阿魏酸钠诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的初步研究

目的 探讨阿魏酸钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能作用。方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，采用阿魏酸钠对其进行诱导培养，倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化，并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞表面神经细胞特异性标志物神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果 阿魏酸钠诱导培养6h后即可见细胞形态发生明显变化，24h后表现为典型的神经细胞样形态，NF和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达。结论 初步证实阿魏酸钠具有诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。     

以羊膜为载体应用β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的分离、培养与鉴定

目的:以羊膜为载体应用β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）定向分化成为神经样细胞,探讨组织工程化的神经细胞的构建。方法:分离、培养大鼠BMSCs,应用流式细胞仪进行细胞表面标志物检测及鉴定。以人羊膜基质为载体负载大鼠BMSCs,用β-巯基乙醇将其诱导定向分化成神经样细胞。应用免疫组织化学方法检测神经上皮干细胞蛋白nestin、神经元特异性标记物GAP-43的表达。结果:经流式细胞仪检测第3代BMSCs, CD90、CD71、CD29均呈现阳性表达,CD45呈现阴性表达。BMSCs接种羊膜后贴附生长,折光性好。经β-巯基乙醇诱导3 h后,细胞可见突起长出,形态呈典型神经细胞改变,nestin和GAP-43表达阳性,未诱导的细胞呈阴性。结论:以人羊膜基质为载体的大鼠BMSCs经β-巯基乙醇诱导后可以定向分化成神经样细胞,可构建出组织工程化的神经样细胞。     

人脐带间充质干细胞的分离鉴定及其修复缺血缺氧脑损伤作用

目的:研究人脐带间充质干细胞(UCMSCs)多向分化潜能,了解UCMSCs移植治疗脑缺血缺氧损伤(HIBD)大鼠的神经修复功能.方法:采用组织消化原代贴壁法分离培养人UCMSCs;取第4和10代UCMSCs进行流式细胞术检测间充质干细胞(MSCs)表面特异标志物表达;染色体分型检测染色体是否畸变;进行成神经、骨、脂诱导...     

大鼠脂肪干细胞源性神经球分化为雪旺细胞样细胞

目的:体外诱导大鼠脂肪干细胞为雪旺细胞样细胞?方法:分离?培养和鉴定大鼠脂肪干细胞;表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导大鼠脂肪干细胞为神经球,并对神经球进行鉴定;视黄酸?forskolin?血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)及heregulin等诱导神经球为雪旺细胞样细胞,并对雪旺细胞样细胞的形态和表面标志物进行鉴定?结果:大鼠脂肪干细胞为成纤维细胞样单层贴壁细胞,表达间质细胞标志物fibronectin,不表达神经干细胞标志物nestin,并能进行成脂和成骨分化?大鼠脂肪干细胞能被诱导为悬浮生长的神经球;神经球表达nestin,不表达fibronectin,并能进一步分化为雪旺细胞样细胞?雪旺细胞样细胞呈双极或三极,并表达雪旺细胞经典标志物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)?S100和p75?结论:大鼠脂肪干细胞能在体外分化为雪旺细胞样细胞?这种雪旺细胞样细胞对于治疗神经系统疾病具有重要意义?     

大鼠鼻窦黏膜干细胞的分离培养和成骨能力研究

目的明确大鼠鼻窦结构,尝试体外分离培养鼻窦黏膜干细胞,检测其多向分化能力,为口腔颌面部骨缺损修复治疗的体外研究寻找新的种子细胞。方法选用3月龄SD大鼠,进行口腔颌面部和鼻窦解剖,制作冠状位石蜡切片观察鼻窦形态和黏膜成分。取鼻窦内衬黏膜,改良酶消化法进行间充质干细胞(SMSCs)分离培养,检测其成克隆能力,使用流式细胞术进行间充质干细胞表面标志物鉴定。油红O染色检测SMSCs的成脂肪能力,茜素红染色和碱性磷酸酶(ALP)活性测试检验SMSCs的成骨能力,并与大鼠牙龈来源间充质干细胞(GMSCs)、大鼠骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)比较。结果 SD大鼠具有结构清晰的上颌窦,窦腔内衬黏膜呈现典型的三层结构。使用该内衬黏膜能够成功分离培养出具有多向分化能力和成克隆能力且带有间充质干细胞表面标志物的SMSCs细胞。在成骨培养基诱导下,SMSCs胞外基质矿化能力与GMSCs和BMSCs相比差异无统计学意义(P0.05)。但14天时SMSCs的ALP活性显著大于GMSCs(P0.05)。结论 SD大鼠鼻窦内衬黏膜可成功分离培养出具有体外成骨能力的间充质干细胞,为口腔颌面部骨组织工程研究提供新的细胞选择。     

大鼠胚胎后肾间充质干细胞体外诱导分化的实验研究

目的 研究大鼠胚胎后肾间充质干细胞(MMSCs)体外诱导分化的生物学特性.方法 原代分离培养后肾间充质干细胞,在体外特定诱导条件下观察细胞向成骨细胞、脂肪细胞及肾小管上皮细胞的分化及其形态演变,采用细胞免疫荧光检测细胞表面特定蛋白的表达变化.结果 大鼠后肾间充质干细胞在特定诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞及上皮细胞分化,免疫荧光结果显示分化后的上皮细胞E-cadherin蛋白表达明显增强,而vimentin、fibronectin的表达则明显降低甚至无表达.结论 大鼠胚胎后肾间充质干细胞在特定条件下有定向分化的能力,具有潜在分化为肾实质细胞的能力.     

人骨髓干细胞分离及其向神经细胞诱导分化的实验研究

目的研究骨髓间充质细胞向神经样细胞诱导分化的能力,探讨利用其治疗神经损伤疾病的可行性。方法采用直接分离培养法从人骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术对其细胞特性进行鉴定,化学诱导法诱导其向神经样细胞分化,免疫组化技术验证诱导细胞特性。结果成功获得骨髓间充质干细胞,免疫表型鉴定结果为CD73、CD90、CD105表达阳性,CD14、CD34、CD45表达阴性;免疫组化染色显示诱导分化的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、GFAP和成熟神经元标志物NSE等。结论骨髓间充质细胞在特定诱导因子作用下能向神经细胞表型转化,并能稳定表达神经细胞因子,可以作为神经损伤疾病组织工程的种子细胞来源。     

胚胎大鼠海马源性神经干细胞的分离、培养、分化和鉴定

目的:探讨胚胎大鼠海马源性神经干细胞(N SC)的分离、培养、分化和鉴定的方法。方法:机械分离出胚胎大鼠海马区细胞,以无血清培养基培养,再以血清培养基诱导其分化;在显微镜下观察其形态学特征,逆转录PCR(RT-PCR)和免疫荧光化学法检测神经干细胞和其诱导后细胞的表面标志物。结果:无血清培养基条件下培养的细胞在光镜下可见呈悬浮生长,易聚集成神经球,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到N SC表面标志物N estin的表达;经血清培养基诱导分化后,光镜下可见细胞呈贴壁生长,可见胞体呈树突状突起或呈梭形,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到星形胶质细胞的表面标志物GFAP和神经元细胞的表面标志物N SE的表达。结论:胚胎大鼠海马区分离的细胞具有N SC的特性,并能在含特定生长因子的无血清培养基保持其分化潜能,为进一步针对N SC的研究奠定了基础。     

血管内皮生长因子C诱导骨髓间充质干细胞分化为淋巴管内皮细胞的研究

目的 研究骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化的潜能及条件,为淋巴管再生和重建提供理想的细胞来源。方法 分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原CD31、CD14、CD29和CD90。将纯化的骨髓间充质干细胞加血管内皮生长因子C(VEGF-C)50ng/mL诱导培养10d,Western-blot法与免疫荧光染色法检测细胞中淋巴管内皮细胞标记物Prox-1和LYVE-1的表达。结果 骨髓间充质干细胞呈现典型的梭形和旋涡状排列;经VEGF-C诱导后,细胞变短、呈多边形。流式细胞学显示,分离培养的骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD90呈阳性表达,CD31、CD14呈阴性表达;Western-blot检测显示,经VEGF-C培养诱导后,细胞明显表达淋巴管内皮特异性标记物Prox-1和LYVE-1;免疫荧光染色显示,诱导后细胞均明显表达Prox-1和LYVE-1,而未分化的骨髓间充质干细胞Prox-1和LYVE-1均不表达。结论 VEGF-C可以诱导骨髓间充质干细胞表达淋巴内皮细胞特异性标记物,促进其向淋巴管内皮转化。     

人羊膜间充质干细胞抑制异体淋巴细胞增殖的实验研究

目的研究人羊膜间充质干细胞分离培养及免疫调节作用。方法从羊膜中分离和培养间充质干细胞,并通过形态学的结构特征及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度。建立双向混合淋巴细胞反应体系,根据不同效靶比E/T（hAMSCs/PBMC）加入丝裂霉素处理过的羊膜细胞,用3H掺入法测定淋巴细胞增殖率,观察间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。结果从羊膜组织成功培养出间充质干细胞,细胞贴壁生长,在体外短期内可以稳定增殖和传代,细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的表面标志,与混合淋巴细胞反应体系共同培养抑制了淋巴细胞增殖,其增殖抑制率与加入的细胞数量成正比。结论羊膜间充质干细胞可以抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞增殖,对同种异体免疫反应具有负调节作用。     

人羊膜间充质干细胞的研究进展

人羊膜间充质干细胞(hAMSC)具有来源丰富、分离简单的优点。hAMSC在组织修复中具有支持造血、再生、免疫调节、抗纤维化等作用。本文对羊膜间充质干细胞在各个系统疾病治疗的研究进行了综述,旨在为羊膜间充质干细胞的应用提供参考。     

以羊膜为载体体外培养大鼠角膜缘干细胞的实验研究

目的 比较角膜缘于细胞(LSCs)在不同羊膜上的生长情况,寻求LSCs体外培养的最佳载体.方法 取健康剖宫产孕妇胎盘的羊膜组织,分别制备保留上皮的新鲜羊膜、去除上皮的新鲜羊膜和冷冻羊膜.消化法分离大鼠LSCs后将其按相同浓度分别种植于3种事先准备好的羊膜载体和无载体孔中,分为4组.实验1组:保留上皮的新鲜羊膜组;实验2组:去除上皮的新鲜羊膜组;实验3组:去除上皮的冷冻羊膜组;对照组:无羊膜载体组.4组细胞分别作细胞凋亡检测,p63、PCNA免疫荧光检测,检测阳性细胞计数.结果 培养第3天,3个实验组培养的细胞排列紧密,融合形成单层,其中可见大小不等的团块状集落,细胞大小基本一致,多呈圆球形或卵圆形.对照组培养的细胞排列相对稀疏,基本融合,形成单层,可见散在的、大小不等的桑葚样细胞集落,集落细胞的生长特征及形态特点与实验组相似.实验组的细胞凋亡率均低于对照组,p63阳性率和PCNA阳性率均高于对照组(P＜0.01),尤以实验1组变化最为明显(P＜0.01).结论 羊膜载体有利于体外培养大鼠LSCs的扩增,保留上皮的新鲜羊膜能更好地维持体外培养LSCs的特性,是体外角膜缘干细胞培养的理想载体.     

羊膜上皮细胞促进共培养神经干细胞存活及分化

目的：探讨羊膜上皮细胞是否能在体外促进胚胎脑神经干细胞的存活及分化。 方法：Neurosphere法分离、克隆E12~14 d Wistar大鼠脑组织的神经干细胞,同时从羊膜中分离羊膜上皮细胞。将神经干细胞与羊膜上皮细胞在不同条件下共培养,通过免疫组织化学法对羊膜上皮细胞及神经干细胞的分化进行检测。 结果：羊膜上皮细胞表达神经干细胞及神经元、神经胶质细胞表面抗原;与羊膜上皮细胞共培养的神经干细胞克隆的分化细胞总数、分化为神经元的百分率及神经元初级突起长度明显高于对照组。 结论：羊膜上皮细胞与神经干细胞具有一定的同源性;羊膜上皮细胞能促进体外培养的神经干细胞的分化,且主要向神经元分化,并促进神经元初级突起的生长。提示羊膜上皮细胞为神经干细胞提供促进其分化及存活适宜的微环境。     

大鼠神经干细胞的培养和鉴定

目的：自新生第1天（P1期）和成年SD大鼠海马和纹状体分离培养神经干细胞。方法：分别分离P1期和成年SD大鼠海马和纹状体组织，制成单细胞悬液，利用无血清培养技术，在添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、表皮生长因子（EGF）和B27的DMEM／F12培养液中进行培养，形成神经球（neurosphere)后每8－10d传代1次，以免疫组织化学方法对原代和传代培养形成的神经球以及原代和传代培养的神经球分化后的细胞进行鉴定。结果：在上述条件下培养及传代的细菌不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈巢蛋白（nestin)阳性的神经球；神经球贴壁后分化的细胞表现为神经元和星形胶质细胞的形态，且分别呈神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性。结论：新生及成年SD大鼠的海马和纹状体存在神经干细胞。     

人羊膜间充质细胞的分离培养及向胰岛样细胞诱导分化

目的分离培养人羊膜间质细胞(hAMCs),初步探讨其向胰岛样细胞的诱导分化。方法羊膜组织经胰蛋白酶消化去除上皮细胞后,采用胶原酶I联合中性蛋白酶的方法分离hAMCs。细胞免疫荧光检测分离得到细胞表面标记Vimen-tin+,SSEA-4+表达;流式细胞仪检测CD29,CD90及CD34,CD45表达;RT-PCR检测ACTG2、ACTA2、MMP2、Cripto、Sox2、LEFTYA、nanog、Oct-4基因表达;添加诱导因子诱导hAMCs向胰岛样细胞分化。结果分离得到的hAMCs可体外长期传代,并保持稳定的遗传学特性;细胞表现vimentin+、SSEA-4+;CD29、CD90表达量分别为91.5%±9.93%和48.7%±9.47%;不表达CD34,CD45;表达ACTG2、ACTA2、MMP2和Cripto、Sox2、LEFTYA、nanog、Oct-4等基因。诱导后的细胞表达insulin、PDX1、ngn3、glucagon等基因,并表现insulin+。结论建立了人羊膜间充质细胞的分离培养方法;在体外可诱导分化为胰岛样细胞。     

人羊水源性间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的 体外分离培养人羊水间充质干细胞(HAFMSCs),观察生物学特性,并鉴定其多向分化能力.方法 采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用MTT法观察细胞增殖能力.FACS检测表面抗原CD29,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90,HLA-ABC,HLA-DR等的表达.RT-PCR法分析细胞中OCT-4,Nanog mRNA水平的表达.用成脂、成骨、内皮细胞培养基对HAFMSCs进行诱导,并分别采用油红O,Yon Kossa染色及细胞免疫荧光染色检测其分化能力.结果 羊水细胞于2-3d开始贴壁,10-15d形成细胞集落.传至第3代HAFMSCs呈旋涡状排列,生长曲线呈S形.FACS检测显示CD29,CD44,CD73,CD90,HLA-ABC表达阳性,CD34,CD45,HLA-DR表达阴性,RT-PCR法检测显示HAFMSCs中OCT-4、Nanog mRNA的表达阳性.成脂、成骨诱导21d后油红O、Von Kossa染色阳性,成内皮细胞诱导4周后细胞免疫荧光染色检测vWF抗体表达阳性.结论 成功分离培养出HAFMSCs,细胞具有干细胞特征,具有多向分化潜能.     

miR-1721靶向CD44抑制前列腺癌PC-3细胞增殖、侵袭和肿瘤干细胞形成的研究

目的 探讨miR-1721靶向抑制CD44的表达及对前列腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响。方法 构建CD44 mRNA 3′-非翻译区(3′-UTR)的荧光素酶报告载体系统,通过荧光素酶系统确定miR-1721对CD44 mRNA 3′-UTR的靶向关系;脂质体转染法将miR-1721模拟物转入前列腺癌PC-3细胞中,Western印迹法检测转染后CD44蛋白表达水平的改变;MTT法检测miR-1721mimics对PC-3细胞增殖能力的影响,Transwell小室法检测其对肿瘤细胞袭侵袭能力的影响;通过干细胞成球实验检测miR-1721mimics对前列腺癌干细胞样微球体形成的影响。结果 miR-1721能特异性地与CD44 mRNA 3′-UTR结合,抑制其荧光素酶的活性,干细胞标记基因CD44是miR-1721的靶基因。过表达miR-1721的PC-3细胞中CD44蛋白表达水平明显降低,可显著抑制PC-3细胞的侵袭能力,同时过表达CD44可负调控miR-1721对PC-3细胞增殖和侵袭能力的影响;干细胞成球实验证实,miR-1721能显著抑制前列腺癌细胞PC-3干细胞的微球体形成能力。结论 miR-1721通过靶向调控CD44的表达而抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭能力及干细胞的形成能力。     

胚胎大鼠神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨胚胎大鼠神经干细胞培养，传及鉴定方法。方法：从胚胎大鼠脑室下区（SVZ）组织分离得到神经干细胞，采用无血清培养技术进行培养，并诱导分化，采用SABC法对分化后后的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸蛋白（GFAP）检测及姬姆萨染色进行细胞鉴定。结果：成功培养出了胚胎大鼠神经干细胞，培养出的细胞具有自我更新能力的增殖能力，可分化为神经元，神经胶质细胞及少突胶质细胞，结论：胚胎大鼠神经干细胞在体外适宜的培养条件下具有自我更新，增殖和多向分化潜能。     

MSCs定向诱导分化为软骨细胞实验研究

目的：体外诱导骨髓间充质干细胞（MSC）向软骨细胞定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定方法：由健康兔子骨髓中分离出MSC,取第4代细胞进行实验。鉴定后,将细胞在地塞米松,bFGF,维生素C及TGF-B等诱导下分化后,通过RT-PCR检测Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达结果：诱导分化后的MSC可表ColⅡ的mRNA。结论：MSC在地塞米松,bFGF,维生素C及TGF-B等诱导后,可分化为软骨细胞。     

大鼠胎血间充质干细胞的体外扩增及诱导分化为神经元样细胞的研究

目的：研究大鼠胎血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分离、扩增及向神经元样细胞分化的可能性,为进一步的动物实验研究打下基础。方法：无菌条件下采集15只孕20d大鼠的胎血,Ficoll-hvpague分离液分离出单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)后,置于含10％胎牛血清的DMEM／LG培养传代。细胞化学染色法检测MSCs的细胞化学特征,流式细胞仪检测其免疫表型。取扩增第5代的MSCs向神经元样细胞定向诱导,免疫细胞化学法鉴定其特异性标志。结果：大鼠胎血MSCs可大量扩增,细胞化学染色示其α-丁酸萘酚酯酶(NBE)阳性,碱性磷酸酶(ALP)阴性,流式细胞仪检测显示其表达CD44、CD54,不表达CD11b、CD45。诱导后MSCs形态学观察类似于神经元,免疫细胞化学检测发现其巢蛋白(Nestin)和特异性烯醇化酶(NSE)阳性,胶原纤维酸性蛋白(GFAP)阴性。结论：大鼠胎血能够分离、扩增培养出MSCs,在适当条件下可向神经元样细胞定向诱导分化,大鼠胎血可作为MSCs的来源进一步做动物实验。