丙型肝炎病毒6a型感染的状态与分析

目的:初步探讨丙型肝炎病毒6a型感染的状态.方法:对经HCV 5'非编码区(5'NCR)复合酶切分型结果为6a的3例样本(95,126,150)进行5'NCR和NS5B区的扩增、测序,然后将5'NCR和NS5B区序列与24个HCV全基因参考序列(均来自GenBank)比对并构建遗传进化树.结果:对3例分型结果为6a型的样品进行5'NCR序列分析发现,这3例样品都具有6a型特征性的第-145位的CA碱基插入,且与6a型参考序列Y12083的同源性最高,分别为0.993,0.987,0.993;进化树分析表明,3例样本都属于6a型.然而NS5B区的序列分析结果表明,95,126,150在NS5B区与1b型参考序列HC-J4的同源性最高,分别为0.934,0.930,0.926;进化树分析结果也显示它们都属于1b型,两个区的分型结果完全不同.为排除引物扩增效率的问题,使用6a型特异的引物对3例样品进行NS5B区扩增,3例样本扩增结果均为阴性.结论:我们发现的HCV 6a型的感染中,存在3例样品5'NCR和NS5B区的分型结果不一致,尚无直接证据证明其是否发生了基因重组.但是,我们的结果提示,在两个或两个以上区域进行HCV分型是非常重要的,且HCV基因型之间的重组必须纳入到HCV分型的考虑中来.     

华南HCV 1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析

目的构建来自华南不同慢性丙型肝炎(CHC)患者的HCV NS5A的复制子重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病毒应答中生物学特性。方法以能够高效复制的1b型HCV复制子质粒为骨架,构成带有MIuⅠ和BclⅠ双酶切位点的开关质粒,采用逆转录-聚合酶链反应从不同CHC患者血清中扩增获得HCV 1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况。扩增产物中无MIuⅠ和BclⅠ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV 1b复制子骨架中。结果成功扩增出NS5A全长片段并克隆测序,将NS5A区ISDR-V3区域置换入复制子中,测序结果正确。序列比对显示应答株的ISDR和PKRBD氨基酸变异数目比无应答株高;V3和IRRDR区域存在较高氨基酸突变率。结论成功构建包含华南HCV 1b亚型NS5A核心区域的复制子插入式重组质粒,为研究HCV NS5A生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性CHC患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

丙型肝炎病毒Ns_3基因区部分序列的PCR克隆和鉴定

选取HCV－1、HCV－J、HCV－BK、台湾株HCV、中国河北株HCV序列的同源性部分，设计Ns3区部分序列的PCR引物．应用RT－PCR技术，从丙型肝炎患者血浆中扩增一长为448bp的cDNA片段作为目的基因，与经过限制性酶切的pUcI9载体连接，构建重组质粒pUHCV－Ns3．分别或混合应用HCV序列特异的引物和载作序列特异的通用引物，以PCR扩增重组质粒，结果扩增产物的分子量均与预期大小一致．限制性酶切位点分析结果也证实，克隆的基因是HCV的Ns3区部分序列的目的基因．克隆序列的特异性和插入方向同时得到了鉴定．     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B（HCV NS5B）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法：以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1（-）-NS5B转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交（SSH）分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果：文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段。测序及同源性分析，显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5B反式激活靶基因。结论：成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

2a/Ⅲ型丙型肝炎病毒基因组非结构4区全长序列的扩增、克隆及分析

目的 获得2a／Ⅲ型丙型肝炎病毒（HCV）基因组全长非结构（NS）4区克隆并作序列分析。方法 用限制性长段长度多态性分析（RFLP）基因分型方法筛选出2a／Ⅲ型HCV一株。为了获得该毒株全长NS4区基因序列，依据代表株序列的NS3区之′末端及NS5区之5′末端相对保守区域合成引物，以RT－nseted-PCR方法扩增一段1.3kb的片段cDNA；将此片段插入pUC19质粒载体。结果 克隆了丙型肝炎基因组非结构NS4区全长基因，构建了pUC-NS4重组体，对重组体进行酶切鉴定，克隆的cDNA与预计的片段大小相符，并作序列测定。结论 获得全长NS4区基因克隆，经序列分析表明，与日本HC－J6有较高的同源性（92.1%）。     

以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。     

PCR技术在丙型肝炎病毒RNA聚合酶基因分析中的应用

目的研究本地区HCV病毒分离株的分型,为临床治疗提供依据。方法利用PCR技术克隆并测定NS5B基因片段的核苷酸序列,并对其核苷酸和氨基酸序列进行比较分析。结果克隆的NS5B片段的核苷酸和氨基酸序列与HCV-Ⅱ型代表株相应部分序列的同源性最高,而且氨基酸序列比较结果显示,37个分离株中RNA聚合酶结构及其相关序列无任何变异。结论该分离株应属HCV—Ⅱ型。NS5B基因片段可能在病毒复制中起重要作用。     

抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义

目的：构建抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法：根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后线性的pSilencer^TM 3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western  blotting印迹法鉴定 NS5A蛋白表达。结果：对重新构建的pSilencer^TM3.1-H1neoHCV  NS5A- R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4　348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的 NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒 NS5A蛋白在相对分子质量5　600处出现条带。结论：设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用。     

华南HCV 1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析

摘要：目的构建来自华南不同慢性丙型肝炎（CHC）患者的HCV NS5A的复制子重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病
毒应答中生物学特性。方法以能够高效复制的1b型HCV复制子质粒为骨架,构成带有MIuⅠ和BclⅠ双酶切位点的开关质
粒,采用逆转录-聚合酶链反应从不同CHC患者血清中扩增获得HCV 1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分
析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况。扩增产物中无MIuⅠ和BclⅠ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序
列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV 1b复制子骨架中。结果成功扩增出NS5A全长片段并克隆测序,将NS5A区
ISDR-V3区域置换入复制子中,测序结果正确。序列比对显示应答株的ISDR和PKRBD氨基酸变异数目比无应答株高;V3和
IRRDR区域存在较高氨基酸突变率。结论成功构建包含华南HCV 1b亚型NS5A核心区域的复制子插入式重组质粒,为研究
HCV NS5A生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性CHC患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础。
     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B基因酵母表达载体的构建及表达

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4B基因的酵母细胞表达载体，为探索HCVNS4B在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV-1为模板扩增HCVNS4B基因，克隆到pGEM-T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCVNS4B基因酵母表达载体，Western免疫印迹分析显示了HCVNS4B在酵母细胞中融合表达。表达产物在胞内存在，融合蛋白的相对分子量约为48ku左右。结论：HCVNS4B蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。     

丙型肝炎病毒NS3基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。     

丙型肝炎病毒NS4B对YAP转录、表达、磷酸化及细胞内分布的影响

目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)细胞内荧光表达质粒,检测NS4B对Yes相关蛋白(YAP)转录、表达、磷酸化及细胞内分布影响。 方法根据现有含有HCV 1b型病毒NS4B完整基因的质粒设计NS4B的特异性扩增引物,扩增NS4B完整序列并构建NS4B荧光质粒,质粒转染进入HEPG2和293T细胞,通过Real-time PCR检测YAP基因转录水平;通过Western blotting检测YAP蛋白表达及磷酸化水平;通过激光共聚焦和核质分离实验检测YAP细胞内分布。 结果成功扩增出NS4B完整序列并构建其荧光质粒;Real-time PCR和Western blotting结果显示,NS4B并不影响YAP的转录和表达水平,但是能够调节其磷酸化水平;激光共聚焦和核质分离试验结果提示NS4B能够调节YAP在细胞质和细胞核内的比例。 结论HCV NS4B可能通过对YAP的影响发挥生物学功能。     

丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析

目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础。方法:采用基因重组技术完成实验。设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平。结果:含有HCV 1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV 1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

Transfection and expression of HCV-NS5B gene in Huh-7 cells

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＮＳ5ＢｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨｕｈ 7ｃｅｌｌｓｂｙｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ ,ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｎｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ 5Ｂ(ＮＳ5Ｂ)ｉｎＨｕｈ 7ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｒｅｗｅｒｅＮＳ5Ｂｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎ…     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

丙肝病毒NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体的构建

目的通过克隆丙肝病毒非结构蛋白NS3-4A基因,构建表达HCV-NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体。方法设计合成HCV NS3-4A基因全长的特异性引物,应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增非结构蛋白区NS3-4A基因片段,经限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切后克隆到pFastbacDual上,并转化到大肠杆菌DH5α中,最后经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果扩增得到的基因片段长度为2.2kb,该片段成功克隆在杆状病毒穿梭载体pFastBacDual上,经测序证实为HCV NS3-4A基因,这表明HCV-NS3A基因重组杆状病毒穿梭载体构建成功。结论成功构建了表达HCV NS3-4A基因的杆状病毒穿梭载体,这将为下一步HCV杆状病毒载体疫苗的制备打下基础。     

HCV NS4B表达载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）2a 型非结构蛋白4B（NS4B）的真核表达载体，并观察其对骨肉瘤细胞U2OS凋亡的影响。方法以质粒PJFH1为模板，通过PCR反应扩增4 目的基因片段，采用同源重组法与PCMV-tag2b 载体相连，转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选正确的克隆。以脂质体为介导转染U2OS 细胞，通过Western blot 检测NS4B蛋白的表达，免疫荧光检测细胞的凋亡。结果构建pCMV-tag2b-NS4B 重组质粒，经测序其与NCBI 公布的序列完全一致，并可在U2OS 细胞中表达，DAPI 检测显示细胞凋亡率为（17.25±2.5）%，对照组凋亡率为（6.53±2.36）%。结论成功构建NS4B 的真核表达载体，并可在U2OS 细胞中表达，诱导细胞凋亡。