外周听觉改变致听皮质突触N-甲基D-天冬氨酸受体亚基表达变化

目的观察听觉剥夺后重塑模型中听皮质突触N-甲基D-天冬氨酸受体亚基(N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B,NR2B)表达变化。方法采用清洁级SD大鼠90只,分成听觉剥夺组、听觉剥夺后重塑组及对照组,Optiprep沉降梯度超速离心从初级听皮质提取高度纯化的突触体后,采用Western blotting蛋白质印迹检测技术对生后听觉剥夺14天组、28天组、42天组、听觉剥夺7天后再给予纯声暴露的各实验组听皮质突触体NR2B表达进行比较。结果听觉剥夺使生后14天组和28天组动物听皮层NR2B表达水平明显下降(P<0.05),听觉剥夺7天后再给予纯声暴露则又使NR2B表达水平明显提高(P<0.05),呈现双向调节趋势。听觉剥夺和纯声暴露对生后42天组成熟大鼠听皮层NR2B表达不再产生明显调节作用(P>0.05)。结论在大鼠生后发育关键期,听觉剥夺、可改变听皮层NMDA受体NR2B蛋白表达水平;为研究感觉功能发育可塑性机制提供了重要实验资料。     

隔声后听觉重塑模型中听皮质突触NR2A表达的变化

目的：观察隔声后听觉重塑模型中听皮质突触N甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚基NR2A表达的变化。方法：采用清洁级SD大鼠45只,分成隔声组、隔声后听觉重塑组及对照组各15只,Optiprep沉降梯度超速离心从初级听皮质提取高度纯化的突触体后,采用Western blotting蛋白质印迹检测技术对生后隔声14d组、28d组、42d组、隔声7d后再给予纯音暴露的各实验组听皮质突触体NR2A表达进行比较。结果：隔声使生后14d组和28d组动物听皮层NR2A表达水平明显下降（P〈0．05）,隔声7d后再给予纯音暴露则又使NR2A表达水平明显提高（P〈0．05）,呈现双向调节趋势。隔声和纯音暴露对生后42d组成熟大鼠听皮层NR2A表达不再产生明显调节作用（P〉0．05）。结论：在大鼠生后发育关键期,听觉经验可改变听皮层NMDA受体NR2A蛋白表达水平。研究结果为研究感觉功能发育可塑性的机制提供了重要的实验资料。     

听觉剥夺及耳蜗内电刺激幼鼠听皮层和下丘核CREB 和 NMDAR1蛋白表达变化

目的：观察耳聋幼鼠及其耳聋后单耳植入电极电刺激后幼鼠听皮层和下丘核环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cyclic AMP response element － binding protein ,CREB）和N －甲基－D－天冬氨酸受体－1（N －methyl－D－aspartic acid receptor one ,NMDAR1）表达水平的变化。方法将66只12天龄SD幼鼠随机分为2大组,分别为耳聋造模后4周组（33只）及耳聋造模后6周组（33只）。将耳聋造模后4周组再分为对照1组、耳聋造模后4周组（4周组）及耳聋造模后3周耳蜗内电刺激组1（刺激时间为1周,简称“电刺激1组”）,每组11只大鼠;将耳聋造模后6周组再分为对照2组、耳聋造模后6周组（6周组）及耳聋造模后5周耳蜗内电刺激组2（刺激时间为1周,简称“电刺激2组”）,每组11只大鼠;对照1、2组均正常饲养。除对照1、2组外,在其余4组幼鼠颈背部、两侧下腹部皮下注射庆大霉素（总量为350 mg／kg ）,半小时后于相同部位注射呋塞米（总量为200 mg／kg ）,两周后行ABR检测,于耳聋造模成功后第3、5周分别对电刺激1、2组的幼鼠植入电极,在耳蜗内进行电刺激,每天3小时,持续7天。于耳聋造模后4、6周分别处死4、6周组大鼠取听皮层和下丘组织,通过免疫组织化学方法,观察CREB和NMDAR1表达水平的变化。结果耳聋造模成功后幼鼠ABR阈值均大于93 dB SPL ,4周组听皮层、下丘CREB和NMDAR1的表达较对照1组增加,电刺激1组CREB和NMDAR1的表达较4周组增加。6周组听皮层和下丘CREB和NMDAR1的表达较对照2组下降,电刺激2组CREB和NMDAR1的表达较6周组增加。结论听觉剥夺可导致幼鼠听皮层和下丘CREB和NMDAR1早期表达增加而晚期表达下降。耳蜗植入电极电刺激可导致幼鼠听皮层和下丘CREB和NMDAR1的表达增加,反映这两个部位神经元的可塑性变化。     

单侧听觉剥夺对听觉发育关键期小鼠内耳的影响北大核心CSCD

目的 研究单侧听觉剥夺对听觉发育关键期小鼠内耳的影响。方法 将22只出生后12天的C57BL/6小鼠随机分为正常对照组和听觉剥夺组。对听觉剥夺组进行单侧听觉剥夺,2周后解除剥夺。对正常对照组小鼠和听觉剥夺组小鼠双耳采用听性脑干反应(ABR)评估听功能,并通过免疫荧光染色对毛细胞、带状突触、螺旋神经节进行形态学观察。统计学分析听觉剥夺组小鼠的剥夺耳、未剥夺耳和正常对照小鼠在听功能和耳蜗形态学方面的差异。结果 1)听觉剥夺2周后,听觉剥夺组的剥夺耳ABR高频阈值升高,Ⅰ波潜伏期延长,与对照组小鼠相比差异有统计学意义;2)听觉剥夺组的未剥夺耳与正常对照组间ABR阈值和Ⅰ波潜伏期差异无明显差异;3)免疫荧光染色结果示听觉剥夺耳和未剥夺耳的毛细胞形态和数量未见异常;4)和对照组相比,听觉剥夺组的剥夺耳出现了带状突触数量减少,未剥夺耳与对照组之间的带状突触数量未见统计学差异,没有出现代偿性增加。结论 单侧听觉剥夺可导致听觉发育关键期小鼠剥夺耳的听功能及带状突触异常。     

听觉剥夺和耳蜗内电刺激引起幼鼠听觉通路bdnf和c-fos基因及蛋白改变

目的 观察耳聋幼鼠及耳聋后单耳植入电极电刺激后,其听皮层和下丘、耳蜗核三个部位的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, bdnf)、c-fos基因、蛋白表达水平的变化情况。方法 将66只SD幼鼠随机分为6组,每组11只,分别为注射药物后耳聋4周组(A1组)及对照组(A2组),耳聋6周组(B1组)和及对照组(B2组),注射药物后3周接受耳蜗内电刺激组(C组),5周接受耳蜗内电刺激组(刺激时间为1周,D组)。于幼鼠颈背部、两侧下腹部皮下注射庆大霉素(总量为350mg/kg),0.5h后于相同部位注射呋塞米(总量为200mg/kg)。分别于注射药物后不同时间取听皮层、下丘及耳蜗核三个部位的组织行实时荧光定量PCR及免疫组织化学方法,观察bdnf及c-fos基因及蛋白表达的变化。结果 A1组在听皮层、下丘及耳蜗核部位的bdnf及c-fos基因及蛋白表达均较A2组上升,较C组下降(P＜0.05)。B1组在听皮层、下丘及耳蜗核部位bdnf及c-fos基因及蛋白表达均较B2组和D组下降(P＜0.05)。各组之间的差异均有统计学意义。结论 听觉剥夺可导致幼鼠听皮层、下丘和耳蜗核部位的bdnf及c-fos基因及蛋白早期表达增多,而晚期表达下降。耳蜗植入电极电刺激可导致幼鼠听皮层、下丘和耳蜗核部位的bdnf及c fos基因及蛋白表达增多。bdnf及c-fos基因及蛋白表达的动态变化反映三个部位的可塑性变化。     

耳蜗电刺激对听觉剥夺幼鼠学习记忆能力的实验研究

目的 建立听力障碍和耳蜗电刺激模型,探讨听力障碍及耳蜗电刺激对幼鼠认知功能的影响.方法 选用健康SD幼鼠随机分成4组:①听觉剥夺组(auditory deprivation,AD);②听觉剥夺+早期耳蜗电刺激组(early intracochlear electrical stimulation,ICES1);③听觉剥夺+晚期耳蜗电刺激组(late intracochlearelectrical stimulation,ICES2);④对照组(normal control,NC).AD组、ICES1组、ICES2组在出生后第7天开始用阿米卡星500 mg/kg.d皮下注射,直到出生后第16天.对听觉剥夺的幼鼠分别于生后3周龄(早期干预组,ICES1)和生后7周龄(晚期干预组,ICES2)进行电刺激,持续3小时/天,共1周.然后对各组进行行为学检测,并与同龄对照组比较.结果 Morris水迷宫实验结果①定位航行试验:早期耳蜗电刺激组(ICES1组)逃避潜伏期于训练后第3天及第4天逐渐达正常水平(与对照组比较,P值均＞0.05),明显短于听觉剥夺组(P值均<0.05);晚期耳蜗电刺激组(ICES2)每日逃避潜伏期虽较听觉剥夺组稍有缩短,但与正常组比较,仍明显延长(均为P<0.05).②空间探索实验:早期电刺激组幼鼠在平台象限的游泳时间明显长于听觉剥夺组,穿越平台的次数较听觉剥夺组明显增多(P<0.05),达同龄正常对照组水平.而晚期电刺激组幼鼠在平台象限的游泳时间、穿越平台的次数与听觉剥夺组比较无统计学意义(P>0.05).结论 听力丧失后学习和记忆能力受损,早期耳蜗电刺激可以改善听力障碍幼鼠的学习记忆能力.     

双侧耳蜗毁损后大鼠听皮层突触素表达的变化

目的观察双侧耳蜗毁损后大鼠听皮层(auditory cortex,AC)突触素表达水平的变化。方法30只SD大鼠随机均分为6组:双侧耳蜗毁损后3、7、14、21、30天组及假手术对照组,每组各5只。双侧耳蜗毁损后不同时间行听皮层突触素二步法免疫组化染色,观察突触素表达的变化。结果双侧耳蜗毁损后3天突触素表达增高,毁损后7天突触素表达较毁损后3天有所下降,毁损后14、21天突触素表达持续上升,21天时上升到最高峰,毁损后30天突触素表达开始下降,除毁损后7天组外,其余各组与假手术对照组差异均有统计学意义。各组左右耳表达差异均无统计学意义。结论大鼠双侧耳蜗去传入损伤后,突触素表达的动态变化反映了听皮层内神经元突触的重塑情况。     

大鼠耳蜗发育过程中突触素的表达差异

目的 研究大鼠耳蜗发育过程中突触素(synaptophysin,SYN)的表达差异,探讨SYN表达与听觉功能发育成熟的关系及耳蜗中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的来源.方法 选取健康SD大鼠25只,按出生后天数将其分为出生后1、5、10、14、28天组(即:P1、P5、P10、P14和P28组),每组5只,运用免疫组化的方法比较各组大鼠耳蜗中SYN的表达差异.结果 P1、P5和P10组大鼠顶回的Corti器、Kolliker器未发现SYN表达;P10组底回及蜗管中段、P14组和P28组Corti器的内、外螺旋束、Deiters细胞内侧缘有特异性表达;各组大鼠耳蜗螺旋神经元(spiral ganglion neuron,SGN)胞浆中均有SYN表达.结论 大鼠耳蜗发育过程中SYN的表达存在差异,这种差异有利于神经末梢和靶细胞间构型建立,对听觉系统发育中形成正确的听觉信息编码可能起着关键作用.毛细胞、支持细胞中的ATP可能以非囊泡或以非SYN特异性染色的囊泡形式储存.     

c-fos及NR2A在耳鸣大鼠听皮层中的表达

目的通过检测神经元功能可塑性标记物快反应基因c-fos和N-甲基-D-天门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）亚型NR2A在耳鸣大鼠听皮层中的表达探讨听皮层的可塑性变化及其在耳鸣产生中所起的作用.方法将30只白色Wistar大鼠随机分为3组,耳鸣模型组（12只）、生理盐水组（12只）和空白对照组（6只）.注射水杨酸钠造模并用行为学方法证实动物感受到耳鸣后,利用免疫组化技术检测动物听皮层中c-fos和NR2A的表达,并用数字图像分析系统进行分析.结果12只注射水杨酸钠的耳鸣模型组大鼠全部造模成功.c-fos基因的表达产物FOS蛋白主要存在于皮层神经元的胞核,其阳性细胞的数量及所占面积的百分比在耳鸣组显著高于对照组（P值均＜0.01）;NR2A受体主要表达在锥形细胞的胞膜上,其阳性细胞的数量、染色强度和面积百分比均显著强于对照组（P值均＜0.01）.结论耳鸣大鼠听皮层中c-fos和NR2A的表达明显增多,一方面表明神经递质及受体可能参与了耳鸣的发生;另一方面提示耳鸣大鼠听皮层中发生了功能可塑性改变,这种改变可能在耳鸣的发生发展中起重要作用.     

老年性聋小鼠耳蜗带状突触损伤特点及机制研究

目的研究老年性聋耳蜗带状突触数量在耳蜗各回的变化特点及其可能机制的研究。方法根据年龄将C57BL/6J小鼠分为1月龄组和12月龄组(每组12只),听性脑干反应(Auditory Brain Response, ABR)检测两组小鼠听功能,免疫组织化学染色检测两组小鼠耳蜗带状突触数量,Western blot检测两组小鼠耳蜗Ucp2蛋白的表达。结果和1月龄小鼠相比较,12月龄小鼠ABR阈值在8kHz显著升高(t=12.226, P<0.01),在16kHz和32kHz阈值均超过90dB SPL;12月龄小鼠在90dB SPL声强下ABR I波幅值在8kHz显著降低(t=5.102, P<0.01);12月龄小鼠耳蜗带状突触数量在耳蜗顶回(t=10.230, P<0.01)、中回(t=3.386, P<0.05)和底回(t=17.076, P<0.01)均显著减少,其中耳蜗底回数量减少最明显;12月龄小鼠耳蜗Ucp2蛋白水平显著增加(t=11.429, P<0.01)。结论在小鼠老化的过程中,耳蜗底回的带状突触最容易损伤丢失,其次是耳蜗顶回和中回,线粒体Ucp2可能在耳蜗带状突触损伤过程中起到重要作用。     

Postnatal Development of NR2A and NR2B mRNA Expression in Rat Auditory Cortex and Thalamus

Sensory cortex in the rat undergoes rapid postnatal development, especially following the onset of sensory function during so-called "critical periods." To investigate potential mechanisms in the auditory forebrain involving different NMDA receptor subunits, we have used in situ hybridization to determine expression patterns of NR2A and NR2B mRNA at postnatal days 4, 10, 13, 18, 25, and adult. In auditory cortex, NR2A mRNA expression is initially weak but increases rapidly over ~2 weeks. NR2B mRNA levels are initially high and remain high. For both subunits, expression tends to be highest in superficial layers of the cortex (except layer 1). Expression is weaker in the auditory thalamus (medial geniculate). Initially, NR2A mRNA expression is very low, whereas NR2B mRNA expression is moderate; both levels increase over ~2 weeks. Among medial geniculate subdivisions, NR2A mRNA expression occurs preferentially in the medial division, whereas NR2B mRNA expression is strongest in the ventral division. For auditory cortex and thalamus, NR2A and NR2B mRNA expression peaks about 1 week after the onset of hearing before declining slightly into adulthood. The heterogeneous distribution of NMDAR subunit mRNA throughout development may play a role in auditory forebrain development and function.     

Synapses on human spiral ganglion cells: a transmission electron microscopy and immunohistochemical study

Impact of early post-natal deafening on auditory pathways was investigated in newborn rats deafened by daily amikacin injections from P7 to P16 inducing a complete destruction of the organ of Corti. The expression of mRNAs encoding N-methyl-D-aspartate (NMDA), alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole (AMPA) and gamma-aminobutyric acid type A (GABA(A)) receptor subunits was then studied by in situ hybridization in the dorsal and ventral cochlear nucleus and in the central nucleus of the inferior colliculus (CNIC). Early post-natal deafening decreased bilaterally the expression of mRNAs encoding NR1, NR2a, NR2b and flop isoforms of AMPA receptors. On the contrary, it increased the expression of mRNAs encoding some GABA(A) subunits (alpha1, beta1, gamma2) and flip isoforms of AMPA receptors. These changes were more pronounced in cochlear nuclei than in CNIC. They suggest that auditory sensation is essential in the normal development of central auditory pathways.     

耳鸣大鼠NMDA受体亚型1、2A、2B的表达研究

目的研究耳鸣大鼠听皮层NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸,N-methyl-D-aspartate）受体亚型1、2A、2B（NR1、NR2A、NR2B）的表达变化,从而推测其在耳鸣的发生中可能的作用机制。方法按照随机化原则将动物分成3组,每组9只：A组为耳鸣模型组、B组为生理盐水组、C组为空白对照组。A组通过腹腔注射水杨酸钠并用食物抑制法进行验证。造模成功后运用核酸荧光染料SYBR Green实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应）方法检测NMDA受体三种亚型的表达情况。结果NR1在A组的表达显著低于C组（P〈0.05）,NR2A在A组的表达则显著高于C组（P〈0.05）,而A、C两组之间NR2B的表达差异比较无统计学意义（P〉0.05）。NMDA受体三种亚型B、C两组之间表达差异比较均无统计学意义（P〉0.05）。A组NR2A、NR2B与NR1表达量的比值较C组均增大。结论耳鸣大鼠听皮层NMDA受体调节亚基的调控作用增大,突触局部受体蛋白质合成改变,听皮层发生了与NMDA受体相关的可塑性变化,这可能是耳鸣产生的机制之一。     

豚鼠脑缺血再灌注后听皮层内质网应激相关因子的表达及意义

目的：观察豚鼠脑缺血再灌注后葡萄糖结合蛋白（glucose－regulated protein,GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－12（caspase－12）在听皮层的表达,探讨内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）在脑缺血再灌注后听皮层神经元凋亡中的作用。方法选取健康豚鼠50只,随机分为5组：正常对照组、A组（缺血再灌注6 h）、B组（缺血再灌注12 h）、C组（缺血再灌注24 h）、D组（缺血再灌注72 h）。采用夹闭双侧颈总动脉的方法建立脑缺血再灌注损伤模型,分别在脑缺血再灌注后6、12、24、72 h行听性脑干反应（ABR）测试后处死各组豚鼠,应用 HE染色法观察听皮层神经元病理变化,免疫组化染色及 Western－blot 方法检测各组GRP78、caspase－12的表达。结果从正常对照组到B组豚鼠ABR反应阈值逐渐增加,从C 组到D组又逐渐下降,但D组仍比正常对照组高（P＜0．05）。HE染色示正常对照组听皮层神经元排列整齐,胞浆丰富,胞核大而圆,染色清晰;A、B、C、D组听皮层神经元均有不同程度的数量减少,且体积萎缩,胞核固缩,碎裂,核仁消失。免疫组化染色及 Western－blot示正常对照组 GRP78、caspase－12蛋白仅有微量或少量表达,缺血再灌注后6 h,二者表达开始上调,至12 h GRP78表达达到高峰,12 h后逐渐降低,各组之间差异均有统计学意义（P＜0．05）。caspase－12表达24 h达到峰值,后逐渐下降,缺血再灌注6 h组与12 h组间差异无统计学意义,其余各组间差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论脑缺血再灌注损伤可诱发内质网应激,使GRP78、caspase－12表达增加,GRP78、caspase－12可能参与了ERS介导的听皮层神经元细胞凋亡过程。