体内连续筛选法建立人结肠癌肝转移阶梯细胞模型

目的：通过在裸鼠体内进行SW1116结肠癌细胞株原位种植肝转移连续筛选,建立人结肠癌肝转移阶梯细胞模型系统,为研究结肠癌转移的分子机制提供实验模型。方法：将SW1116细胞株在裸鼠皮下连续5次传代后,取皮下种植瘤在裸鼠结肠进行原位种植,继而取肝脏转移灶进行下一代裸鼠结肠原位种植,经3次结肠原位种植肝转移筛选,建立大肠癌肝转移阶梯细胞模型。用免疫组化法验证种植瘤及转移灶的组织来源,并行同期体内外侵袭实验,检测经体内连续筛选出的癌细胞侵袭转移能力变化。结果：经5代皮下连续传代及3代结肠至肝的体内转移筛选,成功建立了第三代结肠癌肝转移筛选细胞系（CRCLM3）。裸鼠种植瘤及转移灶均表达人癌胚抗原,而同期体内外侵袭试验结果显示,经体内筛选得到的结肠癌细胞株转移能力逐渐加强。结论：经体内连续肝转移筛选所建立的结肠癌细胞系侵袭转移能力增强,而CRCLM3细胞系是研究结肠癌肝转移机制的理想细胞模型。     

Cortactin过表达对结肠癌细胞转移能力的影响

目的:通过诱导皮层肌动蛋白(cortactin)的过表达分析其在结肠癌细胞侵袭迁移以及肝转移过程中的作用。方法:构建含CTTN基因和绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体,转染293T细胞。取含CTTN基因和绿色荧光蛋白的病毒上清液转染结肠癌细胞株SW1116使cortactin稳定表达。蛋白印迹实验检测cortactin的表达,通过Transwell实验评估结肠癌细胞侵袭迁移能力的改变。利用SW1116细胞株使裸鼠皮下成瘤,取肿瘤组织种植新一批裸鼠结肠壁并观察结肠癌肝转移的情况。结果:成功构建cortactin过表达的SW1116细胞。侵袭和迁移实验中,过表达组穿膜细胞数分别为(147±12)个、(286±17)个,而阴性对照组为(83±10)个、(112±11)个,空白对照组为(75±7)个、(103±9)个,后两组与过表达组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:上调cortactin的表达能显著促进结肠癌细胞的侵袭迁移和肝转移能力,提示cortactin在结肠癌的转移过程中发挥重要作用。     

结肠癌肝转移细胞增殖能力减弱

目的 通过阶梯转移法在裸鼠中筛选出人结肠癌肝转移细胞,然后对结肠癌肝转移细胞的生长增殖能力进行鉴定.方法 通过SW1116细胞株裸鼠皮下连续5次传代后取皮下种植瘤裸鼠结肠原位种植,分别取肝脏转移灶和皮下5代细胞进行原代培养,获得大肠癌肝转移细胞和皮下5代的原代细胞,分别命名为结直肠癌肝转移细胞1代(CHM-1)和皮下第5代(P5),通过CCK-8测生长曲线、流式检测细胞周期以及细胞周期相关的蛋白的免疫细胞化学来对SW1116、CHM-1和P5增殖能力进行检测.结果 细胞增殖实验显示CHM-1生长速度明显慢于SW1116和P5细胞(P＜0.05);流式细胞周期分析中CHM-1细胞G41期(68.390±2.865)%比例高于SW1116(50.440±1.472)%和P5(53.930±2.651)%(P＜0.05),G2期CHM-19(13.530±4.411)%比例要低于SW1116(32.030±5.645)%和P5(29.720±3.559)%(P＜0.05),S期3种细胞差异无统计学意义(18.250±6.901)%、(19.050±4.162)%、(18.930±0.169)%(P＞0.05);免疫细胞化学分析发现细胞周期蛋白Cyclin DI在CHM-1(23.7±4.7)%中的表达比SW1116(30.2±5.1)%和P5(32.1±4.2)%减少(P＜0.05).结论 发现侵袭能力和生长增殖能力具有反向关联,即结肠癌肝转移细胞具有更强的侵袭能力,但生长增殖速度比其他细胞更慢.

Abstract：

Objective To study the proliferation ability of liver metastatic colorectal cancer cells by establishing stepwise metastatic colorectal carcinoma cell model via in vivo selection.Methods SW1116 cells were transplanted into the subcutis of nude mice and serially passaged for 5 times,and then the subcutaneous tumor was implanted into the cecal wall of new nude mice.The liver metastatic lesions and the subcutaneous carcinoma cells of the fifth generation were picked for primary culture.Two cell lines named CHM-1 and P5 were obtained.Proliferation levels were analyzed by testing of cell growth curve,cell cycle analyses by flow cytometry and Cyclin D1 analysis by immunocytochemistry.Results CHM-1 grew much slower than P5 and SW 1116 although there was no difference between P5 and SW 1116 in cell proliferation assay ( P＜0.05 ).Cell cycle analysis revealed that the percentage of cells in G0/G1 phase was higher (P＜0.05) in CHM-1 (68.390 ±2.865)% than in SW1116 (50.440 ± 1.472)% and P5 (53.930 ± 2.651)%,but that in G2/M phase was lower ( P＜0.05 ) in CHM-1 ( 13.530 ± 4.411 )% than in SW1116 (32.030 ±5.645)% and P5 (29.720 ±3.559)% rough there was no difference in S phase ( 18.250 ± 6.901 )%,( 19.050 ± 4.162 )%,( 18.930 ± 0.169 )% ( P ＞ 0.05 ).The expression of cell cycle proteins Cyclin D1 was decreased ( P＜0.05 ) in CHM-1 ( 23.7 ± 4.7 )% as compared with thoseinP5(32.1±4.2)% and SW1116 (30.2 ±5.1)%.Conclusion In the same cell line,there was a reverse relationship between the ability of invasion and proliferation.     

γ-synuclein基因真核表达载体的构建及其对结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能的影响

目的构建针对γ-synuclein基因的真核表达载体并观察其对结肠癌细胞sw1116体外侵袭及与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）黏附能力的影响。方法从结肠癌细胞系HT29提取总RNA,经RT．PCR获得γ-synucleincDNA全长片段,经过酶切连接等反应定向克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,以脂质体转染的方法将重组质粒转染至结肠癌细胞系SW1116,经G418筛选出稳定转染的细胞株。采用Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力。将细胞接种于铺有HUVEC的96孔板中,酶标仪读取荧光强度来表示黏附细胞的相对数。结果成功构建pEGFP-γ-synuclein真核表达载体,经过筛选后可在SW1116细胞中稳定表达,且能在体外翻译出GFP-γ-synuclein融合蛋白质。转染γ-synuclein后,穿过Matrigel胶及Transwell小室膜的细胞数明显增加（198．4±20．7比98．8±13．2,P〈0．05）,与HUVEC黏附的细胞数（荧光强度）亦显著增加（3．08±0．36比1．22±0．21,P〈0．05）。结论γ-synuclein可显著增强结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能。     

钙黏蛋白12在结肠癌细胞株与结肠直肠癌组织中的表达及其影响

目的：研究钙黏蛋白12（cadherin-12,CDH-12）在结肠癌细胞株与结肠直肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞株增殖、侵袭、迁移的影响。方法：应用实时PCR和Western印迹法在7株结肠癌细胞株中筛选CDH-12高表达细胞株;shRNA瞬转干扰高表达细胞株SW1116,Western印迹法验证干扰效果;CCK-8检测癌细胞增殖活性变化;transwell实验验证癌细胞迁移、侵袭能力的变化;组织芯片免疫组织化学技术检测CDH-12在结肠直肠癌组织中的表达。结果：实时PCR和Western印迹结果显示CDH-12在细胞株中表达,SW1116和LoVo两个细胞株高表达CDH-12,在成功下调SW1116细胞中CDH-12表达之后,SW1116结肠癌细胞株的增殖、迁移、侵袭能力较对照组明显下降;免疫组化染色结果显示,CDH-12在结肠直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织中的表达。结论：CDH-12在结肠直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,证实了CDH-12为癌基因的可能性;下调CDH-12在结肠癌细胞株SW1116的表达可明显抑制细胞的增殖、迁移、侵袭能力,显示其在肿瘤细胞生长和转移中的重要作用。     

伴侣蛋白CCT6A参与结肠癌细胞迁移及侵袭的作用研究

目的:研究伴侣蛋白CCT6A在结肠癌细胞株迁移和侵袭过程中的作用。方法:培养9株结肠癌细胞,抽取总RNA和蛋白。采用实时定量PCR和Western印迹法筛选CCT6A高表达的细胞株。设计购买3种siRNA片段,转染高表达CCT6A的结肠癌细胞株,利用实时定量PCR和Western印迹法验证干扰效果。选择干扰效果最优的RNA干扰片段,通过Transwell实验来评估转染后结肠癌细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:SW1116细胞株中的CCT6A在mRNA及蛋白水平都呈现高表达;3种干扰片段转染SW1116细胞后,CCT6A表达量均有不同程度下降,其中以片段2的干扰效果最优。在迁移实验中,CCT6A干扰组穿膜细胞数为(6±2)个,低于阴性对照组(23±12)个和空白对照组(21±11)个;在侵袭实验中,CCT6A干扰组穿膜细胞数为(9±2)个,低于阴性对照组(40±12)个和空白对照组(43±10)个;上述差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:下调CCT6A的表达能显著抑制结肠肿瘤细胞的迁移、侵袭能力,提示CCT6A可能在结肠癌浸润和转移中起到一定作用。     

沉默MAD2基因对结肠癌细胞的影响

目的:研究沉默MAD2基因对结肠癌细胞的影响。方法 :采用RT-PCR和Western印迹法筛选MAD2基因在7种结肠癌细胞中的高表达细胞株,并用siRNA瞬时转染以降低MAD2表达,随后采用CCK-8法检测结肠癌细胞增殖能力。流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,transwell实验评估转染后结肠癌细胞迁移能力的改变。结果:SW1116细胞在mRNA和蛋白水平均呈现高表达MAD2,转染靶向MAD2的siRNA可显著降低MAD2在SW1116细胞中的表达。下调MAD2后,SW1116细胞的增殖能力较对照组有明显下降(P<0.05)。干扰siRNA组细胞凋亡比例较对照组增加,而细胞周期未见统计学差异。transwell实验中,siRNA干扰组穿膜细胞数为(45±2)个,显著低于阴性对照组[(185±5)个]和空白对照组[(195±5)个](P<0.01)。结论:SW1116高表达MAD2基因,沉默MAD2基因显著降低肠癌细胞增殖,诱导凋亡,并抑制细胞迁移。MAD2基因很可能成为新的预防结肠癌转移的目的基因。     

c-Met在结直肠癌细胞株中的表达及其配体肝细胞生长因子对SW480细胞株增殖和侵袭能力的影响

目的探讨c-Met在结直肠癌细胞株中的表达以及其配体肝细胞生长因子(HGF)对结肠癌SW480细胞系增殖、侵袭能力的影响。方法应用RT-PCR及Western blot技术检测HGF受体c-Met在不同结直肠癌细胞中的表达,筛选出c-Met高表达细胞系;用不同浓度(0、20、40、70 ng/m L)的HGF作用SW480细胞48 h,分别用MTT法、Transwell法检测其对SW480细胞增殖、侵袭能力的影响。结果 1 RT-PCR及Western blot检测结果均表明,c-Met在不同结直肠癌细胞系中均有表达,其中体外培养的结肠癌细胞系SW480中存在c-Met和蛋白高表达。2 MTT实验结果显示,HGF可增强SW480细胞的增殖能力,且在一定范围内随浓度增高作用增强,呈剂量依赖性关系。3 Transwell实验结果显示,HGF处理后的SW480细胞侵袭能力增强。结论 c-Met在结肠癌SW480细胞中存在高表达,HGF可促进结直肠癌细胞的增殖及增加其体外侵袭能力。     

TXNDC9在结肠直肠癌组织中的表达及其影响

目的:探讨TXNDC9基因在结肠直肠癌组织和细胞中的表达,以及沉默TXNDC9高表达后对细胞株SW1116增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法:分别应用免疫组织化学技术、免疫印迹法观察TXNDC9在结肠直肠癌组织和细胞中的表达水平:应用小干扰RNA瞬时转染TXNDC9高表达的结肠癌细胞株SW1116,用实时PCR筛选最高效率的干扰片段,并用Western印迹法检测基因沉默效果:最后研究瞬时转染后SW1116细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果:结肠直肠癌组织中TXNDC9的表达明显高于对照的癌旁正常组织(P<0.01),细胞迁移和侵袭能力亦有明显下降(P<0.01)。结论:TXNDC9在结肠直肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常黏膜上皮,并与肿瘤的大小和浸润深度相关,SW1116是TXNDC9基因高表达的细胞株之一,下调TXNDC9表达能显著抑制该细胞的增殖能力、细胞迁移和侵袭能力。TXNDC9基因对维持肿瘤细胞的增殖和运动能力有重要作用,并可能成为抑制肿瘤生长和转移的有效途径。     

SU5416对结肠癌生长和转移抑制作用的实验研究

目的研究血管生成抑制因子SU5416对结肠癌生长和转移的抑制作用.方法采用人结肠腺癌细胞株SW1116完整组织块裸鼠原位种植,建立类似于临床的结肠癌转移裸鼠模型.分别自腹腔注射生理盐水(对照组)、氟尿嘧啶(5Fu组)、SU5416制剂(SU5416组)、5Fu与SU5416联合应用(联用组),共用7周.种植后第8周处死动物,测量原位肿瘤瘤重、抑瘤率、肿瘤微血管密度(MVD)、结肠癌细胞凋亡指数(AI),观察肿瘤细胞腹膜、肝、其他脏器转移及腹水情况.结果对照组、5Fu组、SU5416组、联用组的原位肿瘤瘤重分别为(138±0.42)g、(0.71±0.26)g、(0.25±0.13)g、(0.16±0.09)g;抑瘤率分别为0、48.6%、81.9%、88.4%;MVD分别为134±4.9、11.7±4.2、2.6±1.4、0.94±0.5;AI分别为(3.59±2.46)%、(6.81±5.97)%、(12.83±4.56)%、(20.18±8.91)%;腹膜转移率分别为90.9%、46.5%、25.0%、0;肝转移率分别为72.7%、33.3%、16.7%、0.5Fu组、SU5416组、联用组分别与对照组相比,组间结肠癌生长和转移的抑制作用差异有显著性意义(P<0.05).结肠癌的生长和腹膜、肝转移受到明显抑制(P<0.05).结论SU5416通过抗肿瘤血管生成,诱导结肠癌细胞凋亡,对体内结肠癌生长和转移具有强烈的抑制作用,且与传统化疗药物联用可起协同作用.     

趋化因子受体CXCR4在结肠直肠癌中的表达及意义

目的：研究趋化因子受体CXCR4在结肠直肠癌中的表达及其临床意义。方法：采用RT-PCR法检测8种结肠直肠癌细胞株中CXCR4mRNA表达,应用蛋白印迹法检测细胞株中CXCR4蛋白表达。应用免疫组化染色法、结合组织芯片检测正常结肠直肠黏膜组织54例、结肠直肠癌组织49例中之CXCR4蛋白表达情况,并探讨其与结肠直肠癌临床病理特征的关系。结果：在8种结肠直肠癌细胞株中,CXCR4基因在HT29中表达水平最高。COL0205及SW480次之,HCTll6最低。CXCR4蛋白在结肠直肠癌组织中的表达高于结肠直肠正常黏膜组织,差异具有统计学意义（P=0．000）;在伴发转移的结肠直肠癌组织中,其表达比未发生转移者增强,差异具有统计学意义（P=0．024）。结论：CXCR4表达与结肠直肠癌转移存在密切关系,可能成为结肠直肠癌转移潜在治疗靶点。     

Polo样激酶1在结肠直肠癌组织中的表达及其在结肠直肠癌细胞增殖中的作用

目的：探讨Polo样激酶1（PLK1）在结肠直肠癌组织中的表达及体外RNA干扰抑制plk1对结肠直肠癌细胞增殖的影响。方法：应用免疫组化法测56例结肠直肠癌病人的癌组织和癌旁正常组织中PLK1及PCNA的表达;用Western印迹法测肠癌主要细胞株中PLK1的表达;针对plk1基因设计3条小干扰RNA片段,瞬时转染高表达结肠直肠癌细胞株,采用实时定量PCR及Western印迹法测转染后PLK1的基因及蛋白的表达水平;CCK-8法测细胞增殖能力。结果：结肠直肠癌组织中PLK1、PCNA的表达明显高于癌旁正常组织（P〈0.05）,两者的表达与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和浸润深度均有相关性（P〈0.05）,且两者间的表达呈正相关（P〈0.05）。Western印迹法筛选出SW1116细胞株PLK1表达最高,下调PLK1表达后,其增殖能力较对照组都有所下降（P〈0.05）。结论：PLK1在结肠直肠癌组织中呈过表达,可能在结肠直肠癌细胞增殖调节失衡中起重要作用,并进一步促进其迁移和浸润,其有望成为评估结肠直肠癌进展及预后的一个重要指标。     

结直肠癌表观沉默蛋白Bmi1与Notch信号通路调控的关系

目的 探讨人结直肠癌中表观沉默蛋白Bmi1和Notch1的蛋白表达与结直肠癌病理特征的关系,观察Notch通路对结直肠癌细胞增殖凋亡及Bmi1表达的影响。方法 应用免疫组织化学技术(SP法)检测85例结直肠癌组织及其邻近正常肠黏膜中Notch1及Bmi1的蛋白表达;将Notch1通路中γ-分泌酶抑制剂DAPT,作用于结肠癌SW480细胞株,运用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖状态;流式细胞仪观察其对细胞凋亡的影响,Western blot检测ICN及Bmi1蛋白的表达。结果 结直肠癌组织中Notch1和Bmi1蛋白表达的阳性率明显高于正常肠黏膜(P＜0.05),分别为61.2％ (52/85)对15.3％ (13/85)和56.5％ (48/85)对17.6％ (15/85);Bmi1表达率与Notch1表达率呈正相关(r =0.625,P＜0.01),并与肿瘤分化程度、分期及淋巴结转移有关(P＜0.05);阻断Notch1通路(DAPT)可抑制SW480细胞的增殖,诱导其凋亡,作用12、24、36 h后其增殖抑制率分别为13.1％、17.5及22.6％,而凋亡率为32.7％、45.6％及67.2％;同时Notch1胞内活性段ICN随作用时间延长而下降,而Bmi1表达水平也逐渐降低。结论 结直肠癌中Bmi1与Notch1表达密切相关,阻断Notch通路可抑制Bmi1表达,同时可抑制结肠癌细胞的增殖,促进其凋亡。     

裸鼠原位种植大肠癌肝转移三种建模方法的比较

目的 比较3种不同的人大肠癌裸鼠原位种植肝转移模型,建立稳定有效的人大肠癌裸鼠原位种植肝转移模型.方法 逐步传代法皮下成瘤传5代,采用84只BALB/C-nu/nu裸鼠,随机分为4组,结肠原位荷包缝合法和结肠原位纤维蛋白胶黏合法和结肠微注射1×106和1×105SW1116细胞法建立大肠癌裸鼠原位种植肝转移模型.各组裸鼠死亡后立即解剖观察原位以及肝脏、肺、脾脏、胰腺、肠系膜等脏器组织的转移并且进行苏木素-伊红(HE)染色进行镜下观察有无转移.结果 荷包缝合组和纤维蛋白胶组结肠原位种植肝转移成功率均为100%比微注射法50.0%和14.3%高,纤维蛋白胶法比其他两种方法所形成的结肠原位肿瘤和肝转移瘤均大而多.HE染色表明肝转移肿瘤性质与结肠原位种植瘤相同.结论 结肠原位纤维蛋白胶黏合法比较其他二种原位种植肝转移模型的手术成功率高,肝转移率高、操作简单.     

表观沉默蛋白Bmil在结直肠癌组织中的表达及其对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究人结直肠癌中表观沉默蛋白Bmil表达与结直肠癌病理特征的关系,探讨Bmil蛋白对结直肠癌细胞增殖凋亡的影响。方法应用免疫组织化学技术检测85例结直肠癌组织及其邻近正常肠黏膜中Bmil蛋白表达：用BmilsiRNA转染结肠癌细胞系SW480．运用MTY法检测细胞增殖状态：流式细胞仪观察其对细胞凋亡的影响．Westemblot检测Bmil及Bcl-2蛋白的表达。结果结直肠癌组织中Bmil蛋白表达的阳性率为56．5％（48／85）．明显高于正常肠黏膜[17．6％（15／85）]（P〈0．05）;其阳性表达与肿瘤分化程度、分期及淋巴结转移有关（P〈0．05）。SW480转染BmilsiRNA后,细胞增殖受到抑制,凋亡明显;转染24、48和72h后,其抑制率分别为13．1％、16．5％和18．3％．细胞凋亡率分别为15．7％、45．6％和40．2％：同时,Bmil表达水平在转染48h后下降,Bcl-2表达水平也降低（P〈0．01）。结论结直肠癌中Bmil表达与肿瘤病理学特征关系密切,阻断Bmil表达可抑制结肠癌细胞的增殖．促进其凋亡。