大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多表明细胞功能活跃。     

不同浓度血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的诱导效果比较

背景：血清成分复杂，其中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子，因此合适的血清浓度对于体外培养细胞的增殖和分化至关重要。目的：比较不同浓度的胎牛血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的影响。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007—03／10在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成。材料：纯系清洁级新生24h内的SD大鼠8只，用于制备骨骺干细胞。胎牛血清为Gibco公司产品。方法：免疫磁珠分离纯化FGFR-3阳性的骨骺干细胞，稳定传至第3代后，分别用含1．25％，2．5％，5％，10％胎牛血清的软骨诱导培养基进行干预，诱导14d。主要观察指标：BrdU．ELISA法检测细胞增殖活性。应用免疫荧光染色和RT—PCR法检测细胞Ⅱ型胶原的表达。结果：骨骺干细胞向软骨细胞诱导14d后，10％胎牛血清组细胞增殖活性显著高于1．25％，2．5％，5％胎牛血清组（P〈0．05）：10％胎牛血清组Ⅱ型胶原免疫荧光染色阳性程度及Ⅱ型胶原mRNA的表达均明显强于其他3组。结论：含10％胎牛血清的软骨诱导液更有利于骨骺干细胞向软骨细胞方向分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景:目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少.目的:采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点.方法:全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化.结果与结论:培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性.扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃.     

微载体技术培养人骨髓间充质干细胞的成骨诱导实验

目的：以微载体技术成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞，建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法：实验于2002—12／2003—08在第三军医大学西南医院中心实验室完成。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞采用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养，观察细胞增殖情况，作出生长曲线。分别于培养的第2，4，6，8，10，12，14d检测诱导细胞的碱性磷酸酶活性，并与普通成骨诱导方法进行对比。最后进行细胞碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原、骨钙素的免疫组织化学染色，观察培养细胞的成骨细胞表型的表达。结果：微载体法接种24h后约87％的人骨髓间充质干细胞贴附于微载体并铺展，3d后生长加速，约10～11d后细胞生长达最大值，最终细胞收获密度为接种时的约15～20倍。诱导细胞的碱性磷酸酶活性在培养的第12天达最大值，并表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素等成骨细胞表型。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论：应用微载体可以成功进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导扩增，可以满足骨组织工程量和质的需要。     

密度梯度离心法结合贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的：建立一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法，观察成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。 方法：实验于2003-03／2004-05于哈尔滨医科大学组胚教研室完成。①、用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞。②采用倒置显微镜、透射电镜观察，免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。③体外加成骨、成软骨诱导剂，14d分别做碱性磷酸酶组织化学、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察骨髓间充质干细胞的成骨分化及成软骨分化结果。 结果：①成年大鼠骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样。具有一般干细胞的超微结构特点。②广泛表达Vimentin，CD29，CD44，不表达CD14，CD34。③加入成骨诱导剂14d后，骨髓间充质干细胞呈多层重叠生长，现碱性磷酸酶强阳性，阳性率为90．5％。④经成软骨诱导后，Ⅱ型胶原免疫组化染色。诱导14d的骨髓间充质干细胞呈现广泛的棕褐色染色，在细胞密集处细胞周围可见黄褐色染色。 结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞，用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。     

大鼠骨髓基质干细胞的培养鉴定及向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的研究体外培养大鼠骨髓基质于细胞的方法及其生长特点和成骨能力。方法通过贴壁培养法和密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞，应用含维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化，检测碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。结果原代培养基质干细胞首先形成细胞集落，14d时集落间接近融合；传代细胞体积变大，约5～7d传代一次。诱导条件下，细胞碱性磷酸酶活性明显增高，并出现了矿化结节。结论骨髓基质干细胞易于体外分离培养及扩增，成骨能力较强，可作为骨组织工程的种子细胞。     

骨骺软骨细胞的培养和保存方法

目的：建立大量生产骨骺软骨细胞的培养方法和保存方法，为组织工程骺软骨的培养提供种子细胞。方法：2周龄兔胫骨上端骨骺软骨经机械剪切和化学消化后，接种、培养及液氮冻存。通过显微镜观察其生物学表现，并通过蕃红花“0”染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色对其生物学特征进行鉴定。结果：在体外观察到了骨骺软骨细胞从静止、增殖到肥大这个近似体内的生长过程，经多次传代后增殖能力降低，经过冻存的细胞生物学特征不变。蕃红花“0”和Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论：我们成功地建立了骨骺软骨细胞的培养和冻存方法，并证明培养出的细胞是骨骺软骨细胞。     

原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞

背景：髓核细胞在体外培养过程中存在表型丢失问题,包括Ⅱ型胶原、aggrecan、Sox-9等表达的下降,由类软骨细胞向类纤维样细胞转化。目的：体外原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞。方法：经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar大鼠椎间盘髓核组织,第1,2代细胞传代时采用差速贴壁法分离纯化髓核细胞。结果与结论：分离纯化后的第3代髓核细胞呈圆形或多角形,活力强,苏木精-伊红染色细胞核染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性细胞比例为97%;aggrecan免疫组织化学染色阳性细胞比例为95%;扫描电镜可见细胞内有高尔基体、粗面内质网和游离核糖体,未见线粒体,可见少量板层小体;CCK-8生长曲线显示细胞经过2d的生长潜伏期,3d的指数生长期,进入生长停滞期。说明原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致。     

血管内皮生长因子基因转染促进成骨细胞的成骨活性

背景：外源性的血管内皮生长因子能使体外培养的成骨细胞碱性磷酸酶活性及环磷酸腺苷浓度提高4倍，但外源性血管内皮生长因子基因转染对成骨细胞成骨活性影响如何?目的：了解外源性血管内皮生长因子基因转染及表达对成骨细胞成骨活性的影响。设计：随机对照实验。单位：四川大学华西医院移植免疫实验室。对象：新生两三天雄性SD大鼠颅骨成骨细胞。方法：实验于2003-04／12在四川大学华西医院移植免疫实验室完成。分离培养大鼠颅骨成骨细胞用碱性磷酸酶染色鉴定。①用阳离子脂质体转染将pBLAST49-mVEGF基因导入体外培养的成骨细胞为基因转染组。②未转染组加入杀稻瘟菌素为对照。③将转染成功和未转染的成骨细胞进行同步传代培养共5代，对每代细胞进行血管内皮生长因子和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色检查和骨钙素的测定。主要观察指标：①观察外源性血管内皮生长因子在成骨细胞内的表达。②对成骨细胞合成分泌骨钙素及Ⅰ型胶原的影响。结果：pBLAST49-mVEGF基因转染组第1～5代细胞合成分泌骨钙素浓度和Ⅰ型胶原的表达均明显高于对照组，二者间比较差异具有显著性(P&;lt;0．05)。结论：pBLAST49-mVEGF质粒转染成功后，成骨细胞合成Ⅰ型胶原明显增强。与对照组相比，通过Mias图像分析，与未转染的对照组比较差异具有显著性，表明pBLAST49-mVEGF质粒转染能明显增加成骨细胞生成骨钙素以及合成Ⅰ型胶原的能力。     

缺氧大鼠成骨细胞增殖、分化及基因表达

背景：研究表明,低氧会引起骨折延迟愈合或不愈合,骨密度减低,使骨质疏松、骨折等疾病的发病率升高。成骨细胞是骨形成、生长和发育主要的功能细胞。目的：观察缺氧对体外培养成骨细胞增殖、分化及基因表达的影响。方法：选用新生Wistar大鼠颅盖骨,使用胰酶-胶原酶序贯消化法获取成骨细胞,进行体外传代培养及鉴定。在缺氧培养下应用MTT法测定成骨细胞增殖率,对硝基苯磷酸盐法测定成骨细胞碱性磷酸酶活性,反转录-聚合酶链反应法测定成骨细胞内骨钙素及Ⅰ型胶原的表达。结果与结论：缺氧具有抑制成骨细胞增殖,降低碱性磷酸酶活性及下调大鼠成骨细胞中Ⅰ型胶原α1、骨钙素基因表达的作用,随缺氧时间的增加作用更加明显。提示缺氧可通过抑制成骨细胞增殖、分化成熟及下调Ⅰ型胶原α1、骨钙素基因表达而降低成骨能力,从而促进骨质疏松的发生。     

造血干细胞研究发展历史引发的思考

本文简要地回顾了世界干细胞研究数十年的历史经过.它的原始研究是为了解决二次大战末在日本两次核爆炸中所见的致死性造血损伤,这也说明世界干细胞研究为什么从造血干细胞开始,而且人们长期不关心非造血干细胞在体内是否存在.20世纪50-60年代一些聪明设计的动物实验有力地暗示造血干细胞在体内的存在,动物研究又证实正常骨髓可以修复已严重破坏的骨髓,于是人们开始相信骨髓移植就是造血干细胞移植.培养造血祖细胞集落的陆续发现证明造血祖细胞的存在.直至上世纪90年代,有了NOD-SCID或羊胎等体内检测造血干细胞的可靠方法之后,才划清了造血干细胞和祖细胞的界限.本文列举了许多实例,说明实验血液学和临床血液学发展的互动性,以及其它生物学和技术的进步,尤其是免疫学和分子生物学的进步,极大地推动了干细胞基础研究和临床干细胞移植的发展.比如HLA、单克隆抗体、DNA分子克隆、基因重组工程技术以及近年发展的生物信息学、基因组学、蛋白质组学、干涉RNA、干细胞工程技术等,使干细胞基础和临床研究进入了21世纪的新时代.免疫治疗、间充质干细胞和干细胞工程的发展,结合用于造血干细胞移植,使细胞治疗多元化成为本世纪发展的新动向.本文着重地介绍了干细胞研究的每一步发展都同时出现认识上的误区,以及给干细胞研究带来了挫折.一个误区的澄清常常历时20甚至40多年之久.例如造血干细胞与祖细胞的区分;造血干细胞体外扩增研究在世界各国注定的失败;移植脐血缺乏的是造血干细胞,还是祖细胞;多数白血病是否起病于造血干细胞;以造血干细胞是否是基因治疗中最佳的外源基因载体;又如干细胞工程能否克隆实质脏器等等.在成体组织内存在成体干细胞是21世纪划时代的伟大发现,却也带来了误区和风波.本文重点分析了在成体干细胞发现的同时为什么会出现横向分化、去分化等缺乏科学根据的假说,以及部分同行视线混乱的根源与教训.文章指出误区的发生是由于缺乏实践和认识的片面性造成的,科学实践是检验和纠正认识片面性的唯一途径.整个干细胞研究的发展历史正是一个不断纠正认识误区的过程,也是必由之路.     

胚胎干细胞的研究进展

胚胎干细胞（ESC）是来源于哺乳动物早期胚胎的内细胞团中的一种二倍体细胞,具有发育的全能性。ESC的体内和体外分化在分子水平有许多相似之处。在现有培养条件下。小鼠ESC体外分化的细胞类型或结构主要有4种：内皮细胞与血管,肌细胞和心肌、造血细胞和神经细胞,最近的研究提示;造血干细胞（HSC）来源于胚胎内的特定区域,HSC的产生可能受尚未发现的胚胎生长因子调节。ESC为从胚胎着手明确早期造血过程提供了方便有效的实验途径。人ESC的研究及应用尚面临一系列伦理问题,对ESC的研究具有广阔的应用前景。     

低氧对间充质干细胞的影响

氧对于几乎所有的生命都是必需的,它维持能量代谢及细胞的功能,但机体多种细胞是处于生理或病理性低氧状态中,而体外细胞实验一般是在20%氧浓度下进行,并不符合生理状态。直到最近,关于低氧对于间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）的影响有了一系列的研究。体外实验表明,适度低氧下MSC的生长和存活能力更好,氧浓度可以影响MSC向成骨、成软骨、成脂的分化倾向,低氧能提高特异性受体和配体相结合所介导的迁移。低氧可影响胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞的生理学特性也是一证据。干细胞对缺氧反应的分子机制主要涉及低氧诱导因子-1（hypoxic inducible factor-1,HIF-1）信号通路。本文综述了低氧对MSC的存活、增殖、分化和迁移的影响,以及涉及HIF-1等的分子机制。     

A novel filtration system for point of care washing of cellular therapy products

The cell therapy industry would greatly benefit from a simple point of care solution to remove dimethylsulphoxide (DMSO) from small‐volume thawed cell suspensions before injection. A novel dead‐end filtration device has been designed and validated, which takes advantage of the higher density of thawed cell suspensions to remove the DMSO and protein impurities from the cell suspension without fouling the filter membrane. The filter was designed to avoid fluid circuits and minimize the surface area that is contacted by the cell suspension, thus reducing cell losses by design. The filtration process was established through optimization of the fluid flow configuration, backflush cycles and filter geometry. Overall, this novel filtration device allows for a 1 ml of thawed cryopreserved cell suspensions, containing 10⁷ cells of a fetal lung fibroblast cell line (MRC‐5), to be washed in less than 30 min. More than 95% of the DMSO and up to 94% of the albumin–fluorescein–isothiocyanate content can be removed while the viable cell recovery is higher than 80%. It is also demonstrated that this system can be used for bone marrow‐derived human mesenchymal stem cells with more than 73% cell recovery and 85% DMSO reduction. This is the first time that a dead end (normal) filtration process has been used to successfully wash high‐density human cell suspensions. In practice, this novel solid–liquid separation technology fills the need for small‐volume washing in closed processing systems for cellular therapies. Copyright © 2016 John Wiley & Sons, Ltd.     

血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤12例临床分析

为了探讨血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)的临床、病理特征及预后情况,回顾性分析了经病理检查证实的12例AITL患者的临床特点、病理形态及免疫表型、治疗和生存情况。结果表明:12例患者主要症状为全身淋巴结肿大,9例伴有发热等全身症状。确诊依据淋巴结活检,病理组织学呈现淋巴结结构破坏,免疫母细胞增生,树枝状血管增生的特点,免疫表型全部为成熟外周T细胞性。12例患者均用CVP为主的化疗方案,总有效率58%。3年生存率为25%,全组中位生存25个月。结论:AITL临床过程呈侵袭性,进展快,中位生存期短,预后差,应探索更为有效的治疗方案。     

维甲酸诱导HL—60细胞分化与细胞周期的关系

研究全反式维甲酸（RA）在体外诱导人髓系白血病细胞系（HL-60）分化过程中细胞周期的改变。利用流式细胞术动态测定RA在体外诱导HL-60细胞分化过程中细胞周期的改变。结果发现：（1）在RA与IL-60细胞共培养48小时内，S G2/M期比例无明显变化，但S期细胞的比例改变与RA的浓度有关，在10^-6 mol/L RA浓度S期细胞比例先出现一过性升高，继而持续下降，在10^-5 mol/L浓度S期细胞比例表现为持续性下降；（2）重培养试验证明：S G2/M和S期细胞比例的下降与成熟分化细胞的增加相一致；（3）RA诱导HL-60细胞成熟分化并不是在一个时间点上同时进入分化状态，而一量细胞开始进入成熟分化，即使在无RA存在的情况下，细胞仍能分化至成熟。结论提示：RA与HL-60细胞必须相互作用一定时间后才能触发细胞成熟分化，S期细胞的比例改变与RA药浓度有关，一量细胞开妈进入成熟分化，即使在无RA存在的情况下，细胞仍能分化至成熟。     

朗格汉斯细胞源性肿瘤研究进展

朗格汉斯细胞肿瘤是一类起源于朗格汉斯细胞(LC)并保持其特定表型谱及超微结构特征的肿瘤,根据细胞形态学、免疫组化和超微结构特征,主要分为2个亚类:朗格汉斯组织细胞增生症(LCH)和朗格汉斯细胞肉瘤(LCS)。LCH是一种LC的良性克隆增殖性疾病,而LCS则是一种极其罕见的以LC恶性增殖及播散为主要特征的恶性肿瘤,被认为是LCH的高级别恶性型。两者均可累及全身各组织器官,临床表现复杂多样,程度不同。诊断主要依靠病理组织细胞形态学及免疫组织化学,必要时电子显微镜辅助诊断。治疗方面包括手术切除、放化疗、免疫治疗及造血干细胞移植等,目前尚缺乏公认最优治疗方案,治疗需个体化。LCH预后主要与受损器官数目有关,而LCS侵袭性强,进展迅速,总体预后差。本文分别就LCH和LCS的发病机制、临床表现、诊断、治疗及预后等方面进行综述。     

丙戊酸钠抑制HL-60细胞增殖并诱导其凋亡与分化

为进一步研究丙戊酸钠(sodium valproate;VPA)对白血病细胞HL-60的增殖、凋亡和分化的影响,采用MTT法检测不同浓度的VPA对HL-60细胞增殖的作用;细胞化学染色法观察药物作用后细胞形态的变化;NBT还原实验结合形态学作为观测细胞分化指标;应用流式细胞术检测不同浓度药物作用后细胞周期的变化及凋亡细胞的比例。结果显示:VPA能明显抑制HL-60的增殖;经2mmol/L VPA处理24-48小时后,HL-60出现胞浆空泡、核固缩、核碎裂及凋亡小体;Annexin V阳性的早期凋亡细胞比例由2.9%升高到17.1%;流式细胞术检测出明显的亚二倍体峰;G1期细胞由51.1%增加至84.6%,S期细胞由37.9%减低至14.4%。0.25mmol/L VPA作用1周后,促进HL-60细胞向中幼粒、晚幼粒阶段分化,NBT阳性细胞百分率为(47±2)%。结论:VPA能明显抑制白血病细胞HL-60的增殖,并诱导其分化及凋亡。     

CAG方案对HL-60细胞及耐药株作用机理的研究

目的研究小剂量阿糖胞苷和阿克拉霉素联合G-CSF（CAG方案）对HL-60细胞及其耐药株HL-60／A的作用机理。方法以白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60／A为实验模型，模拟临床给药方式，体外加入Ara-C、ACR、G-CSF三药，作用24、48小时后收集细胞，分别进行细胞计数，细胞形态观察，MTr法检测不同药物对两种细胞株的生长抑制率，流式细胞仪检测细胞早期凋亡标记Anncxin V，细胞分化抗原CD11h以及进行细胞周期分析。结果经CAG作用48h后，两种细胞株数量明显减少，形态显示凋亡小体增多；早期凋亡标记Annexin V明显增高，CD11b表达轻度升高，与CA组比较，结果有显著差异（P〈0．05）。细胞周期分析显示，CAG作用24h后，与CA组比较，S期细胞比例增高（P〈0．05）；48h后比例下降，结果未见明显差异（P〉0．05）。HL-60细胞与HL-60／A细胞比较，两种白血病细胞株经CAG作用48h后，在细胞数量、细胞形态、凋亡细胞比例、CD11b表达及S期细胞比例的改变方面未见明显差异。结论CAG方案对白血病细胞株HL-60、HL-60／A的作用机制主要是通过GCSF促使白血病细胞进入细胞周期S期，增加小剂量Ara-C、ACR对自血病细胞的细胞毒性，以诱导细胞凋亡为主，轻度诱导分化。     

六亚甲基二乙酰胺诱导HL-60细胞分化及其分子机制的研究

本研究探讨六亚甲基二乙酰胺（HMBA）对髓系白血病HL-60细胞分化的作用及其分子机制。应用MTT比色法观察不同浓度HMBA在不同时间点对细胞增殖的抑制作用，采用Wright—Giemsa染色观察细胞形态学变化，运用流式细胞仪测定细胞分化抗原CD11b的表达，并进行细胞周期分析，半定量RT—PCR分析c-myc、mad1、p21、p27、hTERT、HDAC1基因mRNA的表达。结果表明：HL-60细胞经不同浓度（0．5、1、2mmol/L）HMBA处理后细胞增殖受到较明显的抑制，并随时间延长、剂量增大抑制作用明显增强。HL-60细胞经2mmol／L HMBA处理后，细胞形态学上趋于分化成熟，细胞停滞于G0／G1期；CD11b表达显著增高；c-myc、hTERT mRNA表达显著下调，mad1、p21、p27mRNA表达显著上调，而HDAC1 mRNA表达无明显变化。结论：HMBA能诱导HL-60细胞分化，其分子机制可能是通过调节c-myc／mad1开关引起p21、p27上调，并且下调hTERT mRNA表达，与HDAC1活性抑制无关。