ghrelin对糖尿病大鼠缺血诱导的血管新生障碍的影响及相关机制

目的 探讨生长激素促分泌物受体(GHSR)的内源性配体ghrelin对糖尿病大鼠缺血诱导的血管新生障碍的影响及相关机制.方法 选取7～8周龄的SD大鼠,用完全随机化法分为6组:(1)正常对照组,(2)单纯糖尿病组,(3)单纯心肌梗死(MI)组,(4)糖尿病合并MI组,(5)糖尿病合并MI+ ghrelin干预组,(6)糖尿病合并MI+ ghrelin+ GHSR1a特异性拮抗剂D-Lys3-GHRP-6干预组.建立链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠模型,3个月后结扎冠状动脉左前降支建立急性MI模型.ghrelin干预组大鼠腹腔注射ghrelin(200 μg·kg-1·d-1),ghrelin+ D-Lys3-GHRP-6干预组大鼠腹腔注射ghrelin(200μg·kg-1·d-1)+ D-Lys3-GHRP-6(50 mg· kg-1·d-1),其余组别分别腹腔注射等量生理盐水.4周后超声心动图检测各组大鼠心功能,CD34免疫组织化学检测MI边缘区微血管生成密度(MVD),Masson染色检测MI面积,实时荧光定量-PCR和Western blot分别检测MI边缘区血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体1(Flt-1)和血管内皮细胞生长因子受体2(Flk-1)的mRNA及蛋白表达.结果 (1)与单纯MI组比较,糖尿病合并MI组梗死边缘区MVD[(15.3±1.0)个比(20.7±1.6)个,P＜0.05]、左心室射血分数(LVEF)[(64.2±3.4)％比(81.3±3.8)％,P＜0.01]、左心室短轴缩短率(LVFS)[(31.7±1.1)％比(48.8±3.3)％,P＜0.01]较低,MI面积较大[(55.8±3.1)％比(35.7 ±2.5)％,P＜0.01],梗死边缘区VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的基因和蛋白表达差异均有统计学意义(P均＜0.001).(2)与糖尿病合并MI组比较,糖尿病合并MI+ghrelin干预组梗死边缘区MVD[(17.7±1.3)个比(15.3±1.0)个,P＜0.05]、LVEF[(83.9±6.3)％比(64.2±3.4)％,P＜0.001]、LVFS[(44.5±3.1)％比(31.7±1.1)％,P＜0.001]较大,MI面积较低[(35.4±4.37)％比(55.8±3.1)％,P =0.005],梗死边缘区VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的基因和蛋白表达差异均有统计学意义(P ＜0.001).ghrelin+ D-Lys3-GHRP-6干预组大鼠MVD、LVEF、LVFS均较ghrelin干预组低(P均＜0.05),MI面积较大[(52.1±1.04)％比(35.4±4.37)％,P=0.02],梗死边缘区VEGF及其受体Flt-1、Flk-1基因与蛋白表达的效应较高(P均＜0.01).结论 糖尿病合并MI大鼠心肌梗死边缘区MVD和心功能较单纯MI大鼠低,MI面积大,ghrelin可能通过调控GHSR1a依赖的VEGF及其受体Flt-1、Flk-1基因和蛋白表达来提高糖尿病MI大鼠梗死边缘区MVD,进一步减少其梗死面积及改善心功能.     

糖尿病大鼠脑缺血再灌注后血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的表达

目的 研究糖尿病大鼠脑缺血再灌注后血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的情况.方法 采用STZ诱导产生慢性糖尿病大鼠模型,用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型,对大鼠进行脑梗死体积计算并且采用免疫组化方法观察大鼠脑缺血再灌注不同时程(6,12,24,48 h)VEGF、bFGF的表达情况.结果 糖尿病组梗死体积明显大于正常血糖组;大鼠脑缺血再灌注6h,缺血侧脑组织梗死灶周边VEGF、bFGF免疫阳性反应已出现,12 h明显增多,24 h达高峰;糖尿病组在各时间点VEGF、bFGF表达比正常血糖组显著减少(P＜0.01).结论 脑缺血再灌注损伤后VEGF、bFGF表达增强,提示VEGF、bFGF对缺血性脑损伤有保护作用,可能与神经细胞和内皮细胞的自身保护作用有关.糖尿病加重了大鼠脑缺血再灌注损伤,造成VEGF、bFGF的表达不足.     

人脐血干细胞移植促进心肌梗死大鼠血管新生的机制研究

目的:观察人脐血干细胞(hUCBSC)经静脉移植对心肌梗死(MI)大鼠血管新生和血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素(Ang-1)表达的影响.方法:雄性SD大鼠40只,随机分为3组:①假手术组(10只);②对照组(15只)制备MI模型成功后,经尾静脉注射0.9%氯化钠溶液0.5 ml;③移植组(15只)尾静脉注射hUCBSC 0.5 ml(含干细胞2×107/ml).术后4周行超声心动图和血流动力学检查,并取心脏组织行苏木精-伊红染色、抗Ⅶ因子免疫组化染色,观察心肌病理改变、心肌毛细血管密度(MCD)的变化.同时用免疫组化和RT-PCT的方法检测VEGF、Ang-1及其mRNA的表达.结果:与对照组相比,术后4周时移植组心功能明显改善(P＜0.01),左室舒张末压显著降低[(20.13±5.63)mmHg,(10.56±4.69)mmHg,P＜0.01],而左室压力最大变化率明显增加[(4.25±2.01)mmHg/ms:(6.53±2.38)mmHg/ms,P＜0.053;和[(3.83±2.69)mmHg/ms:(6.25±2.92)mmHg/ms,P＜0.05];移植组MCD明显高于对照组[(4.2±0.5)个/HP:(2.1±0.3)个/HP,P＜0.01];移植组VEGF和Ang-1及其mRNA表达明显高于对照组和假手术组.结论:hUCBSC经静脉移植通过促进VEGF和Ang-1表达而促进MI大鼠血管新生,从而改善MI大鼠心功能.     

康脑液对脑缺血再灌注大鼠血管内皮生长因子mRNA及肝细胞生长因子mRNA表达的影响

目的探讨康脑液对脑缺血再灌注损伤大鼠血管内皮生长因子(VEGF)mRNA及肝细胞生长因子(HGF)mRNA的影响。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、康脑液高、中、低剂量组。栓线法复制SD大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO),采用原位杂交法观察各组大鼠脑内VEGF mRNA和HGF mRNA的表达,同时观察康脑液对脑缺血再灌注大鼠神经功能、脑梗死体积的影响。结果与模型组比较,尼莫地平组、康脑液各剂量组均能改善脑缺血大鼠的神经功能缺失症状,缩小脑梗死体积,增强VEGF mRNA和HGF mRNA的表达(P0.05),其中康脑液高、中剂量组作用强于尼莫地平组(P0.01)。结论康脑液能增强大鼠脑缺血再灌注后VEGF mRNA及HGF mRNA的表达,是其抗脑缺血的可能作用机制之一。     

西酞普兰促进血管发生对脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用

目的 探讨西酞普兰对局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用及其可能机制.方法 75只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、生理盐水对照组和西酞普兰干预组,每组25只.线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型.改良神经功能缺损量表评价大鼠神经功能缺损(每组5只).激光共聚焦技术观察缺血区微血管直径、密度和总面积(每组5只).酶联免疫吸附法检测血浆血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度(每组5只).免疫组织化学染色法(每组5只)和蛋白质印迹法(每组5只)检测缺血脑组织VEGF表达.结果 模型制作后14 d时,西酞普兰干预组神经功能缺损较生理盐水对照组显著改善[(4.39±0.92)分对(6.57±1.13)分,P=0.015].三维共聚焦血管成像显示,西酞普兰干预组毛细血管直径显著性小于生理盐水对照组[(2.93±0.19)μm对(3.56±0.22)μm; P=0.000];血管密度显著性高于生理盐水对照组[(232.68±12.54)个/0.002 mm3对(176.26±10.87)个/0.002 mm3;P=0.000];微血管总面积显著性大于生理盐水对照组[(89 154±3 298) μm2/0.002 mm3对(75 368.14±3 519) μm2/0.002 mm3;P=0.000].酶联免疫吸附法显示,西酞普兰干预组血浆VEGF浓度显著性高于生理盐水对照组[(50.35±5.44) pg/ml对(13.75±4.12) pg/ml;P=0.000].免疫组织化学分析显示,西酞普兰干预组缺血区VEGF表达显著性高于生理盐水对照组(P =0.000).蛋白质印迹法显示,西酞普兰干预组缺血脑组织VEGF表达显著性高于生理盐水对照组[(0.94±0.18)对(0.62±0.22);P=0.006].结论 西酞普兰可显著减轻脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损,其机制可能与VEGF介导的血管发生有关.     

糖尿病大鼠缺血再灌注脑组织胰岛素受体表达与血管内皮生长因子的相关性

采用免疫组织化学技术检测糖尿病大鼠缺血脑组织胰岛素受体和血管内皮生长因子(VEGF)的表达特点.与单纯脑缺血组相比,糖尿病脑缺血组胰岛素受体和VEGF表达均明显降低(P＜0.05或P＜0.01);各组胰岛素受体与VEGF表达呈显著正相关(P＜0.05或P＜0.01).     

自体骨髓来源内皮祖细胞移植改善脑缺血再灌注大鼠神经功能转归

目的 探讨目体骨髓米源内皮祖细肥(endothehalprogenitor cell,EPC)移植对脑缺血大鼠神经功能转归的影响及其可能机制.方法 体外分离培养自体骨髓来源EPC并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5 -bromodeoxyuridine,BrdU)标记.线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)模型.EPC组大鼠经颈外静脉移植自体EPC[ 106/ml·kg)],对照组注射磷酸盐缓冲液(1 ml/kg),假手术组不进行任何处理(n=15).改良神经功能缺损严重程度评分(modifiedneurological severity score,mNSS)观察大鼠神经功能变化情况.BrdU免疫组化染色评价EPC增殖和分化.三维共聚焦图像分析检测脑缺血区血管结构和密度.TUNEL染色检测缺血脑组织凋亡细胞.酶联免疫吸附法检测血浆血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度.结果 EPC组mNSS评分显著低于对照组[第8天时;(6.43±0.69)分对(8.86±0.95)分;q=2.673,P=0.035;第14天时:(4.55±0.89)分对(6.73±1.06)分;q=5.360,P=0.035].EPC组BrdU阳性细胞数量显著多于对照组[(42.2±5.76)对(25.67±5.49);q=4.020,P=0.030].EPC组毛细血管直径显著小于对照组[(4.51±0.21)μm对(6.34±0.24) μm;q=3.980,P =0.003];血管密度[(212.64±8.02)/0.002 mm3对(153.60±7.21 )/0.002 mn3;q =9.670,P=0.001]和微血管总表面积[(92 013±5 132)μm3/0.002 mm3对(71 366±4 538) μm2/0.002 mm3;q=4.180,P=0.014]显著高于和大于对照组;EPC组凋亡细胞数量显著少于对照组[(36.26±6.91)对(78.34±7.21);t=-4.834,P=0.003];EPC组血浆VEGF浓度显著高于对照组[(54.91±5.71)pg/ml对(13.81±4.25)pg/ml;q=12.300,P=0.002].结论 自体EPC移植对大鼠缺血脑组织具有保护作用,可能与VEGF相关联的血管再生和神经保护有关,其在治疗缺血性脑血管病中具有重要的应用前景.     

尤瑞克林对大鼠脑缺血再灌注损伤Bcl-2和Bax表达的影响

目的 观察大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中Bcl-2和Bax的表达及尤瑞克林的影响。 方法 48只SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、生理盐水对照组和尤瑞克林治疗组。线栓法制作大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型,缺血2h后再灌注,24 h后行神经功能评分,采用免疫组织化学法和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法观察脑组织Bcl-2和Bax表达的变化。 结果 大鼠脑缺血再灌注损伤后,模型组和生理盐水对照组Bcl-2阳性细胞数和mRNA的表达分别为[(14.28±2.54)个/HP、0.551±0.068和（16.54±1.84）个/HP、0.585±0.084],比假手术组[(7.58±0.97)个/HP、0.324±0.042]增多(P＜0.05);模型组和生理盐水对照组Bax阳性细胞数和mRNA的表达分别为[(24.38±3.58)个/HP、0.540±0.076和(26.74±4.04)个/HP、0.527±0.065],比假手术组[（8.24±1.95）个/HP、0.309±0.037]增多(P＜0.05)。尤瑞克林干预后,Bcl-2阳性细胞数和mRNA的表达显著上调[(25.61±3.41)个/HP、0.791±0.096],Bax阳性细胞数和mRNA的表达下调[(18.54±2.38)个/HP、0.359±0.053],与模型组和生理盐水对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论尤瑞克林可上调脑组织中Bcl-2的表达,下调Bax的表达,从而抑制细胞凋亡,这可能是其发挥脑保护作用的机制之一。     

胰岛素经VEGF-A/VEGFR2途径促进恒河猴视网膜血管内皮细胞的血管新生

用人胰岛素处理恒河猴视网膜血管内皮细胞系RF/6A,测定其增殖、迁移、管腔形成情况和血管内皮生长因子A(VEGF-A)及其受体(VEGFR)的表达与磷酸化.与空白对照组相比,胰岛素促进RF/6A细胞增殖、迁移和管腔形成(均P＜0.01)、促进VEGF-A mRNA的表达和蛋白的活性(均P＜0.05);促进VEGFR2 mRNA的表达和蛋白的磷酸化(均P＜0.01),而对VEGFR1 mRNA的表达影响无统计学意义(P＞0.05)     

白蛋白治疗对大鼠脑缺血后海马血管内皮生长因子及其受体1的影响

目的探讨人血白蛋白治疗对大鼠脑缺血早期海马血管内皮生长因子(VEGF)及fam样酪氨酸激酶受体1(flt-1)表达的影响。方法雄性SD大鼠40只,采用大脑中动脉线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,随机分为假手术组10只、生理盐水组15只和白蛋白组15只。采用溴甲酚绿法测定血清白蛋白水平,RT-PCR检测脑缺血再灌注后6、24、48h大鼠海马VEGF和flt-1mRNA表达,免疫组织化学和Western blot法检测脑缺血再灌注24h海马VEGF蛋白表达。结果与生理盐水组比较,白蛋白组大鼠神经功能缺损评分于脑缺血再灌注后24、48h明显降低(P<0.05),海马VEGF mRNA和flt-1mRNA表达于脑缺血再灌注后6、24h明显降低(P<0.05,P<0.01),海马VEGF蛋白表达于脑缺血再灌注后24h明显降低(P<0.05)。结论白蛋白治疗可下调脑缺血早期海马VEGF和flt-1mRNA表达,降低海马VEGF蛋白表达水平,改善神经功能缺损。     

外源性H2S通过核因子-κB介导的炎性反应通路减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤

目的 探讨外源性硫化氢(hy drogen sulfide,H2S)对脑缺血再灌注后脑损伤和炎性反应的影响.方法 48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注(ischemia/rep erfusion,I/R)组、H2S 30 ppm组和H2S 60 ppm组(1 ppm=1 mg/L),每组12只.采用大脑中动脉闭塞法建立大鼠局灶性脑缺血2h再灌注24 h模型.再灌注24 h后应用胶带剔除实验进行神经功能评价,应用2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色法测定脑梗死体积百分比,采用酶联免疫吸附法测定缺血脑组织白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6水平,采用蛋白质印迹法测定缺血脑组织诱导型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase,iNOS)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的转位激活情况.结果 与I/R组比较,吸入H2S能以剂量依赖性方式缩短胶带剔除所需的时间[I/R组与H2S 30 ppm组和H2S 60 ppm组比较:180 s对130(113～157)s对110(87～138) s;P ＜0.05],缩小脑梗死体积(48.8％±9.1％对23.3％±5.1％对17.3％±3.5％;P＜0.05)],下调缺血脑组织IL-1β[(39.53±6.02)pg/mg蛋白对(30.17±3.46)pg/mg蛋白对(22.69±6.09)pg/mg蛋白;P＜0.05]和IL-6[(54.65±10.68)pg/mg蛋白对(37.89±4.54) pg/mg蛋白对(27.00±3.08)pg/mg蛋白;P＜0.05]表达水平,显著降低NF-κB胞核/胞质比[4.40±1.05对3.07±0.82对2.30±0.60;P＜ 0.05)],抑制iNOS(4.22±0.67对3.14±0.90对2.08±0.35;P ＜0.05)和ICAM-1(5.45±1.08对3.45±0.67对2.21±0.39;P＜0.05)]表达.结论 吸入外源性H2S能以剂量依赖性方式缩小脑缺血再灌注后的脑梗死体积和改善神经功能,其机制可能与抑制NF-κB激活,下调其下游的iNOS和ICAM-1表达以及降低IL-1 β和IL-6水平有关.     

血管内皮生长因子基因－2578 C >A多态性与中国山东地区汉族人群颈动脉粥样硬化的相关性

目的：探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因－2578 C＞A多态性与中国山东地区汉族人群颈动脉粥样硬化的关系。方法纳入年龄在45~85岁之间的山东地区汉族受试者384例，根据颈部血管超声检查结果分为内膜－中膜厚度（ intim a-m edia thickness, IMT ）增厚组（248例）和对照组（136例）。收集2组人口统计学资料、血管危险因素和血液生化指标等基线临床资料，应用聚合酶链反应检测VEGF 基因－2578C＞A多态性基因型和等位基因，采用多变量logistic回归分析确定颈动脉IMT 增厚的独立危险因素。结果 IMT 增厚组高血压（70.6％对59.6％；χ2=4.793，P=0.032）、糖尿病（18.4％对29.0％；χ2=5.281，P=0.027）、高脂血症（45.2％对33.1％；χ2=7.883， P=0.006）、既往卒中或短暂性脑缺血发作史（29.0％对16.9％；χ2=6.294，P=0.009）、吸烟（35.9％对19.9％；χ2=10.708，P=0.001）的构成比以及总胆固醇[（4.82±1.25）mmol/L对（4.57±0.94）mmol/L；t=－2.072，P=0.039]、三酰甘油（中位数，四分位数间距）[1.71（0.84~2.22）mmol/L对1.53（1.08~2.59）mmol/L；Z=－2.560，P=0.010]、低密度脂蛋白胆固醇[（2.86±1.01）mmol/L对（2.64±0.85）mmol/L；t=－2.407，P=0.033]和高密度脂蛋白胆固醇[（1.58±0.72）mmol/L对（1.43±0.46）mmol/L；t=－2.183，P=0.030]与对照组差异有统计学意义。2组间基因型分布频率差异有统计学意义（χ2=10.131；P=0.006），IMT增厚组C等位基因频率与对照组差异有统计学意义（78.2％对70.2％；χ2=6.068，P=0.014）。多变量logistic回归分析显示，CC基因型（优势比1.132，95％可信区间1.021~2.141；P=0.029）是颈动脉IMT 增厚的独立危险因素。在248例IMT 增厚患者中，213例患者至少存在1个斑块，其中斑块指数1~276例（39.6％），3~4107例（43.15％），5~830例（12.1％）。不同斑块指数组基因型（χ2=6.766，P=0.149）和等位基因（χ2=0.185，P=0.667）分布频率差异无统计学意义。结论在中国山东汉族人群中，VEGF基因启动子区－2578单核苷酸多态性与颈动脉粥样硬化相关，C等位基因可能是其遗传易感因素。     

全反式维甲酸对兔颈动脉血管重塑及VEGF表达的影响

目的探讨全反式维甲酸（atRA）对兔颈动脉内皮损伤后内膜增生、VEGF表达的影响及机制。方法新西兰雄性大白兔随机分为6组（n=6）：治疗组（A、B）、对照组（A、B）、假手术组（A、B）。治疗组和对照组给予高脂饮食，手术损伤颈动脉内膜，治疗组给予atRA灌胃，假手术组手术但不损伤内膜。分别于术后7、28d处死A、B组动物，取病变血管进行形态学观察，免疫组化测VEGF、PCNA表达水平。结果对照组术后7d内膜开始增生，28d时内膜增生明显，管腔狭窄，有粥样斑块形成，VEGF、PCNA表达明显增加。治疗组内膜增生较轻，28d时内膜面积及斑块厚度低于对照组（分别为P〈0．001、P〈0．05），VEGF、PCNA阳性表达指数也低于对照组（分别为P〈0．01、P〈0．001）。结论atRA抑制兔颈动脉内皮损伤后VEGF、PCNA的表达，减轻新生内膜增殖及动脉粥样硬化病变形成。     

组织型激肽释放酶对脑缺血再灌注大鼠缺血脑组织缓激肽及其受体表达的影响

目的 探讨组织型激肽释放酶(tissue kallikrein,TK)对脑缺血再灌注大鼠缺血脑组织缓激肽、缓激肽B1受体(bradykinin B1 rgceptor,B1R)和缓激肽B2受体(bradykinin B2 receptor,B2R)表达的影响.方法 54只SD大鼠随机分为3组,每组18只.3组分别为假手术组;生理盐水(normal saline,NS)处理组(Ns组):NS 2 ml/(kg·d),连用3 d;TK(处理组(TK组):TK 17.5×10-3U/(kg·d),连用3 d.3 d后分别进行神经功能缺损评分、脑梗死体积测定.酶联免疫吸附法检测缺血区缓激肽含量;采用逆转录聚合酶链反应和Western印迹法分别检测缺血脑组织B1R、B2R mRNA和蛋白表达.结果 与NS组比较,TK组神经功能缺损显著减轻[(6.17±1.17)分对(8.17 4±1.33)分,t=2.000,P=0.004],脑梗死体积明显缩小[(29.67±3.78)%对(37.50±6.72)%,t=0.078,P=0.005];缺血脑组织缓激肽含量升高[(9.25 4±1.13)对(15.53±1.68),t=6.283,P:0.000];B2RmRNA表达显著上调[(1.21±0.17)对(2.15±0.20),t=0.943,P=0.000),而B1R mRNA表达上调不明显[(0.51±0.05)对(0.57±0.06),t=0.058,P=0.141)];B2R蛋白表达显著上调[(1.15±0.16)对(1.88 4±0.21),t=0.737,P=0.0001,B1R蛋白表达上调不明显[(0.50±0.04)对(0.53±0.05),t=1.326,P=0.214].结论 TK 对脑缺血再灌注大鼠具有保护作用,能使缺血脑组织缓激肽含量增高,B2R表达上调,而对B1R表达影响不大.由此推测,B2R在TK保护缺血脑组织中发挥着主要作用.     

补阳还五汤及其拆方对脑缺血大鼠神经功能及血管生成的影响

目的探讨补阳还五汤及其拆方对局灶性脑缺血后大鼠神经功能和血管生成的影响及机制。方法采用随机数字表法,将清洁级SD雄性大鼠(52只)随机分为假手术组、模型组、全方组、补气组、活血组,每组各8只。除假手术组外,其余各组大鼠均采用线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,以首次Longa神经功能评分1~3分者为造模成功。补阳还五汤全方由黄芪120.0 g、当归6.0 g、赤芍4.5 g、川芎3.0 g、地龙3.0 g、红花3.0 g、桃仁3.0 g组成,补气方由黄芪120.0 g组成,活血方由当归6.0 g、赤芍4.5 g、川芎3.0 g、地龙3.0 g、红花3.0 g、桃仁3.0 g组成。术后第1天开始灌胃给药,全方组、补气组、活血组灌胃剂量分别为13.1、10.8、2.2 g/kg,假手术组和模型组分别灌服等容量的等渗盐水,1次/d,连续14 d。腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U,50 mg/kg),1次/d,连续14 d。在术后第1、7、14天,采用改良的神经症状严重程度评分(m NSS)和角实验评价感觉运动功能。术后第14天,采用Brd U和大鼠血管性血友病因子(v WF)免疫荧光双标检测缺血周边区血管生成情况;Western Blot检测血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达。结果 (1)与模型组比较,术后第7、14天,全方组大鼠m NSS评分较低[(6.8±1.0)分比(8.5±1.1)分、(6.1±0.8)分比(8.0±1.4)分,均P0.01],全方组右转次数减少[(7.1±0.6)次比(8.6±1.2)次、(6.1±0.8)次比(7.9±1.1)次,均P0.01],补气组右转次数减少[(7.5±0.5)次比(8.6±1.2)次、(6.2±1.0)次比(7.9±1.1)次,均P0.01];术后第14天,全方组缺血周边区Brd U/v WF标记免疫阳性细胞数量明显增多,组间差异有统计学意义[(30±8)个/mm2比(24±7)个/mm2,P0.01],VEGF蛋白表达增加[(0.33±0.01)比(0.30±0.01),P0.01]。(2)与补气组比较,术后第7、14天,全方组大鼠m NSS评分较低[补气组分别为(8.2±1.3)、(7.5±0.9)分,均P0.05],术后第14天,全方组缺血周边区Brd U/v WF免疫阳性细胞增多[补气组为(26±5)个/mm2,P0.05],VEGF蛋白表达增加[补气组为(0.31±0.01),P0.01]。(3)与活血组比较,术后第7、14天,全方组大鼠m NSS评分较低[活血组分别为(8.5±0.9)、(7.6±0.7)分,均P0.05],右转次数减少[活血组分别为(8.5±0.8)、(7.6±0.9)次,均P0.05],术后第14天,全方组缺血周边区Brd U/v WF免疫阳性细胞增多[活血组为(26±6)个/mm2,P0.05],VEGF相对表达水平升高[活血组为(0.31±0.01),P0.05]。结论补阳还五汤能促进脑缺血后血管生成和神经功能恢复,其机制可能与上调VEGF蛋白有关,方中补气药和活血药具有协同作用。     

Jagged1基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990和PANC1血管相关因子分泌及迁移能力的影响

目的 以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株Jagged1基因,观察细胞VEGF、Angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌及细胞迁移能力的变化.方法 应用靶向Jagged1的siRNA、对照siRNA(c-siRNA)转染人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1,实时PCR法和蛋白质印迹法检测细胞Jagged1 mRNA和蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF、angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌量,Transwell小室观察细胞的迁移能力.结果 SW1990和PANC1细胞均高表达Jagged1基因.15 nmol/L Jagged1 siRNA转染胰腺癌细胞72 h后,SW1990、PANC1细胞的Jagged1 mRNA表达被抑制,分别为c-siRNA组的(59.62 ±2.75)％和(76.96 ±6.16)％,Jagged1蛋白表达几乎完全被抑制.SW1990、PANC1细胞的VEGF分泌量均较c-siRNA组显著减少[(867.93±58.69) pg/ml比(1516.24±37.58)pg/ml,(951.13±120.49) pg/ml比(1413.68±33.56) pg/ml,P＜0.05],但angiopoietin2、bFGF、MMP9蛋白分泌无明显变化.另外,Jagged1 siRNA转染后,SW1990细胞VEGF mRNA表达水平为c-siRNA组的(52.26 ±4.85)％ (P＜ 0.05);PANCI细胞为c-siRNA组的(59.75±4.91)％(P＜0.05).转染后的SW1990和PANC1细胞的穿膜细胞数分别为(65.25±5.56)、(57.50±8.58)个,较c-siRNA组的( 122.25±11.09)、(112.00±12.52)个显著减少(P＜0.05).结论 人胰腺癌细胞高表达Jagged1,沉默Jagged1基因可明显抑制人胰腺癌细胞VEGF的产生和分泌,并且可降低癌细胞的体外迁移能力.     

脑缺血预处理对脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用与Nrf2/NQO1信号通路有关

目的 探讨脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIPC)对脑缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)大鼠的保护作用和对核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid2-related factor2,Nrf2)/醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)通路的影响.方法 共198只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、I/R组和CIPC组,再按照I/R时间点分为模型制作后6h、12 h、24 h、48 h和72 h共5个亚组,分别在各时间点进行神经功能评分,应用HE染色对脑组织进行形态学分析,氯化三苯基四氮唑法测定脑梗死体积,免疫组化染色观察缺血侧皮质Nrf2核转移情况,实时逆转录聚合酶链反应检测缺血侧皮质Nrf2和NQO1 mRNA表达.结果 I/R组和CIPC组大鼠出现不同程度偏瘫,CIPC组24 h和48 h时神经功能评分均显著低于I/R组(P均＜0.01).假手术组神经细胞无缺血性改变,CIPC组神经细胞缺血性改变较Ⅰ/R组减轻.假手术组无梗死灶,CIPC组梗死体积百分比显著低于I/R组[(33.20±7.48)％对(21.40 ±4.48)％;=11.043,P=0.001].I/R组和CIPC组6h时缺血皮质Nrf2核阳性细胞数较假手术组增多,24 h达高峰,48 h、72 h逐渐下降.6h、12 h和24 h时,CIPC组核阳性细胞数显著多于I/R组(P均＜0.01).I/R组和CIPC组6h时缺血侧皮质Nrf2和NQO1 mRNA表达水平显著高于假手术组(P均＜0.01),24 h达高峰,并持续到48 h,72 h有所下降.CIPC组各时间点Nrf2和NQO1 mRNA表达水平均显著高于I/R组(P均＜0.01),以24 h时最为明显.结论 CIPC对缺血再灌注大鼠具有神经保护作用,其机制与促进Nrf2核转移以及Nrf2/NQO1信号通路上调有关.     

XYLB基因rs17118多态性与中国汉族人群缺血性卒中关联研究

目的 验证木酮糖激酶(xylulokinase homolog,XYLB)基因rs17118多态性与中国汉族人群缺血性卒中发病风险的关联性.方法 采用病例对照研究设计,病例组为首发缺血性卒中患者,对照组为医院体检者,采用Taqman探针荧光定量聚合酶链反应技术检测rs17118 C/A多态性的基因型分布.结果 共纳入475例缺血性卒中患者和483例对照者.病例组高血压(67.9％对22.2％;x2 =292.982,P＜0.001)、糖尿病(24.2％对7.3％;x2 =25.864,P＜0.001)的患者比例以及三酰甘油[(1.649±1.126)mmol/L对(1.157土1.480)mmol/L);t=3.592,P＜0.001]和低密度脂蛋白胆固醇[(3.499±1.163) mmol/L对(3.105±0.627) mmol/L;t=-6.227,P＜0.001]水平显著高于对照组,但总胆固醇水平显著低于对照组[(5.144±1.296)mmol/L对(5.491±1.335)mmol/L;t=4.650,P＜0.001].病例组AA基因型(11.4％对7.5％;x2=6.136,P=0.016)以及A等位基因(32.3％对26.4％;x2 =8.093,P=0.005)频率均显著高于对照组.多变量logistic回归分析显示,在校正传统危险因素后,AA基因型携带者的缺血性卒中患病风险是CC基因型携带者的1.971倍(优势比1.971,95％可信区间1.040 ～3.736;P =0.038).结论 XYLB基因rs187118C/A多态性与中国汉族人群缺血性卒中的发病风险有关.     

腺相关病毒介导的血管内皮生长因子基因与骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠肢体缺血的研究

目的 探讨腺相关病毒(rAAV)介导的人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)移植对血管新生的影响.比较单纯干细胞移植与联合基因治疗的疗效.方法 全骨髓培养法提取培养MSC;rAAV-VEGF165转染MSC中,酶联免疫吸附试验(ELISA)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF的表达;以近交系大鼠建立骨骼肌缺血模型,40只大鼠随机分为4组,每组10只.对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS);干细胞组移植等量MSC,转染术后7 d组和转染术后10 d组分别于结扎7 d和10 d后的缺血区移植转染VEGF基因的MSC,移植6周后做Ⅷ因子染色检测血管新生情况.结果成功培养出MSC,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.在转染rAAV-VEGF165后转染组1、3、5、7、9 d上清液中VEGF165分泌水平分别为(131.98±6.00)、(263.96±4.58)、(540.85±5.97)、(208.98±5.06)、(174.45±5.00)ng/L,明显高于未转染组的(68.72±1.99)、(76.47±4.98)、(89.86±1.99)、(84.93±8.97)、(68.71±5.98)ng/L[t值分别为14.14、51.16、79.28、27.56、26.07,(均P＜0.05)],且5 d时达到高峰,此后表达开始下降.琼脂糖凝胶电泳可见在579 bp处见到高亮度条带,证明rAAV-VEGF165成功转染进MSC细胞中.转染后的生长曲线及细胞形态较未转染组无明显变化.Ⅷ因子染色示转染术后10 d组动物缺血区毛细血管密度[(9.35±2.72)条/视野]明显高于对照组[(1.05±0.50)条/视野]和干细胞组[(3.10±1.43)条/视野](均P＜0.01),较转染术后7 d组[(6.95±1.69)条/视野]亦有一定程度的升高(P＜0.05).结论 MSC有利于VEGF基因的稳定表达,可作为VEGF基因的良好细胞载体,且联合应用效果高于单独移植MSC,移植最佳时间为术后10 d.