从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛（Dig）人单链抗体（ADA ScFv）,为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体。方法：①以改良法制备Dig-BSA偶联物②以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选,通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性,通过ELIS竞争抑制实验分析其特异性,对阳性克隆的DNA进行测序分析。结果：①在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集;②获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆;③阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群。结论：利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADA ScFv,经过一步分析及抗体工程改造后,有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体。     

从噬菌体抗体库克隆抗人RBC单链抗体基因

目的用噬菌体抗体库技术克隆抗人红细胞（ＲＢＣ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）基因。方法以人ＲＢＣ免疫小鼠，取脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＶＨ和Ｖκ基因，组装到ＳｃＦｖ－噬菌体抗体表达载体中，构建了噬菌体抗体库，以人ＲＢＣ为固相抗原，对该库进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，获得了抗人ＲＢＣ的ＳｃＦｖ基因。结果ＤＮＡ序列分析表明其可变区基因分别属于小鼠ＶＨⅢ亚群和ＶκⅤ亚群。结论所表达的ＳｃＦｖ可与不同人ＲＢＣ结合，与ＡＢＯ血型抗原无关，可用于构建快速血凝诊断的工程抗体     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

目的 研究人源抗甲型肝炎病毒基因工程抗体,为预防甲型肝炎病毒感染提供有效的方法。方法 采用噬菌体表面展示技术,从一名甲型肝炎恢复期病人的抗凝血中分离淋巴细胞,提取总ＲＮＡ逆转录后,用一组人ＩｇＧ Ｆａｂ特异性引物扩增。结果 克隆和表达了８株人源抗甲型肝炎病毒抗体Ｆａｂ段基因,经ＥＬＩＳＡ检测为特异性人抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ段抗体。结论 该８株人源抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ抗体都能与具有中和活性的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应,选其中的２株做体外中和实验,证明都有中和甲型肝炎病毒的活性。     

从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体1

目的从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛(Dig)人单链抗体(ADAScFv),为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体.方法1以改良法制备Dig-BSA偶联物;2以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选,通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性,通过ELISA竞争抑制实验分析其特异性,对阳性克隆的DNA进行测序分析.结果1在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集;2获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆;3阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群.结论利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADAScFv,经进一步分析及抗体工程改造后,有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体.     

从噬菌体抗体库筛选人源性抗白细胞介素8抗体

目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL- 8单链抗体(scFV)。方法: 采用原核表达载体pRSET- IL- 8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL- 8 His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化。以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行 3轮淘筛, 并对所获阳性克隆进行抗原结合活性测定和DNA序列测定。结果: 获得 2株特异性抗IL- 8噬菌体抗体。对其DNA序列测定结果表明, 其VH基因均属于人IgGVH3亚群, Vλ基因分别属于人VλDPL5和VλDPL2亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术可不经免疫制备人源性抗IL- 8抗体, 为银屑病及相关疾病的临床应用提供了条件。     

抗SARS-CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库的构建

目的 :利用抗SARS冠状病毒IgG抗体阳性的SARS康复患者外周血淋巴细胞 ,构建人源Fab段抗体文库。方法 :制备外周血淋巴细胞总RNA ,逆转录成cDNA。以其为模板 ,利用针对家族特异性Ig基因的引物扩增重链Fd段和轻链基因 ,并重组到噬菌粒载体pComb3中 ,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL 1Blue,酶切鉴定抗体库的重组率 ,并测定噬菌体抗体库的库容量。结果 :构建了源于SARS康复患者血清中抗Fab段的抗体文库 ,轻链、重链Fd段基因的重组率分别为91%和 75 % ,库容量为 7.2 3× 10 7。结论 :成功地构建了抗SARS CoV抗原的人源Fab段噬菌体抗体库     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

从scFv噬菌体库分离特异性的人源化抗D-dimer抗体

目的 从scFv(单链Fv)噬菌体抗体库分离出对D-dimer有特异性的人源化单克隆scFv.方法 对Tomlinson scFv噬菌体文库进行3轮淘洗,富集特异性的抗D-dimer抗体并进行ELISA 验证.通过酶联免疫检测和双脱氧终止法基因测序,获取特异性的人源化单克隆抗体.结果 3轮淘洗选择出38个抗D-dimer噬菌体抗体,酶联免疫和基因测序分析后,20个不同的全长单克隆抗D-dimer scFv噬菌体抗体被筛选出来,3轮选择后阳性克隆获取率为100%;分泌性抗体ELISA结果显示单克隆anti-D-dimer噬菌体顺利表达了抗体蛋白;5个A450值较高的单克隆中,3个显示了对D-dimer的高特异性和亲和力.结论 抗体噬菌体展示技术是分离获取人源化特异性anti-D-dimer抗体的高效快速方法.

Abstract：

Objective To isolate specific humanized anti-D-dimer scFv(single chain Fv) antibody from scFv phage libraries. Methods Isolate anti-D-dimer positive clones from Tomlinson I + J phage libraries by three rounds of panuing, then sequence monoclonal genes by bideoxy-mediated chain termination and express soluble scFv antibody; Pick out anti-D-dimer antibodies with high specificity and affinity by ELISA.Results After three rounds of selection from human scFv phage libraries Tomlinson I and J, 38 monclonal specific anti-D-dimer scFv fragments were selected. By polyclonal and monoclonal phage ELISA and gene sequencing, 20 different full-length monoclonal scFv phages were identified, the result of soluble scFv ELISA showed that 20 full-length monoclonal scFv were expressed smoothly. According to the result of soluble scFv ELISA, in 5 scFv antibodies with high value of A450 selected, 3 scFv antibody fragments showed high specific and affinity. Conclusion Antibody phage display was an effective, rapid method to isolate anti-D-dimer antibodies with high specificity and affinity.     

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体

目的:用黑素瘤(MM)细胞系筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与MM细胞特异性结合的人源性单链抗体(scFv)。方法:用完整的MM细胞对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,并通过细胞ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步做DNA序列测定和免疫组化染色鉴定。结果:从80个随机挑选的克隆中,筛得1株抗MM细胞的抗体,该抗体对人的鳞癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、角蛋白、胰蛋白酶、转铁蛋白及小鼠IgG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性。免疫组化染色显示,该抗体与MM细胞系Libr的染色呈阳性,对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性。DNA测序结果表明,该抗体VH属于人IgGVH5亚群,VL属于人Vκ亚型。结论:通过筛选噬菌体抗体库获得到1株抗MM细胞的特异性抗体,为MM的靶向治疗研究奠定了基础。     

人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选

用聚合酶链伸反应从人外周血淋巴细胞克隆出Ｆｄ段和ｋ链基因，重组到表达载体ｐＣＯＭＢ３中，构建了人源性噬菌体抗体，将乙肝病毒表面抗原固相化对噬菌体抗体库进行了三轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，使特异性噬菌体抗体得到了富集，筛选到了抗ＨＢｓＡｇ的人单抗。     

抗人膀胱癌噬菌体单链抗体的初步制备

应用ＰＣＲ方法，从杂交瘤细胞中扩增鼠抗人膀胱癌抗体重、轻链可变区基因，经ＤＮＡ接头连接后与噬菌粒ｐＣＡＮＴＡＢ５重组，转化大肠杆菌后制备噬菌体抗体文库，通过亲和筛选、再转染、克隆化及鉴定，得到高亲和力抗人膀胱癌噬菌体单链抗体。     

白纹伊蚊T7噬茵体展示cDNA文库的构建

为筛选白纹伊蚊与相关蚊媒病毒相互作用的基因,本文构建了白纹伊蚊Aedes albopictusT7噬菌体展示eDNA文库,分离与纯化白纹伊蚊mRNA,所得mRNA经反转录合成双链cDNA后,在双链cDNA末端加上定向EcoRI／HindIn接头使其两端分别带EcoRI和Hind11I黏性末端;接着用MiniColumn纯化收集300bp以上的双链cDNA片段连接于T7 Select 10—3b载体;经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建1v7噬菌体展示cDNA文库。所建文库的库容量经测定为1．7×10’pfu／mL,扩增后文库滴度为2．5×10^（15）pfu／mL。对从原始文库中随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为95％以上;阳性克隆片段长度分布在200～2000bp,其中有90％的插入片段大于300bp。本文所构建的白纹伊蚊T7噬菌体展示cDNA文库,满足cDNA文库的基本要求,可以用于筛选白纹伊蚊与相关蚊病毒相互作用的基因。     

人源抗HBsAg单克隆抗体组合文库的建立

应用固相抗原筛选法，建立了人抗ＨＢｓＡｇ单克隆抗体组合文库。以液相ＨＢｓＡｇ包被酶标板，对抗ＨＢｓＡｇ血清阳性供者文库经多次筛选，扩增，建立起针对ＨＢｓＡｇ的组合抗体子文库。     

从噬菌体12肽库筛选旋毛虫抗原模拟表位

为研究和开发新的旋毛虫病诊断抗原和疫苗 ,以纯化旋毛虫病患者血清免疫球蛋白 (Ts Ig)对噬菌体1 2肽库进行 5轮筛选获得旋毛虫抗原模拟表位 ,随机挑选 2 4个克隆 ,通过ELISA选取吸光度 (A)较高的 6个克隆 (T1～T6 )并检测其灵敏性和特异性。结果显示 :T1～T6灵敏性与旋毛虫幼虫抗原 (TsA)相同 (阳性反应率 :1 0 0 % ,P >0 0 5 ) ,特异性与TsA无明显差异 (阳性反应率 :0～ 4 0 % ,P >0 0 5 ) ,其中T3,T6与肺吸虫病患者血清无交叉反应 ,特异性高于TsA(P <0 0 5 ) ,T6与日本血吸虫病患者血清无交叉反应 ,特异性亦高于TsA(P<0 0 5 ) ,证实利用噬菌体 1 2肽库可以成功地筛选到旋毛虫抗原模拟表位 ,为旋毛虫病诊断抗原和疫苗的研究和开发提供了新的研究途径     

人源性抗HBsAg单克隆抗体Fab片段的表达与纯化

对已筛选到的人源性抗ＨＢｓＡｇ特异性噬菌体抗体基因文库进行表达研究，将特异性噬粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，反复冻溶法制备可溶性Ｆａｂ片段。免疫印迹实验表明大肠杆菌质周腔内有可溶性Ｆａｂ片段的表达。制备羊抗人ＩｇＧ Ｆａｂ抗血清，建立抗人ＩｇＧ Ｆａｂ抗体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析柱，纯化Ｆａｂ片段。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示纯化的Ｆａｂ达免疫纯，点印迹法表达纯化后的Ｆａｂ片段具有中和ＨＢｓＡ     

从人外周血淋巴细胞扩增抗体可变区基因的3种方法

介绍了从人外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）以传统方法提取总ＲＮＡ再行反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、以Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ提取ＲＮＡ再行ＲＴ－ＰＣＲ以及细胞内直接ＲＴ－ＰＣＲ等３种方法扩增人抗体可变区（Ｖ区）基因的方法并作了比较。３种方法均扩增出了人抗体ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ基因，从方法的简便及结果的可靠等方面综合考虑，作者推荐以Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ提取ＲＮＡ再行ＲＴ－ＰＣＲ扩增的方法。     

人胃癌细胞系BGC—823不同转移能力的细胞克隆间的细胞微丝结构特征研究

用单细胞培养法，从人胃癌细胞系ＢＧＣ－８２３中分离出１０个克隆。通过裸鼠致瘤和转移检测，进一步筛选出具有较高转移性的Ｃ１、Ｃ６和低转移的Ｃ５、Ｃ８等４个细胞株。它们的生长能力虽无明显差异，但超微结构显示Ｃ５和Ｃ８细胞表面微绒毛少，而且长度不一，微丝长而粗，将列规则，组装程度较好；Ｃ１和Ｃ６细胞微绒毛多而密集，长度均一，微丝短而粗，呈点状或玫瑰状小体，组装程度差，此外本研究显示肿瘤细胞内的微丝骨架组     

丝裂霉素C-CEA单抗偶联物对人结肠癌导向治疗的实验研究

丝裂霉素C-癌胚抗原单抗偶联物对人结肠癌有选择性杀伤作用。体外细胞毒试验证实,丝裂霉素C-癌胚抗原单抗偶联物比丝裂霉素C-正常γ球蛋白偶联物,癌胚抗原单抗,丝裂霉素C(游离)的细胞毒性都高。对植入性裸鼠人结肠癌模型疗效较好,潜伏期开始治疗的结肠癌抑瘤率为76.9％(P<0.01),生长期开始治疗的结肠癌抑瘤率为52.6％(p<0.05);治疗后瘤细胞密度明显减小(P<0.01),核分裂指数有非常显著差异(P<0.01),瘤细胞坏死程度明显增高。     

鼠抗人Fas单克隆抗体的制备及鉴定

采用Ｊｕｒｋａｔ细胞Ｂａｌｂ／ｃ小鼠制备１株抗人ＦａｓｍＡｂ２Ａ１,它能特异性识别Ｊｕｒｋａｔ,Ｒａｊｉ,ＴＨＰ－１细胞膜表面５０ＫＤ左右的蛋白,并能与ＳｒＦａｓ标准蛋白反应,其识别的细胞膜蛋白与单抗特异性抗人Ｆａｓ ＰｃＡｂＮ－１８相一致。ｌｅｑ