细胞移植及髓核组织工程重建修复椎间盘退变

背景：通过细胞组织工程将细胞或细胞支架复合体植入退变缺损的椎间盘内,使退变的椎间盘再生可能是治疗椎间盘退变性疾病最为理想的方法。 目的：评价组织工程髓核体内移植抑制腰椎间盘退变的临床疗效及应用前景。 方法：由第一作者检索1990/2010 PubMed数据、中国知网及万方数据库有关组织工程髓核、组织工程材料及骨髓间充质干细胞治疗腰椎间盘退变方面的文献。 结果与结论：目前常用的细胞支架主要包括胶原支架、琼脂糖支架、藻酸盐支架、聚乙醇酸支架与壳聚糖支架以及复合材料等。通过自体椎间盘细胞或间充质干细胞结合基因技术筛选种子细胞,进行细胞和/或细胞支架复合体移植恢复或再生相关细胞外基质的合成,通过逆转和修复椎间盘细胞病理性改变,为退变的椎间盘组织和功能恢复提供了全新的治疗策略。     

髓核细胞移植抑制椎间盘退变

背景：近年来,椎间盘细胞移植和椎间盘移植修复椎间盘退变研究取得较大的进展。目的：探讨髓核细胞的体外培养方法以及髓核细胞移植在抑制椎间盘退变研究中的作用。方法：通过数据库检索的方式探讨髓核细胞移植抑制椎间盘退变的研究。髓核细胞的主要功能是产生胶原和蛋白聚糖,改进髓核细胞的培养方法,使培养后的髓核细胞数量增多,合成和分泌细胞外基质增加,通过髓核细胞移植来修复退变的椎间盘。结果与结论：通过三维小球聚集培养、微载体旋转立体培养等方法可以使髓核细胞数量增多,肝细胞生长因子对髓核细胞增殖产生促进作用。髓核细胞移植可以恢复退变椎间盘高度,促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成和分泌。随着对椎间盘退变研究的不断深入,髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景：椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础。 目的：观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性。 方法：分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平。 结果与结论：体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变。对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势。     

人颈椎间盘退变与细胞凋亡及基质金属蛋白酶11的表达

背景：前期研究发现基质金属蛋白酶11基因在人退变颈、腰椎间盘组织中明显上调。 目的：观察人退变颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达与细胞凋亡的关系。 方法：纳入30个经MRI确认的退变颈椎间盘髓核组织和20个因颈椎创伤治疗获得的正常颈椎间盘髓核组织。 结果与结论：苏木精-伊红染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中髓核细胞较正常髓核组织明显减少(P < 0.01),而凋亡细胞较正常髓核组织明显增多(P < 0.01)。免疫组化染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达明显高于正常髓核组织(P < 0.01),且基质金属蛋白酶11表达与TUNEL染色检测到的细胞凋亡正相关(r=0.44,P < 0.05)。说明高表达的基质金属蛋白酶11不仅可直接破坏细胞外基质尚可诱导髓核细胞凋亡,在椎间盘退变的过程中发挥重要作用。     

体外培养人退变髓核与纤维环细胞增殖能力的研究

目的 探讨体外培养的人退变髓核与纤维环细胞的增殖能力,比较2种退变细胞体外培养中所表现的不同生物学行为,为椎间盘退变疾病的预防与治疗提供新的理论依据.方法 采集临床腰椎间盘突出症患者手术取材的椎间盘组织标本,病理学诊断评估其退变程度,酶消化法原代培养髓核与纤维环细胞,并鉴定.每例病例的髓核细胞与纤维环细胞分别体外培养至第5代,各代次细胞传代接种密度控制为1×105个.同条件培养48 h后,观察每一代细胞的形态学变化,同时应用流式细胞仪检测2种细胞的增殖能力.结果 体外培养的退变髓核与纤维环细胞生长状态良好.随着体外传代的进行,退变髓核与纤维环细胞S期细胞百分比和增殖指数(PI)均呈上升趋势,髓核细胞PI值于第3代时达到峰值,而纤维环细胞PI值于第5代时最高;且第2～4代的退变髓核细胞的增殖活性均高于退变纤维环的增殖活性(P＜0.05).结论 体外培养的人退变髓核与纤维环细胞有着不同的增殖特点,髓核与纤维环细胞对体内退变微环境有着不同的响应机制,并影响着整个椎间盘退变的进展.     

大鼠颈椎间盘老化及退变过程中髓核形态变化规律的实验研究

目的：研究颈椎间盘自然老化及退变过程中髓核软骨样细胞的来源和脊索性髓核向纤维软骨性髓核转化的规律及其与颈椎间盘退变的关系。方法：4周龄SD大鼠76只，随机分成两组。实验组40只大鼠通过截除前肢制备双后肢大鼠颈椎间盘退变的动物模型，按术后3、6、9、12个月4个时间段分组，每组10只；对照组36只大鼠未予处置，按实验开始后4、8、12、16个月分4组，每组9只。制备C4-5，C5-6和C6-7椎间盘中矢状面组织学切片，行HE、番红-O染色，研究观察不同老化及退变程度颈椎间盘髓核中软骨样细胞的起源和脊索性髓核向纤维软骨性髓核转化的规律。结果：随着颈椎间盘的不断老化，终板的软骨细胞向髓核迁移，脊索性髓核向心性皱缩并最终完全被纤维软骨性髓核取代，在此过程中，软骨终板的厚度逐渐变薄，进而出现缺损或断裂；在颈椎间盘退变的过程中，这一转化完成的更快、更早。结论：髓核中的软骨样细胞由终板的软骨细胞迁移而来，通过向心性的产生和沉积胶原纤维，脊索性髓核逐渐被纤维软骨性髓核替代，这一过程既是颈椎间盘成熟和老化的自然环节也可能是颈椎间盘退变的启动环节。     

bFGF对人退变椎间盘髓核细胞影响的临床研究

目的:探讨bFGF对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响,观察退变髓核细胞基因表达量高于正常髓核细胞的生长刺激因子对退变髓核细胞的影响。方法:分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变椎间盘髓核细胞分为5组。A组:加入100μg/L bFGF;B组:加入200μg/L bFGF;C组:500μg/L bFGF;D组:1 000μg/LbFGF,E组:对照组,不加干扰因素。通过对试验组和对照组髓核细胞测定细胞II型胶原和糖胺多糖的mRNA表达;检测细胞外基质II型胶原和糖胺多糖表达水平。结果:bFGF刺激退变髓核细胞,II型胶原、糖胺多糖mRNA,细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在第7天较对照组增加明显(P<0.05)。14 d、21 d II型胶原、糖胺多糖mRNA明显低于对照组(P<0.05)。但细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在14 d、21 d两个时间点仍高于正常组(P<0.05)。结论:根据本研究结果结合文献调研,bFGF在椎间盘髓核细胞中存在着双重效应(促进或改善椎间盘退变)。     

不同代次兔髓核细胞的形态学特征和生物学性状

背景：椎间盘退变是个慢性、复杂的过程,然而椎间盘退变其发生机制尚未完全阐明,很难自行修复。近年来研究细胞移植治疗椎间盘退行性变尚处在实验室阶段。研究髓核细胞的生物学性状可为研究椎间盘退变机制、组织工程构建椎间盘、基因治疗等提供理论依据。 目的：研究兔不同代次髓核细胞的生物学特性,旨在找出合适的种子细胞去治疗椎间盘退变性疾病。 方法：从新西兰大耳白兔椎间盘髓核组织中,分离并培养髓核细胞同时进行培养传代,对原代及第3,4代髓核细胞进行苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化;甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;反转录PCR法测定Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平,观察各代髓核细胞生物学特性的变化。 结果与结论：兔椎间盘髓核细胞可以在体外培养并进行传代,原代髓核细胞一般需7 d左右贴壁,形状呈类圆形或多角形,原代和第3代髓核细胞都呈圆形或多角形,活力较强,苏木精-伊红染色后细胞核被染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;髓核细胞经过甲苯胺蓝染色后,胞浆内呈现天蓝色,通过Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后,胞浆内表现为黄褐色沉淀。到第4代细胞出现退变,Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平较前几代细胞显著下降。前3代的髓核细胞代谢旺盛,表型一致,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达正常,传第4代后髓核细胞开始出现衰老、退变。     

退变髓核细胞与正常髓核细胞体外培养的生物学特性对比

目的:比较体外培养的退变髓核细胞与正常髓核细胞生物学特性的差异。方法:将成年新西兰大白兔以纤维环穿刺法椎间盘造模法处理,4周后取退变以及正常髓核细胞,进行细胞形态及电镜观察、MT法试验,检测细胞周期及主要细胞外基质相关基因表达情况。结果:细胞生长曲线显示,传4代细胞第5天开始出现生长减慢,传5～7代细胞均在接种后第2～3天细胞数量明显减少(P<0.05);退变髓核细胞传3代细胞第4天开始出现生长减慢(P<0.05),传5代时即出现生长滞缓,传7代时出现生长停滞。髓核软骨样细胞MTT摄取实验,传4～7代细胞的吸光度值明显低于传1代(P<0.05)。正常和退变髓核细胞细胞所处生长分裂期对比中,正常和退变髓核细胞G1期细胞所占比例具有统计学差异(P<0.05)。结论:大白兔正常髓核细胞持续增殖能力、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原DNA的含量均较退变髓核细胞高,能为椎间盘组织工程学、细胞生物学疗法等提供理论基础。     

尼古丁在人椎间盘髓核细胞退变中的作用

目的探讨不同浓度及时间的尼古丁在人椎间盘髓核细胞退变中的作用。方法随机选择5例腰椎骨折患者的椎间盘髓核组织进行体外细胞培养,种于12孔板中,按照0、1、33.3、100、200、500ng/m L的尼古丁浓度以及1、2、3、7、10天加入来培养,每组细胞用Trizol法提取总RNA,用荧光定量PCR测定AQP1,AQP3和II型胶原(Collagen)以及蛋白多糖(Aggrecan)的m RNA表达。用SPSS19.0进行统计分析。结果随着尼古丁浓度升高及培养时间的延长,髓核细胞形态变化明显,贴壁能力减弱,胞质减少,胞核萎缩,空泡形成,凋亡增加。且细胞AQP1及AQP3的m RNA水平随着尼古丁浓度及时间的增加而降低,II型胶原及蛋白聚糖m RNA水平也降低,细胞发生退变。结论尼古丁会降低人椎间盘髓核细胞AQP1和AQP3的表达,进而降低髓核细胞II型胶原和蛋白聚糖的表达,促进椎间盘退变,且作用时间越长,浓度越高,细胞退变越严重。     

细胞移植修复椎间盘的新视角与新进展

文题释义： 椎间盘退变：是指椎体自然老化、退化的生理病理过程。腰椎是人体躯干活动的枢纽,而所有的身体活动都无一不在增加腰椎的负担,随着年龄的增长,过度的活动和超负荷的承载使腰椎加快出现老化。严重的腰椎退行性病变可以引起腰腿痛甚至神经损害,影响工作能力和生活质量。 细胞治疗：是指利用某些具有特定功能的细胞特性,采用生物工程方法获取或通过体外扩增、特殊培养等处理后,使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效,从而达到治疗疾病的目的。 背景：目前对椎间盘退变的治疗仅限于姑息治疗或积极的外科干预,但均不能减缓或逆转其进程,远期疗效也不满意。近年来随着组织工程与再生医学的不断发展,运用细胞疗法修复退变椎间盘得到了越来越多的研究者关注。 目的：总结目前临床上细胞移植治疗椎间盘退变的现状,为以后的研究提供一些理论基础和实验依据。 方法：通过计算机在CNKI、万方数据库、PubMed数据库中检索相关文献,检索时限为 2001 年 1月至 2019 年1月。检索的中文主题词为“椎间盘退变,细胞治疗,干细胞,细胞移植”;英文主题词为“stem cell,intervertebral disk degeneration”,筛选内容与干细胞治疗椎间盘退变相关的文献,着重选取最新的实验及临床研究成果。 结果与结论：椎间盘退变主要以髓核细胞的活力和数量减少、蛋白多糖合成减少、髓核脱水以及代谢废物增多引起的。不断深入了解探索细胞移植促进髓核再生的治疗机制,不仅能够对椎间盘的发病及修复机制有更为详尽的认识,更能够对其他相关疾病的预防与细胞治疗提供新的思路与策略。 ORCID: 0000-0002-5454-9395(刘亭亭) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

椎间盘微环境下椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞的活性

文题释义：椎间盘微环境：在正常情况下,髓核组织缺乏血液供应,其营养代谢主要依赖渗透。由于代谢产物等影响,椎间盘组织内部的pH值为6.9-7.2,被认为是人体内最恶劣的环境之一,在这种条件下细胞正常代谢能力受到很大抑制,即使是特化的髓核细胞其代谢率也仅为正常的32%。当椎间盘退变后,葡萄糖及氧浓度进一步下降,乳酸堆积,pH值降低和代谢产物进行性增加。 髓核间充质干细胞：经过前期实验发现髓核间充质干细胞经自体移植于椎间盘局部,可以分化为纤维环细胞和髓核细胞,或者通过旁分泌细胞因子来促进组织细胞的再生,但髓核间充质干细胞在椎间盘微环境中存活量级并不清楚。椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞在椎间盘微环境下的生存变化差异性也还是未知。 背景：椎间盘微环境对干细胞生物学行为具有重要作用,拟通过微环境调节作用来实现不依赖种子细胞的椎间盘组织修复。 目的：探讨椎间盘微环境下椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞活性的差异。 方法：健康雄性SD大鼠10只,按照解剖区分离椎间盘骨组织,用Ⅱ型胶原酶消化后进行体外培养椎间盘源性干细胞;分离髓核组织,采用酶消化法体外培养髓核间充质干细胞。将获得的椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞在体外进行正常条件、椎间盘微环境条件下培养扩增,培养第1-6天采用MTT法测定细胞增殖情况,培养第1,3,6天采用流式细胞技术检测CD29阳性表达水平。 结果与结论：①在不同环境的培养条件下,椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞增殖情况呈相反趋势。在正常培养条件下,椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞呈增殖状态,第4-6天为对数增殖期,两者差异无显著性意义(P > 0.05);在椎间盘微环境条件下,髓核间充质干细胞的增殖活性明显低于椎间盘源性干细胞,差异有显著性意义(P < 0.05);②在椎间盘微环境条件下培养第3,6天,椎间盘源性干细胞表面CD29阳性抗原表达水平明显高于髓核间充质干细胞,差异有显著性意义(P < 0.05);③结果表明,在椎间盘微环境条件下,髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞活性受到一定程度的抑制,但椎间盘源性干细胞较髓核间充质干细胞保留更多的细胞活性。 ORCID: 0000-0002-3582-5630(胡炜) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

Characterisation of cytoplasm-filled processes in cells of the intervertebral disc

We examined cells from the nucleus pulposus and annulus fibrosus of adult bovine intervertebral discs, using confocal laser scanning microscopy on living unfixed tissue. These cells were visualised using chloromethyl fluorescein diacetate, a membrane-impermeant fluorescent dye. The organisation of cells from the outer annulus was also determined using confocal microscopy after fixation and staining the actin-filaments with FITC-phalloidin. We found that cellular processes were a dominant feature of cells from all regions of the disc including the cells of the nucleus pulposus and inner annulus. These processes were also visible in histological sections of disc examined both at the light and electron microscope level, even though cells from the nucleus and inner annulus appeared chondrocyte-like, being rounded and enclosed in a capsule. The function of these processes is at present unknown. We suggest that they may serve to sense mechanical strain.     

In situ oxygen utilization in the rat intervertebral disc

Nucleus pulposus cells of the intervertebral disc have no endogenous vasculature and have thus been hypothesized to be hypoxic. This hypothesis was tested using 2-nitroimidazole, EF5, a drug that at low oxygen concentrations forms covalent adducts with cellular proteins. After administrating EF5 to rats, sections of the intervertebral disc were analysed for EF5 adducts. Drug adducts were quantified in tissue sections using a fluorescent monoclonal antibody. Although the level of EF5 fluorescence in all intervertebral disc tissues was low, the transition zone at the periphery of the nucleus pulposus exhibited the highest level of EF5 binding. To substantiate this result, tissue nitroreductase levels and drug pharmacology were evaluated. Nitroreductase levels were measured in whole discs under severe hypoxia. We noted that there was robust EF5 binding to cells in the annulus fibrosus and transition zone with modest binding to cells of the nucleus pulposus and endplate. High-performance liquid chromatography analysis indicated limitations in EF5 access to the nucleus pulposus, most probably related to the lack of vasculature and slow drug distribution through the gel-like interior of the disc. However, despite diffusion problems, the drug dose was determined to be sufficient to report the oxygen status of the nucleus pulposus cells. Based on these findings, we conclude that despite poor vascularization, the disc cells accommodate to the local environment by displaying a limited need for oxygen. Accordingly, the cells of the intervertebral disc are not severely hypoxic.     

多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞

背景：椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大。 目的：探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法。 方法：取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较。 结果与结论：椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别。说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定。     

去细胞髓核支架材料制备方法的比较学研究

目的探索去细胞化天然髓核支架,以构建组织工程椎间盘修复脊柱退行性疾病。方法 1个月龄及1岁龄Beagle犬各4只,平均体质量分别为0.6kg、7.5kg。取结构完整椎间盘髓核组织各40块。随机分为4组,每组10块。分别采用化学萃取及酶消化2种方法分别处理Beagle犬椎间盘髓核组织,进行形态学和组织学比较研究,分析并比较不同方法及不同年龄髓核供体的去细胞效果及对基质结构的完整性。以噻唑蓝法进行间接接触细胞毒性实验检测去细胞髓核的细胞生物相容性。结果 1岁龄髓核去细胞处理后残余细胞分别为（4.32±4.15）个/高倍视野（化学萃取组）、（4.98±4.52）个/高倍视野（酶消化组）,显著高于1个月龄髓核组,且结构完整性显著改善。化学萃取与酶消化2种方法制备的去细胞髓核浸提液在1周内的细胞毒性分级均为0级与1级。1个月龄髓核去细胞效果良好,但无论化学萃取或是酶消化法均对基质成分有严重破坏作用,不宜作为去细胞髓核支架的供体。结论酶消化法能够在去除犬1岁龄髓核细胞成分的同时更好地保留细胞外基质框架结构,无明显的细胞毒性,不影响细胞的正常功能;是制备去细胞髓核天然支架的良好方法。     

人工髓核假体的研究进展及其发展方向

背景：人工髓核置换是治疗腰椎间盘疾病以及重建椎间稳定和微动功能的最佳方法之一,理想的人工髓核材料的研究是当前研究的热点和难点。 目的：简要回顾国内外治疗腰椎间盘突出症尝试的不同方法以及取得的成绩,重点分析人工髓核材料的发展历史及现状,并对预制型和原位聚合型两种人工髓核基本特性进行综述。 方法：由第一作者检索1995/2010 PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)、万方数据库(http://www. wanfangdata.com.cn)、书籍《腰椎间盘突出症》有关腰椎间盘退变治疗方法、髓核置换材料选择及置入方法等方面的文献。英文检索词为“nucleus replacement,biocompatibility,disc degenerative”,中文检索词为“髓核置换,生物相容性,间盘退变”。检索文献量总计90篇,排除重复性研究,共保留其中的36篇归纳总结。 结果与结论：目前髓核置换假体可以分为两种：预制型和原位聚合型。预制型假体与生理髓核组织的生物力学更相近,但是报道有不同并发症。原位聚合材料由不同的单体在置入后聚合、硬化形成弹性体,这就使手术创伤降到最小,减少内植物移位的风险,但是这些材料仍在初步评估节段。提示作为治疗腰椎间盘突出症的新方法之一,不同材料的人工髓核目前正处于不同研制阶段中,并且取得了一些有意义的早期研究成果,人工髓核置换作为常规手术的补充和改进,是一种具有潜力的治疗方式。