siRNA 50μmol·L-1处理24 h,可显著降低细胞内HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65的表达(P<0.05)及细胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平(P<0.05)。结论 RNA干扰HMGB1可减少Aβ25-35刺激HT22细胞HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65的表达。     

氯胺酮对HepG2细胞线粒体功能的影响

目的评价氯胺酮的线粒体毒性,从而探讨氯胺酮可能的毒性机制。方法 Hep G2细胞培养基中分别加入齐多夫定10~2000μmol·L-1培养7 d,或加入氯胺酮50~3000μmol·L-1培养24 h,CCK8细胞计数法测定细胞存活率。Hep G2细胞培养基中分别加入齐多夫定100μmol·L-1培养7 d后,或加入氯胺酮100和1200μmol·L-1培养24 h,化学发光法检测胞内ATP合成水平,荧光探针法检测胞内钙离子浓度、活性氧及线粒体膜电位(ΔΨm)的变化,同时设齐多夫定1000μmol·L-1用于实时荧光定量PCR检测线粒体DNA(mt DNA)表达水平的变化。结果与正常对照组相比,齐多夫定10~2000μmol·L-1可以抑制细胞存活,IC50为100μmol·L-1;氯胺酮1000~3000μmol·L-1抑制细胞存活,IC50为1200μmol·L-1。与正常对照组相比,齐多夫定100μmol·L-1组线粒体ATP合成水平显著下降(P<0.05),胞内钙离子浓度明显升高(P<0.05),活性氧水平显著升高(P<0.05),ΔΨm显著下降(P<0.05),而1000μmol·L-1可以明显干扰mt DNA表达水平(P<0.05)。氯胺酮100μmol·L-1组ATP合成水平明显下降(P<0.05),其他指标均无显著性差异;氯胺酮1200μmol·L-1组ATP合成水平显著下降(P<0.01),活性氧水平和胞内钙离子浓度显著升高(P<0.01),ΔΨm显著下降(P<0.05),mt DNA水平无明显改变。结论氯胺酮可以通过干扰线粒体代谢功能而诱导线粒体损伤。     

远志寡糖酯A对C6细胞MAPK/ERK信号通路的影响

目的探究远志寡糖酯A(tenuifoliside A)对大鼠胶质瘤细胞(C6细胞)的神经营养作用及可能机制。方法远志寡糖酯A 60,30,10,6,3和0.6μmol·L-1处理C6细胞24 h,MTT法检测检测细胞存活率;远志寡糖酯A 10μmol·L-1处理C6细胞0,5,10,15,30,45,60,120 min,Western blotting测定C6细胞中p-ERK,ERK,BDNF的表达水平;选取各有效剂量分别处理C6细胞24 h,蛋白免疫印记法测定C6细胞中BDNF的表达水平;用ERK1/2特异性拮抗剂U0126 10μmol·L-1预处理C6细胞30 min,再用远志寡糖酯A 10μmol·L-1处理15 min,Western blotting检测p-ERK,ERK,BDNF的表达水平。结果与正常组细胞相比,30,10,6和3μmol·L-1剂量能促进C6细胞增殖,60μmol·L-1剂量对C6细胞有抑制作用,远志寡糖酯A 0.6μmol·L-1剂量对细胞增殖作用不明显;远志寡糖酯A诱导C6细胞中ERK1/2磷酸化具有时效性,在5 min起效,15 min时ERK1/2磷酸化水平达到最高峰,1 h后回落;不同浓度的远志寡糖酯A促C6细胞内BD-NF表达呈剂量依赖性;和溶剂组相比,ERK1/2拮抗剂处理组的p-ERK,ERK,BDNF的表达水平显著降低。结论远志寡糖酯A对大鼠胶质瘤细胞有促增殖作用,其机制可能与激活MAPK/ERK通路,磷酸化ERK1/2,进而促进CREB磷酸化,最终促进BDNF表达有关。