HO-1基因转染对骨髓间充质干细胞增殖、 表型及多向分化能力的影响

目的 探讨在体外培养条件下,慢病毒载体介导的血红素加氧酶-1(HO-1)基因转染对骨髓间充质干细胞(MSC)增殖、表型及多向分化能力的影响。方法 分离培养大鼠源性骨髓MSC,利用过表达HO-1重组慢病毒载体(lenti-HO-1)将HO-1基因转染到MSC中,用荧光倒置显微镜及Western blot法分析评估转染效率。利用1.5μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定过表达HO-1的MSC(MSC-HO-1)。用Western blot法检测MSC与MSC-HO-1内HO-1蛋白表达情况,用细胞计数法绘制MSC与MSC-HO-1的生长曲线,流式细胞仪检测MSC与MSC-HO-1表型,成骨、成脂及成软骨细胞诱导分化检测多向分化潜能变化。结果 MOI=50的 Lenti-HO-1可高效转染MSC。与MSC比较,MSC-HO-1在经过多次传代后仍能高效过表达HO-1,差异有统计学意义(P<0.05)。MSC-HO-1的增殖生长趋势、表面标志表达及多向分化潜能均与未转染的MSC相似。结论 重组慢病毒载体Lenti-HO-1可成功转染MSC并高效表达转入的基因;HO-1基因修饰对MSC增殖活性、免疫表型及多向分化潜能无显著影响。     

SOX9基因修饰骨髓间充质干细胞并诱导其向髓核样细胞分化的实验研究

目的探讨SOX9慢病毒载体感染兔骨髓间充质干细胞(MSC)并诱导其向髓核样细胞的分化。方法构建SOX9基因慢病毒载体并感染MSC,将MSC分为未转导组、空转导组及SOX9转导组。采用流式细胞仪检测MSC的感染率及凋亡率,MTT检测MSC的增殖情况,RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色检测MSC中SOX9、Ⅱ型胶原及Aggrecan在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果成功构建SOX9基因慢病毒载体并感染MSC,感染率为100%。慢病毒载体感染对3组MSC的增殖及凋亡无明显影响;感染2周后,SOX9转导组MSC中SOX9及Ⅱ型胶原在mRNA及蛋白水平的表达均明显高于未转导组与空转导组(P<0.01),Aggrecan mRNA及蛋白仅在SOX9转导组MSC中表达;SOX9转导组MSC中Ⅱ型胶原及Aggrecan荧光染色呈阳性,而空转导组及未转导组MSC均呈阴性。结论 SOX9慢病毒载体感染的MSC可被诱导向髓核细胞分化。     

稳定表达Bcl-2的骨髓间充质干细胞载体的建立及对缺血性损伤保护作用的实验研究

目的 构建稳定表达Bcl-2基因的大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)载体,观察Bcl-2基因转染对骨髓间充质干细胞生物特性的影响及体外模拟缺血性损伤的保护作用.方法 用RT-PER技术扩增小鼠Bcl-2 cDNA,慢病毒介导的基因转导骨髓间充质干细胞,转导后的细胞用Puromycin筛选,RT-PER法检测转染后Bcl-2的表达,采用血清剥夺和缺氧(SOD)处理建立MSC体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术评价转染Bcl-2基因的MSC和未转染的MSC的凋亡及存活情况.对转导Bcl-2的MSC神经诱导及检测.结果 转导Bcl-2基因的MSC经Puromycin筛选后可稳定、高效表达Bcl-2蛋白;流式细胞术检测显示:和MSC相比,转导Bcl-2基因的MSC在SOD后凋亡细胞较少,存活细胞较多.转导Bcl-2基因的MSC仍具有向神经细胞分化的潜能.结论 慢病毒介导的Bcl-2基因转导MSC有其蛋白的稳定表达,Bcl-2基因转导可对抗MSC体外模拟缺血性损伤引起的细胞凋亡,从而具有保护性作用,且不影响MSC向神经细胞分化的潜能.     

胰腺十二指肠同源框-1基因促进大鼠骨髓间充质干细胞体外横向分化为胰岛素分泌细胞

目的:研究胰腺十二指肠同源框-1基因(Pdx-1)在骨髓间充质干细胞(MSC)体外分化中的作用。方法:构建含有Pdx-1基因的真核表达载体,转染介质Superfect介导重组载体转染MSC,G418筛选阳性细胞后对转染组(Pdx-1+MSC)和未转染组(Pdx-1-MSC)均体外进行诱导分化,细胞免疫组化染色鉴定诱导后胰岛素分泌阳性细胞。结果:限制性酶切分析和序列测定证实成功构建了含有Pdx-1基因的真核表达载体,荧光显微镜观察证实Superfect能高效介导重组载体转染MSC;细胞免疫组化染色显示Pdx-1+MSC分化为胰岛素分泌细胞的数量较Pdx-1-MSC明显增多,阳性率分别为(28.23±2.56)%和(7.08±2.69)%。结论:Pdx-1能增强大鼠MSC体外分化为功能性胰岛素分泌细胞的能力,为胰岛移植开辟新的思路,对1型糖尿病治疗有重要的应用价值。     

SPK1基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的观察鞘氨醇激酶-1（SPK-1）基因修饰对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。方法分别用携带SPK-1和绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒载体,感染大鼠骨髓间充质干细胞后用WesternBlot的方法检测SPK1蛋白表达,用[32P]ATP掺入法检测SPK-1酶活性,用MTT法测定细胞增殖,用特殊诱导剂在体外向成骨和成脂细胞诱导后检测碱性磷酸酶的活性及油红O染色,用AnnexinV-PI双标法检测去血清诱导后细胞凋亡比例。结果Ad-SPK感染大鼠骨髓间充质干细胞后可有效表达SPK-1蛋白且有较高的酶活性;基因转染不影响MSC的增殖和向成骨、成脂细胞的分化,但可显著抑制去血清诱导的细胞凋亡。结论腺病毒介导的SPK-1基因转染不影响MSC的增殖、分化等干细胞基本特性,但可显著增强其抗凋亡能力。     

Peroxiredoxin2基因RNAi慢病毒载体构建及对SW480细胞增殖的影响

目的：构建Peroxiredoxin2（PRDX2）基因RNA干扰（RNAinterference,RNAi）慢病毒表达载体,探讨PRDX2基因干扰后对结直肠癌SW480细胞增殖的影响。方法设计、合成靶向PRDX2的RNA干扰的序列,构建pGC‐EGFP‐shPRDX2慢病毒载体并进行鉴定,同时应用qRT‐PCR和Westernblot方法观察转染的SW480结肠癌细胞PRDX2mRNA和蛋白表达的抑制效果,并通过MTT、平板克隆形成实验检测细胞增殖变化。结果成功构建PRDX2基因慢病毒载体并经测序证实;pGC‐EGFP‐shPRDX2可有效抑制结直肠癌SW480细胞PRDX2的表达,感染慢病毒的SW480细胞中PRDX2mRNA和蛋白表达水平明显降低（P＜0．05）;SW480细胞经PRDX2RNA干扰后其生长和增殖能力显著降低（P＜0．05）。结论PRDX2基因RNAi慢病毒表达载体在SW480细胞中表达稳定可靠,PRDX2基因干扰后有效抑制了结直肠癌SW480细胞的增殖和生长,为进一步探讨PRDX2在结直肠癌发生、发展及转移中的作用奠定基础。     

MIA2慢病毒表达载体构建及其表达活性的研究

目的：构建黑色素瘤抑制蛋白2（MIA2）慢病毒表达载体,并将其通过脂质体转染到HepG2细胞中,观察转染前后MIA2表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法以pDONR223‐MIA2为模板,PCR扩增MIA2,构建pLVX‐IRES‐ZsGreen1‐MIA2慢病毒表达载体,体外瞬时转染肝癌细胞HepG2,荧光显微镜下观察MIA2的表达情况,用实时荧光定量PCR（RT‐PCR）检测HepG2细胞中MIA2mRNA的表达情况,噻唑蓝（MTT）法和克隆形成实验检测细胞增殖的情况。结果成功构建pLVX‐IRES‐ZsGreen1‐MIA2慢病毒表达载体;RT‐PCR结果显示,阴性对照组与实验组细胞MIA2mRNA表达水平差异有统计学意义（P＜0．05）;MTT检测发现,实验组细胞增殖数目较阴性对照组明显减少,差异有统计学意义（P＜0．05）;此外,实验组的克隆形成数和细胞迁移数均较阴性对照组明显减少,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论pIRES2‐ZsGreen1‐MIA2可显著下调MIA2的表达水平进而抑制肝癌细胞HepG2的体外增殖及迁移能力。     

大鼠CGRP基因重组慢病毒载体的构建及滴度测定

目的构建含大鼠降钙素相关基因肽(CGRP)基因的慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞并研究CGRP的功能奠定基础。方法通过基因工程技术将CGRP基因克隆到穿梭质粒中,构建Puc57-CGRP质粒,用双酶切法构建慢病毒表达载体(pLenO-DCE-CGRP),将该质粒载体与4种辅助包装质粒共转染293T细胞,转染的293T细胞继续培养48h后,收集其上清液,浓缩得到高滴度的慢病毒液,然后采用倍比稀释法和流式细胞术检测病毒滴度,并通过实时定量聚合酶链反应(PCR)检测293T细胞中CGRP基因的表达。结果成功构建了pLenO-DCE-CGRP的重组慢病毒载体,滴度为5.1×108TU/mL。结论成功构建了含CGRP基因高滴度的慢病毒载体,为后续转染间充质干细胞(MSC)并研究CGRP的功能奠定了基础。     

p21Waf1／Cip1甲基化调控细胞衰老

目的：探讨 p21Waf1／Cip1启动子甲基化改变对细胞衰老进程的影响。方法采用克隆、测序的方法定量检测p21Waf1／Cip1启动子在人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）衰老过程中的甲基化改变;RT‐PCR和Western blot检测p21Waf1／Cip1的表达;采用5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷去甲基化处理2BS细胞,通过M T T和β‐半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果 p21Waf1／Cip1启动子在年轻2BS中,CpG甲基化的发生率为1．25％;在中年细胞中为27．27％;在衰老2BS细胞中为0．64％;p21Waf1／Cip1的表达在细胞衰老过程中呈波动性变化,先增加,后降低,到细胞开始衰老时,表达又显著增加;中年2BS细胞经5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷处理后,p21Waf1／Cip1表达增加,细胞增殖速率较正常中年细胞显著降低,同时细胞β‐半乳糖苷酶染色阳性率增加。结论 p21Waf1／Cip1去甲基化加速细胞衰老。     

Daxx过表达能显著抑制AngII诱导的血管平滑肌细胞的增殖和迁移

目的构建重组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP,并探讨Daxx对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导VSMCs增殖的影响。方 法基于PAS（PCR-based Accurate Synthesis）的方法构建重组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP。经测序和酶切验证后,用重 组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP与包装辅助载体共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液纯化后感染VSMCs, Western blot法鉴定过表达Daxx的VSMCs株。然后将pCDH-EGFP病毒液感染的空载体细胞和pCDH-Daxx-EGFP病毒液的 感染的过表达Daxx细胞都分成无血清培养基孵育组和AngⅡ孵育组。用MTT法检测细胞活性、流式细胞术观察细胞周期、划 痕法检测细胞迁移、Western blot法检测细胞中p-Akt蛋白表达。结果基因测序与双酶切鉴定表明Daxx基因慢病毒表达载体 构建成功;与Vector组比,转染Daxx组、蛋白表达水平明显增加（P<0.05）;经AngII处理后,转染Daxx组细胞活性、S期细胞比率 和与细胞迁移率与Vector 组比较显著降低（P<0.05）;转染Daxx组细胞中p-Akt 蛋白表达显著降低（P<0.05）。结论成功构建 了重组慢病毒表达载体pCDH-Daxx-EGFP和过表达Daxx 的VSMCs株;Daxx能显著抑制AngII诱导的VSMCs增殖和迁移, 其机制可能与p-Akt蛋白有关。     

慢病毒介导的增强型绿色荧光蛋白报告基因对间充质干细胞的标记

目的 探讨慢病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记间充质干细胞(MSC)是否影响其细胞生物学特性,以及EGFP基因能否持久稳定表达.方法 以不同病毒感染复数(MOI)实行EGFP慢病毒对MSC的感染,通过流式细胞分析法(FACS)检测EGFP的阳性率,并在荧光显微镜下观察EGFP在MSC的表达情况;通过锥虫蓝染色、MTT比色法、Hoechst染色和FACS检测细胞活力、增殖、凋亡和周期;EGFP慢病毒感染MSC体外持续培养2、4、8、16周时通过FACS检测EGFP的阳性率和荧光强度,以评价EGFP基因在MSC表达的稳定性.结果 EGFP慢病毒以MOI=20感染MSC 96 h,EGFP阳性率达97.39%±0.68%;与对照MsC相比,EGFP慢病毒感染MSC时,对细胞活力、增殖、凋亡和周期均没有影响(P＞0.05);EGFP-MSC在体外持续培养2,4、8、16周,EGFP阳性率分别为97.50%±0.54%、97.32%±0.51%、97.39%±0.11%、97.48%±0.13%,荧光强度(A值)分别为440 ±13、445±12、458±13、456±16,均能够保持稳定水平.结论 EGFP慢病毒能够高效标记MSC,并且不影响其生物学特性,EGFP基因在MSC能够持久稳定表达,可以用于下一步的细胞示踪研究.     

siRNA 沉默胸腺素β4对鹿茸间充质干细胞增殖的影响

目的：利用 siRNA 干扰技术研究胸腺素β4（Tβ4）基因沉默对鹿茸间充质干细胞（MSC）增殖的影响。方法鹿茸 MCS 分为阴性对照组、siRNA-Tβ4转染组2组。MTT 检测 MSC 增殖的变化,Real-time PCR 检测 ILK、AKT 及 CyclinD1 mRNA 表达量差异变化,Western blot 检测 AKT 及 P-AKT 蛋白含量变化。结果 siR-NA-Tβ4转染组 MSC 增殖受到显著抑制（P ＜0.01）;siRNA-Tβ4转染组 ILK、CyclinD1 mRNA 表达量下调,AKT mRNA 表达量不变;siRNA-Tβ4转染组总 AKT 蛋白含量无变化,P-AKT 蛋白含量减少。结论 Tβ4基因沉默能显著抑制 MSC 增殖,并可能通过下调 ILK、P-AKT 及细胞周期相关蛋白 CyclinD1从而抑制 MSC 细胞增殖。     

脂质体法介导pIRES2-EGFP-hVEGF165转染人胎盘源间充质干细胞

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165）的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,通过脂质体法将其转入人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs)中,鉴定hVEGF165的表达活性及携带目的基因的HPMSCs的多向分化潜能。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 技术,从人白血病细胞HL-60中扩增出hVEGF165的基因片段,构建pIRES2-EGFP-hVEGF165 重组质粒,经酶切检测其构建的正确性,通过脂质体法转染HPMSCs后分别采用RT-PCR、Western blotting 法及MTT法检测其转录和表达活性;荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP),检测含有报告基因EGFP空载体及携带报告基因和目的基因的真核表达载体转染靶细胞的情况;并再次鉴定转染后HPMSCs的多向分化潜能。结果：成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165;RT-PCR、Western blotting及MTT法检测表明,构建的质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165具有转录及表达活性;绿色荧光显微镜下观察到EGFP表达,目的基因成功转入靶细胞,携带目的基因的HPMSCs仍保持多向分化潜能。结论：成功构建具有表达活性的hVEGF165真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,hVEGF165在HPMSCs中具有转录及表达活性,且对HPMSCs的增殖具有促进作用;HPMSCs本身可能具有hVEGF165的内分泌功能。     

骨形态发生蛋白2基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：评价携带骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒（Ad-BMP-2）转染人骨髓间充质干细胞（MSC）对其成骨分化的影响。方法：由健康青年男性髂骨抽取骨髓培养MSC，BMP-2基因转染后，用RT-PCR及免疫组化染色证实转基因MSC的BMP-2基因表达，原位杂交及免疫组化染色检测转染后细胞成骨活性，并进行透射电镜观察。结果：转染后细胞稳定表达BMP-2基因，核心结合因子a1、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶呈阳性表达，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：Ad—BMP-2基因转染可以提高MSC的体外成骨能力。     

阳离子脂法介导质粒转染大鼠骨髓基质干细胞用于基因修饰的细胞移植治疗

目的探讨阳离子脂转染方法在骨髓基质干细胞(BMSC)基因转染中的应用.方法通过梯度试验确定相对最佳的转染条件并测定LipofectamineTM2000(LP2000)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率;分析细胞周期对导入基因表达的影响;以流式细胞仪测定转基因BMSC的EGFP表达强度和阳性比例随时间的变化;将EGFP基因转染的大鼠BMSC注射法移植入同源大鼠心肌内,以逆转录PCR法检测心肌组织内EGFP基因的转录,荧光显微镜法检测EGFP阳性的BMSC.结果在不同转染条件下(DNA浓度、DNA:LP2000),LP2000介导EGFP基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率不同;通过阳离子脂法导入基因的表达效果受细胞周期制约;细胞移植后,能在大鼠心肌组织中检测到EGFP基因的转录以及表达EGFP基因的BMSC.结论阳离子脂可以作为基因修饰的细胞移植治疗的有效载体.为了提高基因转染的瞬时效率和基因的表达效率,降低毒性、满足转基因细胞移植的要求,尚需进一步的研究.     

Notch-1在骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,抑制Notch-1基因的表达,从而观察Notch-1基因在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经细胞后的存活及分化中的作用.方法:构建mNotch-l短发夹状RNA(short hairpin RNA,mNotch-1shRNA);然后对mNotch-lshRNA转染的MSCs进行形态学观察;MTT检测转染前、转染24h、转染3天的MSCs的存活率;体外条件下采用BDNF、全反式维甲酸等诱导mNotch-lshRNA转染的MSCs分化,采用免疫细胞化学染色,检测Nestin、NSE及NF200(神经元标记物)、GFAP(神经胶质细胞标记物)的表达.结果:mNotch-lshRNA转染成功的细胞立体感增强,Notch-1基因表达消失,转染后24h和3天的MSCs细胞存活率下降,与未转染和转染对照组比较有显著性差异(P＜0.01);转染mNotch-1shRNA的MSCs向神经细胞的分化效率显著提高,NSE、NF200的表达均高于未转染的和转染对照组的,且未见GFAP表达.结论:mNotch-lshRNA抑制Notch-1基因的表达,促进MSCs向神经细胞的分化效率,提示MSCs的横向分化过程可能与神经干细胞类似,阻断Notch信号通路,会加MSCs向神经细胞分化的效果.     

Gene Transfection Mediated by Ultrasound and Pluronic P85 in HepG2 Cells

In order to assess whether gene transfection could be mediated by ultrasound in associa- tion with P85 and find the appropriate parameters of ultrasound irradiation, the effects of ultrasound with or without P85 on gene transfection of HepG2 cells were examined. The HepG2 cells were irra- diated by ultrasound at 1 MHz, 0.4-2.0 W/cm2 and 50% duty cycle with plasmid encoding enhanced green fluorescent protein (EGFP) as a report gene. Forty-eight h later, the expression of EGFP was detected under the fluorescence microscopy. Transfection efficacy was quantitatively assessed by flow cytometry, and cell viability was evaluated by trypan blue exclusion. The results showed that the transfection efficacy was increased with the increases in ultrasound output power and the ideal trans- fection efficacy was achieved in HepG2 cells irradiated by ultrasound at 0.8 W/cm2 for 30 s. The transfection efficacy in ulstrasound P85 group was three times higher than in single ultrasound group [(17.63±1.07)% vs (5.57±0.56)%, P<0.05]. The cell viability was about 81% and 62% in ultrasound group and ultrasound P85 group respectively. It was concluded that ultrasound in combination with P85 could mediate the gene transfection of HepG2 cells, ideal transfection efficacy was achieved by ultrasound irradiation at 0.8 W/cm2 for 30 s, and P85 could somewhat increase the damage to cells caused by ultrasound.     

增强型绿色荧光蛋白基因转染兔间充质干细胞的实验研究

目的建立增强型绿色荧光蛋白标记间充质干细胞（MSCs）的方法,并观察标记方法对MSCs的分化功能影响。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔外周阻MSCs,以携带EGFP的腺病毒（Ad-CMV-EGFP）转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察其瞬时表达及转染效率,并对转染后的MSCs进行诱导分化为内皮细胞以观察其部分分化功能。结果①MSCs于体外培养14～20d可达到80％～90％融合,细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞,增殖活跃;②MSCs经携带EGFP腺病毒转染后24h即可表达EGFP,4～5d时表达最强,此后逐渐减弱,2wk时明显减弱,到4wk时无EGFP表达;③测定腺病毒转染MSCs效率约为60％;④经诱导后分化的内皮细胞呈铺路石样排列,CD31呈阳性表达。结论Ad．CMVoEGFP转染后的MSCs可有效表达EGFP,且本法转染效率较高,基本不影响细胞分化功能,是一种较好的MSCs标记方法。