一种可靠的大鼠肝星状细胞分离及培养方法

目的探讨一种高效、经济、稳定的肝星状细胞的分离方法,为肝纤维化研究提供细胞模型。方法应用链霉蛋白酶、胶原酶灌流,以Nycodenz为分离介质,采用密度梯度离心法分离大鼠的肝星状细胞。结果肝星状细胞的获得率为(3.2±0.67)×10~7/只、存活率为90%以上。结论该法是一种较理想的分离肝星状细胞的方法。     

一种改良的肝星状细胞分离方法

目的改良肝星状细胞（HSC）的分离方法,为深入研究肝纤维化的发生机制奠定基础。方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位消化肝脏,在1．040～1．060g／mL范围内多重多次密度梯度离心分离HSC,台盼蓝染色测定细胞存活率,328nm紫外光激发HSC自发蓝绿色荧光法和Desmin细胞免疫荧光法鉴定HSC及检测HSC纯度。Desmin和n—SMA细胞免疫荧光方法鉴定HSC静息和活化状态。结果每只大鼠肝脏HSC得率为（3～5）×10^7个,HSC存活率在95％以上,纯度在90％以上,体外培养14d后活化的HSC纯度几乎达100％。结论在1．040～1．060g／mL密度范围内采用多重多次密度梯度离心方法,避免了HSC分离过程中因密度配比误差及HSC自身密度相对不均一性所导致的细胞流失,建立了一种改良的肝星状细胞分离方法,HSC得率和纯度更加稳定,达到国外文献报道水平。     

三种方法体外同步分离培养大鼠肝枯否细胞和星状细胞的比较

目的比较淋巴细胞分离液（LS）、Percoll液（PS）和Nycodenz液（NS）同步分离培养大鼠肝枯否细胞（KC）和星状细胞（HSC）的优缺点。方法①采用链酶蛋白酶E、胶原酶Ⅳ联合原位灌流消化，分别以LS、PS和NS的非连续密度梯度离心法同步分离培养大鼠KC和HSC。②碳素墨汁吞噬试验鉴定KC；α-SMA免疫细胞化学染色法鉴定HSC。③倒置相差显微镜下观测细胞形态，台盼蓝染色显示细胞活性，计数后计算细胞的得率、存活率和纯度。结果体外成功地同步分离培养了KC和HSC；培养的KC吞噬功能明显，而传代HSCα—SMA免疫细胞化学染色阳性者几乎达100％；采用PS或NS体外同步分离KC的细胞得率和纯度均显著高于采用LS分离细胞所得（P〈0．01），而采用NS体外同步分离肝KC的细胞存活率显著高于PS或LS分离细胞的存活率（P〈0．05）；分别采用LS、PS和NS同步分离HSC，三者的细胞存活率逐次升高（P〈0．05或P〈0．01），而使用LS同步分离的细胞虽然细胞得率比较高（P〈0．05），但其细胞纯度较使用PS和NS明显降低（P〈0．05），PS和NS分离获得的HSC得率和纯度均无明显统计学差异。结论采用Percoll液和Nycodenz液体外同步分离培养大鼠肝KC和HSC效果好，且后者的细胞存活率最高。     

肝星状细胞与肝纤维化

肝纤维化是各种慢性肝病损伤修复过程的共同结果,由于肝内纤维生成和降解失衡,导致过多的胶原在肝内沉积,常伴有炎症、缺血缺氧,最终可发展为肝硬化。目前认为,细胞外基质（ECM）过多产生和沉积是肝纤维化的核心表现,活化的肝星状细胞（HSC）仍是细胞外基质的主要细胞来源。因此,肝星状细胞的活化是肝纤维化发生的中心环节。     

肝星状细胞与肝纤维化

1　肝纤维化的基本概念(1)肝纤维化是指各种原因所致的肝脏内纤维结缔组织增生,其特征为大量细胞外基质在Ｄｉｓｓｅ间隙沉积。(2)肝纤维化时不仅细胞外基质含量增加,而且细胞外基质的组成成分也发生了改变,正常肝脏Ｄｉｓｓｅ间隙细胞外基质是构成基底膜的成分,而肝纤维化时细胞外基质为形成纤维的胶原和纤维连接蛋白〔1〕。(3)在各种原因引起的肝纤维化中,肝脏细胞外基质含量均增加,但原因不同的肝纤维化早期,其肝脏增加的细胞外基质分布是不同的,如病毒性肝炎引起的肝纤维化主要分布在门脉区,而酒精引起的肝纤维化主要分布在中央静脉周围…     

去甲肾上腺素对大鼠肝星状细胞作用的实验研究

目的 探讨交感神经系统在肝纤维化发生和发展中的作用. 方法采用免疫荧光和RT-PCR检测体外培养的肝星状细胞(HSC)中α1、β2-肾上腺素能受体的表达;用四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度的去甲肾上腺素(NE)对HSC增殖活性的影响.同时用RT-PCR检测受NE作用后HSC的活化指标胶原蛋白-1、转化生长因子β(TGF β)及α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达.用高效液相色谱-电化学法测定活化的HSC中交感神经递质NE的水平. 结果α1和β2-肾上腺素能受体表达于HSC的胞膜和胞质内;NE可呈剂量依赖性地促进HSC增殖,在浓度为100μmol/L时达到最大效应,F=140.464,P<0.05,差异有统计学意义.以NE 100 μmol/L作用细胞24h后,可显著促进反应HSC活化的指标上升,胶原蛋白-1表达为0.3022±0.0610,TGF β表达为2.2080±0.2151,α-SMA mRNA表达为0.5469±0.0108,与对照组胶原蛋白-1(0.1040±0.0556)、TGF β(1.1190±0.0070)、α-SMA mRNA表达(0.0759±0.0449)比较,t值分别为-4.160、-8.763和-17.651,P值均<0.05,差异均有统计学意义.HSC可以合成并释放NE,且受血小板衍生生长因子(10ng/ml)刺激后HSC中NE含量为(14.24±0.21)ng/ml,对照组为(11.34±0.15)ng/ml,两组比较,t=-32.907,P<0.05,差异有统计意义.结论 抑制交感神经系统使HSC活性降低对临床上治疗肝纤维化有一定的指导意义.     

改良大鼠肝星状细胞分离及性质鉴定

目的探索经济、稳定的肝星状细胞提取和培养方法。方法采用胶原酶改良原位循环灌流、18%Nycodenz密度梯度离心法分离大鼠肝星状细胞,胎牛血清DMEM培养星状细胞;desmin、αSMA和ICAM1免疫细胞化学检测进行星状细胞性质鉴定。结果肝星状细胞的得率稳定在3.5×107/肝以上,纯度为96%～98%左右,存活率为96%～98%。结论建立了经济、稳定的大鼠肝星状细胞提取和培养方法;传代培养可获得较为稳定的细胞系。     

氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的探讨氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响及其抗肝纤维化的机理.方法用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流消化正常大鼠肝脏,Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞,以MTT比色法观察氧化苦参碱对肝星状细胞毒性作用,3H-TdR法观察氧化苦参碱对肝星状细胞增殖的效应.结果氧化苦参碱浓度＞10-5mol/1时对肝星状细胞增殖有抑制作用(P＜0.05).结论氧化苦参碱可抑制肝星状细胞的增殖,有抗肝纤维化的作用.     

Apoptosis of hepatic stellate cells in carbon tetrachloride induced acute liver injury of the rat: analysis of isolated hepatic stellate cells

BACKGROUND/AIMS: Analysis of isolated hepatic stellate cells (HSCs) from the injured liver may provide direct information on HSC apoptosis. However, it has not been established whether apoptotic HSCs would be isolated using the usual density gradient centrifugation method. The aim of this study was to observe the serial pattern of proliferation and apoptosis in isolated HSCs in comparison with that of liver tissue sections in CCl4 induced acute liver injury. METHODS: Male Sprague-Dawley rats were treated with a single intraperitoneal injection of carbon tetrachloride (CCl4) and were killed at various time points after the treatment. RESULTS: HSC proliferation showed a maximal increase at 32 h after CCl4 injection. Apoptosis of HSC, examined by quantitative analysis of annexin-V-fluorescein isothiocyanate (FITC)staining, showed the maximal increase at 64 h. Apoptosis of HSC in liver tissue sections examined by counting desmin and Tdt-mediated-dUTP biotin nick end labeling (TUNEL) double staining cells, peaked at 64 h. The number of TUNEL positive HSCs in liver tissue sections correlated significantly with annexin-V-FITC binding of isolated HSC. CONCLUSIONS: Studying apoptosis using apoptotic HSCs isolated by a usual density gradient centrifugation method from injured tissue sections would be feasible since it correlated with in vivo apoptosis of HSC.     

PARs对肝纤维化大鼠HSC活化和增殖的调控作用

目的探讨蛋白酶活化受体（proteinase—activated receptors，PARs）对大鼠肝组织中肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化和增殖的调控及其在肝纤维化中的作用。方法应用改良的Friedman方法和Nycodenz一步密度梯度离心法分离和培养结扎胆管诱导的肝纤维化sD大鼠HSC。观察HSC形态学变化，MTT法观察细胞的增殖能力，Western blotting检测a—SMA、PAR1和PAR2在HSC的表达，同时设立正常对照组和假手术组。结果随着培养HSCs时间的延长，HSC的VitA和脂滴逐渐减少，甚至消失，HSC形态发生改变呈星状，细胞增殖活跃，而a—SMA、PAR1和PAR2随着培养时间延长其表达逐渐增强，原代培养14天达到高峰。a-SMA与PAR1和PAR2的表达呈一致关系。结论PARs可促进a-SMA的表达，PARs表达与HSC的活化和增殖相关，参与了肝纤维化的形成。     

Resistin mediates the hepatic stellate cell phenotype

AIM: To describe the role of resistin in liver fibrosis. METHODS: For the in vivo animal study, Sprague Dawley rats were subjected to bile duct ligation (BDL) for 4 wk. Rat liver, adipose tissue (epididymal fat) and serum were analyzed for resistin expression. For the in vitro experiment, rat primary hepatic stellate cells (HSCs) and Kupffer cells (KCs) were used. HSCs were exposed to recombinant resistin, and collagenⅠ, transforming growth factor β1, α smooth muscle actin, tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and connective tissue growth factor expression were analyzed. Resistin gene and protein expression was quantified as was the expression of pro-inflammatory cytokines including tumor necrosis factor α (TNFα), interleukin (IL)-1, IL-6, IL-8 and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1). The effects of resistin on HSC proliferation, migration and apoptosis were determined. The effects of resistin on KCs were also investigated. RESULTS: Following BDL, rat epididymal fat and serum rather than liver showed higher resistin expression compared to control rats. In liver, resistin was expressed in quiescent HSCs and KCs. Resistin treatment resulted in enhancement of TNFα , IL-6 , IL-8 and MCP-1 gene expression and increased IL-6 and MCP-1 protein in HSCs. Resistin activated HSC phospho-MAPK/p38, and p38 inhibition diminished IL-6 and MCP-1 expression. Furthermore, resistin facilitated HSC proliferation and migration, but decreased apoptosis which was via an IL-6 and MCP-1 mechanism. Finally, resistin-induced transforming growth factor β1 from KCs enhanced HSC collagenⅠexpression. CONCLUSION: Resistin directly and indirectly modulates HSC behavior towards a more pro-fibrogenic phenotype.     

肝星状细胞及相关细胞因子在肝纤维化形成中的作用

肝纤维化(hepatic fibrosis)是指肝脏内弥漫性细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积的病理过程.肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)被认为是ECM的主要来源细胞,在肝纤维化发生发展中起着关键作用.另外,各种病因引起肝细胞损伤时,Kupffers细胞(KF),肝窦内皮细胞等分泌一系列细胞因子,通过旁分泌和自分泌方式作用于邻近的HSC,影响其增殖,趋化和ECM代谢.因此,HSC及细胞因子与肝纤维化的发生发展关系极为密切,阐明其关系,有助于以HSC为靶点的肝纤维化方面的研究,现就其关系分别综述如下.     

肝星状细胞的可塑性及其对肝纤维化的意义

在肝纤维化形成过程中,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)发挥着重要的作用.基础和临床研究结果显示,在特殊的内环境因素的影响下HSC具有朝多方向分化的潜能.对HSC命运的干预能够在一定程度上预防肝纤维化的发生,甚至逆转肝纤维化,因此HSC的可塑性研究可能为慢性肝病治疗开辟一条新途径.本文就HSC的起源、结构、可塑性及其对肝纤维化的潜在治疗意义作一综述.