自身抗原Ro 52 kd多肽分子cDNA表达克隆的构建及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ法克隆自身抗原Ｒｏ５２ｋｄ多肽分子的ｃＤＮＡ，定向插入表达载体ＰＧＥＸ－４Ｔ－１，并导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，经免疫印迹法表明，重组融合蛋白具有Ｒｏ５２ｋｄ的抗原性。这为今后对Ｒｏ５２ｋｄ抗原表位的精确定位，分析特定抗原表位与疾病的相关性及制备重组抗原用于临床检测奠定了基础。     

自身抗原SSA/Ro-52kD抗原优势表位分析

探讨自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ的抗原优势表位,为疾病机制的研究提供依据,根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析。采用ＰＣＲ法克隆自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ多肽片段的ｃＤＮＡ,定向插入表达载体ＰＧＥＸ－５Ｘ－１,并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白,用ＧＳＴ亲和层析柱进行纯化,经免疫印迹法与病人阳性血清进行反应,结果表明片段Ｒｏ５２３具有较强的抗原性,这提示ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ的抗原优势表位     

自身抗原52 kD-Ro/SSA的序列分析及抗原性预测

目的：分析自身抗原５２ｋＤ－Ｒｏ／ＳＳＡ的序列结构，预测其抗原位点。方法：将自身抗原５２ｋＤ－Ｒｏ／ＳＳＡ的氨基酸序列输入“蛋白质结构预测”软件包，分析蛋白质分子生、表面可及性、柔性，并模拟其二级结构，预测其主要抗原位点。结果：自身抗原５２ｋＤ－Ｒｏ／ＳＳＡ是多抗原位点，其氨基酸序列中１２０￣１３０、３００￣３２０、３６０￣３８０位间抗原性较强。结论：确定５２ｋＤ－Ｒｏ／ＳＳＡ的抗原优势表位，为研     

SS—A／Ro抗原分子生物学特性及其临床意义

ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗原为细胞内ＲＮＡ－蛋白质复合体的一种，依赖细胞功能状态的不同分别存在于细胞核和细胞浆内。该抗原主要由连接四种ＲＮＡ（ｈＹ１，ｈＹ３，ｈＹ４，ｈＹ５）的５２ＫＤ和６０ｋＤ蛋白多肽组成。ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗原自身抗体存在于多种结缔组织疾病中，尤其是系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）及干燥综合症（ＳＳ）。ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗体可作为新生儿红斑狼疮（ＮＬＥ）的血清学标志，在病理过程中可能起一定作用。ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗原分子克隆的成功不仅为研究该抗原的结构特征提供了新的手段而且提供了大量用于检测ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗体的纯化抗原。     

自身抗原Ro60kD重组融合蛋白的纯化和鉴定

将表达Ro60kD GST融合蛋白的重组体导入大肠杆菌JM109 中表达重组抗原, 经GST亲和层析柱纯化后用标准抗Ro血清鉴定, 经免疫印迹法证实, 纯化重组蛋白具有Ro 抗原性, 该抗原可用于临床检测及研究抗原表位与疾病的相关性     

抗人TNF-α单克隆抗体抗原识别表位的初步研究

目的：确定抗人肿瘤坏死因子－α（hTNF－α）单克隆抗体（Z8）识别的抗原表位所在区域。方法：分别构建缺失hTNF－α不同部位的重组质粒，用IPTG诱导表达融合蛋白，对表达产物进行SDS－PAGE蛋白电泳及Western blot分析。结果：Z8特异性识别含有hTNF－αC端92－157位氨基酸在内的融合蛋白，而不识别GST及其与hTNF－αN端1－91位氨基酸所形成的融合体，结论：Z8抗体识别的抗原表位位于hTNF－α 92－157区。     

自身抗原SSB/La抗原优势表位分析

探讨自身抗原Ｌａ的抗原优势表位，为疾病机制的研究提供依据。方法：根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析，采用ＰＣＲ法克隆自身抗原Ｌａ多肽片段的ｃＤＮＡ，定向插入表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ，并且导入大肠杆菌中表达重组事蛋白，用ＧＳＴ亲人事层析柱进行纯化，经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应，结果：ＳＳＢ／Ｌａ的抗原优势表位主要存在于１－２８、８０－１０７，１０８１８８，２８３－３３８位。不同病人在不同病程     

表达人自身抗原SSA/Ro60重组体的构建及鉴定

目的：构建表达人自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ６０的重组体,为研究自身免疫病中的抗原体作用提供物质基础。方法：采用逆转录－ＰＣＲ技术克隆自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ６０ ｃＤＮＡ,定向插入表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ,并经酶切电泳,ＤＮＡ测序鉴定分析。结果：经鉴定,证明成功构建了表达人自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ６０的重组体。结论：ＳＳＡ／Ｒｏ６０表达型重组体可用于自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ６０的大量生产并用于诊断。     

自身核抗原U1SnRNP70kD多肽分子中U1RNA结合功能区的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究采用逆转录－ＰＣＲ技术克隆自身核抗原Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ多肽分子中Ｕ１ＲＮＡ结合功能区（Ｕ１ＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，Ｕ１ＢＤ）的ｃＤＮＡ，经ＤＮＡ测序证实以后定向插入原核表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ，进而导入大肠杆菌中表达重组蛋白。免疫印迹法研究表明：９６％（４８／５０）的抗Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗体阳性血清能够识别该重组蛋白，证实Ｕ１ＢＤ重组蛋白具有Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗原性，而且Ｕ１ＢＤ是Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ多肽上主要抗原表位区域，能够被大多数抗Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗体阳性血清识别。这为今后对Ｕ１ＢＤ抗原表位精确定位，分析特定抗原表位与疾病的相关性以及制备重组抗原用于临床检测等研究奠定基础。     

SARS-CoV S蛋白表位的表达及鉴定

目的:制备SARS冠状病毒S蛋白串联表位重组蛋白,为SARS的防治提供新型抗原蛋白。方法:应用抗原表位分析软件分析S蛋白的表位。选取其中16个表位,设计并合成表位串联重组蛋白编码基因Z,构建其原核细胞表达重组体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达该重组表位蛋白Z,应用Ni离子亲合层析法纯化重组蛋白Z做抗原,采用皮下注射法免疫新西兰白兔。斑点杂交法测定抗Z-血清中S蛋白的抗体,ELISA法检测Z蛋白的抗原性。结果:构建了S蛋白重组表位蛋白Z的原核表达体,在BL21菌中表达了Z蛋白,Z蛋白免疫新西兰白兔后获得了抗Z血清。斑点杂交分析显示,抗Z血清识别哺乳动物细胞中表达的S蛋白。ELISA检测结果显示,抗Z血清识别SARS冠状病毒抗原。结论:建立了制备SARS冠状病毒S蛋白重组表位蛋白的方法,为防治SARS提供了新型抗原蛋白Z。     

单抗－CA7靶抗原决定簇性质及结构的研究

本实验室建立了一株抗日本血吸虫抗原的单克隆抗体（ＣＡ７）。利用单抗亲和层析方法分离纯化了ＣＡ７靶抗原，该抗原分子量为２２０ｋｄ，糖蛋白染色阳性，蛋白酶水解不影响其与ＣＡ７的结合，高碘酸氧化能使之丧失与ＣＡ７结合的能力。碱水解去除多肽上的Ｏ－糖链后，分子量由２２０ｋｄ降为６８ｋｄ，与单抗结合的能力也随之消失，提纯了含靶抗原决定簇的Ｏ－糖链，经Ｂｉｏ－ｇｅｌＰ２柱层析及Ｄｏｔ－凝集素印迹实验结果表明：含ＣＡ７靶抗原决定簇的Ｏ－糖链是一个三糖结构，可能为半乳糖，Ｎ－乙酰氨基葡萄糖和Ｎ－乙酰氨基半乳糖。     

丙型肝炎病毒多表位抗原重组体免疫原性分析

目的：研究丙型肝炎病毒(HCV)多表位抗原重组体在大肠杆菌中的非融合表达及其免疫原性分析。方法：利用DNA重组技术将构建的HCV多表位抗原重组体克隆入原核表达载体pBV220并在BL-21中表达，非融合表达蛋白经SDS-PAGE检测，排阻层析纯化，利用ELISA和免疫印迹分析其抗原反应性。免疫昆明鼠和猕猴，并检测其抗体和特异性CTL(Cyto-toxic T lymphocyte)，在抗体转阴后再次用HCV病人血清攻击以检测其免疫应答能力。结果：HCV多表位重组体在pBV220／BL-21中表达量占菌体总蛋白量的15％。Western-blot和ELISA分析表明HCV多表位抗原能与HCV病人血清特异性结合，抗体水平和特异性CTL检测结果显示该抗原肽能诱导小鼠和猕猴产生较好的抗体水平和特异性CTL效应。用病人血清再次攻击后受试动物的抗体迅速阳转。结论：表达的多表位重组体具有特异的抗原反应性和免疫原性。     

GST与戊型肝炎病毒ORF2编码蛋白融合表达形成的新抗原表位的鉴定

目的:以戊型肝炎病毒(HEV)ORF2编码的重组蛋白p166为例,研究蛋白标签GST对融合表达的重组蛋白抗原结构的影响.方法:以HEV中国株重组蛋白p166Chn-GST为免疫原,制备单克隆抗体(mAb),与代表HEV 4个基因型的摩洛哥株、墨西哥株、美国株和中国株p166的GST或His融合蛋白、中国株非融合重组蛋白p179Chn以及GST融合的HEV无关蛋白进行ELISA检测,鉴定mAb所识别的抗原表位. 结果:获得3株稳定分泌抗p166Chn-GST的杂交瘤细胞株,分泌的mAb 1A8、9B4和8H10与p166Chn-GST反应,与GST不反应.其中1A8和9B4可与带GST标签的4种p166-GST蛋白以及N和C端截短的p146Chn-GST、p137Chn-GST反应,而不与4种p166-His蛋白反应,也不与p179Chn反应,与HEV病毒颗粒竞争试验阴性,与GST融合的HEV无关蛋白无交叉反应性,表明1A8和9B4识别的抗原表位不是HEV病毒颗粒表面天然存在的抗原表位,而是GST与HEV ORF2编码蛋白的465-601aa区段序列共同形成的新的抗原表位.结论:GST能够赋予基因工程重组蛋白以新的抗原特性,它与融合表达的重组蛋白可以共同形成新的抗原表位.     

庚型肝炎病毒NS5区优势抗原表位的表达及其抗原性的初步评价

目的 表达庚型肝炎病毒（HGV）基因且NS5区部分基因重组抗原，分析其抗原性。方法 分别亚克隆了HGV NS5a、NS5b以及NS5b与C区嵌和的基因至pThoiC表达载体上，构建成3个重组表达质粒，分别大肠埃希菌JM109（DE3），用IPTG诱导表达重组蛋白。表达产物经纯化后采用Western blot和间接ELISA方法分析3个重组蛋白的抗原性。结果 经酶切和序列分析鉴定正确，3种表达蛋白均高效表达且相对分子质量与预期大小相符。Western blot分析和间接ELISA试验表明，3种表达蛋白均能与抗－HGV阳性血清发生特异性反应。将应用重组蛋白检测的抗－HGV抗体与混合重组抗原（包括C区合成肽、NS5a合成肽、NS3区基因重组抗原）的检测结果进行了比较，在混合重组抗原阳性的22份血清中，P5a检出率为68％（15／22），P5b检出率为91％（20／22），Pc-5b检出率为73％（16／22）。在70份阴性标本中，3种抗原的检出率分别为P5a:7%(5/70);P5b:1%(1/70);Pc-5b:6%(4/70)。3个重组抗原单独检出阳性的标本，其中有一部分经RT－PCR检测亦为阳性。结论 原核表达的NS5区蛋白所检测的抗－HGV抗体不能完全被其他区段的抗原所覆盖，是免疫诊断HGV感染所必需的抗原表位之一。     

基于抗原表位制备抗人GP73单克隆抗体

目的:制备抗GP73蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法:将GP73蛋白N末端的肽段(AAAERGAVELK)展示于T7噬菌体表面,扩增重组噬菌体作为抗原免疫小鼠,制备抗体。通过ELISA法检测小鼠血清抗体的效价,筛选分泌抗GP73蛋白抗体的杂交瘤细胞株;通过ELISA、Westernblot等方法检测mAb的特异性。结果:利用表面展示GP73抗原表位的重组噬菌体为抗原免疫小鼠,通过细胞融合和筛选得到了能识别GP73蛋白的mAb,且特异性较好。结论:将蛋白质抗原的合适抗原表位展示在T7噬菌体表面,用这种重组噬菌体作为替代抗原可以制备识别全蛋白的mAb。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

高效原核融合表达载体（pBVIL1）的构建及在HCV抗原表达中的应用

在对作为试剂抗原的研究中,为尽量减少抗原中无关片段可能引起的非特异性反应,常需采用以特异性抗原表位为主的小分子肽。但有时为了增加抗原的覆盖面以提高检测的灵敏度,又需用含有多个抗原表位的融合抗原〔１,２〕。用人工合成肽成本较高,且肽与肽间的化学连接难以达到定向和得到稳定的产物。若能进行小分子肽基因的重组表达,并进而将其相互连接融合表达最为理想。为实现上述目的,我们构建了表达载体pBVIL１。此载体是我们在以前克隆的表达质粒〔３〕pBV２２０／IL－１β的基础上而构建的。即在相当原质粒中的IL－１β基因中,…     

钩端螺旋体抗原表位预测、重组、表达及免疫原性分析

目的应用生物信息学方法预测两种钩端螺旋体外膜蛋白的表位，结合基因工程手段进行表位重组、表达和免疫原性分析。方法用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测LipL32和OmpL1的表位，应用PCR技术合成重组表位基因片段，克隆PCR产物构建重组质粒，测序验证。在BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白。纯化该融合蛋白，免疫BALB／c小鼠，显微镜凝集试验（MAT法）测定抗体效价。结果在LipL32和OmpL1中各预测到2个既具有MHC结合肽特性又具有B细胞表位特征的肽段。PCR合成的重组表位基因序列中没有出现移码和碱基置换。纯化后融合蛋白纯度〉90％。融合蛋白产生的抗体效价为75．79，融合头（运载蛋白）抗体效价为10．62。结论重组表位具有一定免疫原性。为相关蛋白的表位重组和亚单位疫苗等方面的研究打下了良好的基础。     

跨膜型超抗原SEA融合蛋白的表达及其对小鼠黑色素瘤的免疫治疗作用

目的 制备跨膜型超抗原融合蛋白，研究该蛋白制备的肿瘤疫苗的抗肿瘤作用。方法 用已构建的重组跨膜型超抗原的表达载体pET-28a-TM-SEA转化E．coli BL21(DE3)pLys宿主菌，在IPTG诱导下产生目的蛋白；用Ni-NTA His Bind Resin纯化带有His-Tag的目的蛋白。采用免疫组化法、免疫荧光法和流式细胞术检测其对细胞膜的锚定作用。建立C57BL／6小鼠的黑色素瘤模型，观察跨膜型超抗原SEA融合蛋白制备的肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。结果 跨膜型超抗原融合蛋白能够锚定在肿瘤细胞膜上。融合蛋白制备的肿瘤疫苗能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长其生存期。结论 跨膜型超抗原融合蛋白制备的肿瘤疫苗具有较强的抗肿瘤作用，有可能作为一种有效的新型疫苗用于肿瘤的治疗和预防。     

寻常型天疱疮的Dsg3特异性抗体反应及其基因限制性

探讨寻常型天疱疮中的自身抗原桥粒芯蛋白（Dsg3)特异性抗体反应及其基因限制性，为自身免疫性疾病机制的研究提供依据。采用RT－PCR法克隆自身抗原Dsg3E1,E2,E3,E4,E5多肽片段的cDNA，定向插入表达载体PGEX－2T，导入大肠杆菌JM109中表达重组融合蛋白并经GST层析柱纯化，进一步经免疫印迹法与PV患者阳性血清反应；应用序列特异性引物聚合酶链式反应（SSP－PCR）技术对HLA－Ⅱ类等位基因进行特异性体外扩增，分析了天疱疮患者HLA基因的DR位点的DRB1、DQB1多态性。Dsg3 E1,E2和E4可与PV患者阳性血清反应，而不与疾病对照组、正常对照组反应。在10个PV患者中，均携带HLA的DR4或／和DR14抗原，有7个DRB1*0402,4个DRB1*1401,7个DQB1*0302,4个DQB1*0503.Dsg3 E1,E2和E4中包含抗体反应相关的抗原表位，HLA DRB1*0402t DQB1＊0302与PV发病中抗E4抗体反应密切相关。