腹腔途径对脂质体和糖化多聚赖氨酸对外源基因肝脏靶向导 …

目的 比较脂质体和糖化多聚赖氨酸经腹腔途径时对目的基因肝脏靶向定位效果的影响。方法 将真核细胞表达质粒分别与脂质体和糖化多聚赖氨酸偶联，经腹腔注射导入大鼠体内，通过原位杂交和免疫组化的方法观察目的基因在肝脏和其他脏器的分布表达。     

尾静脉高压注射质粒DNA后体内表达的规律

目的研究小鼠尾静脉高压注射质粒DNA后，目的基因在体内分布表达的规律，以及该方法的转基因效率。方法将LacZ质粒按小鼠体重比稀释到一定的PBS中，经尾静脉快速高压注射导入小鼠体内，通过X-gal染色的方法在不同时间点观察目的基因在肝脏和其他脏器中的分布规律。结果含有CMV启动子的LaeZ裸质粒经小鼠尾静脉高压注射途径导入体内，24h后即开始表达，第3天出现表达高峰，1周后表达消失，基因转染率达5％-6％；用脂质体包裹质粒DNA后，再进行尾静脉高压注射，质粒在肝脏的表达效率可达18％-20％。结论应用尾静脉高压注射脂质体／质粒DNA复合物途径，目的基因在小鼠肝脏获得高效表达，该方法可以广泛应用于基因治疗的实验研究。     

不同转染方式对GFP表达质粒在小鼠肝脏的表达影响

目的 研究经流体力学注射、门静脉和腹腔常规注射3种不同途径注射GFP表达质粒后,目的基因在小鼠肝脏的表达情况及其转基因效率.方法 将裸质粒或脂质体包裹的质粒DNA分别应用流体力学注射、门静脉及腹腔常规注射法注入同种异体小鼠体内,48h后分别取血和肝组织,通过荧光显微镜观察3种转染途径对质粒DNA在小鼠肝脏的表达影响.结果 流体力学注射组及门静脉常规注射组均可见大量绿色荧光蛋白表达,两组的荧光表达量差异无统计学意义(P>0.05),腹腔注射组小鼠的肝脏仅见少量的绿色荧光表达,但3组内脂质体/质粒DNA复合物组绿色荧光表达量均明显高于裸质粒组(P<0.05).结论 应用流体力学注射及门静脉常规注射脂质体/质粒DNA复合物途径,目的基因均在小鼠肝脏高效表达,两种途径无明显差异,流体力学注射可广泛用于肝靶向性的活体基因转染.     

重组质粒导入真核细胞的两种方法比较

目的：比较糖化多聚赖氨酸介导和电穿孔两种方法将重组质粒导入真核细胞的优缺点。方法：用最佳电压、电容、温度、DNA浓度进行电穿孔转染,或者先使重组质粒与糖化多聚赖氨酸电性结合后,再与2.2.15细胞共同温育的方法,分别将pcEP4-aC重组质粒导入2.2.15细胞,经潮霉素筛选,比较两种方法的优劣。结果：两种方法都能成功地将重组质粒导入2.2.15细胞,但糖化多聚赖氨酸介导者,细胞生存时间较长。结论：糖化多聚赖氨酸导向配体具有良好的导入重组质粒进入肝细胞的功能,且更适合于应用。     

乳糖化修饰海藻酸钠-多聚赖氨酸纳米粒的制备及其肝靶向性研究

目的 探讨乳糖化修饰海藻酸钠-多聚赖氨酸纳米粒(Alg-Lac PLLNP)的制备及其作为肝脏靶向性药物载体的可行性.方法 合成乳糖化多聚赖氨酸(Lac-PLL),并以乳糖化多聚赖氨酸为原料改性修饰海藻酸钠纳米粒.通过半乳糖修饰纳米粒建立配体-受体生物特异性介导来实现肝主动靶向,并分别与非糖化组比较肝靶向效果,对纳米-DNA复合物鼠体内时间、空间分布进行研究.结果 电子显微镜的检测结果 ,Alg-LacPLL纳米粒粒径在250nm左右,近似球形,大小分布均匀;纳米粒未聚集.AlgNP纳米粒PEGFPC-1质粒掺入比为6.15-4.21/6.25=68.给药30 min鼠体生物分布显示,Alg-Lac PLLNP以肝为第一靶向器官.结论 海藻酸钠-多聚赖氨酸纳米粒的制备与栽体海藻酸钠的浓度及最佳凝聚剂氯化钙的浓度密切相关,且多聚赖氨酸和氯化钙加入海藻酸钠溶液的先后顺序对粒径的影响至关重要.该制备工艺简便,药物包封率高.Alg Lac PLL-DNA具有一定肝靶向性.     

反义转化生长因子βⅠ型受体表达质粒对实验性肝纤维化的影响

目的观察反义转化生长因子βⅠ型受体(T β RⅠ)表达质粒对实验性肝纤维化的影响.方法运用重组DNA技术构建反义T β RⅠ真核细胞表达质粒,经与糖化多聚赖氨酸偶联后,采用尾静脉注射将其导入猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化模型体内;通过Northern印迹、RT-PCR、Western印迹及免疫组化等方法检测外源导入质粒在肝组织中的表达,并通过检测血清TGF β1浓度以及肝组织羟脯氨酸测定,Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化与Van Gieson 染色观察反义T β RⅠ质粒对大鼠肝纤维化的影响.结果反义T β RⅠ表达质粒可在肝组织中获得确切表达,其表达可抑制TGF β1表达(P<0.05),降低羟脯氨酸含量(P<0.01),减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积(P<0.01),并促进肝脏病理形态一定程度的改善(P<0.01).结论反义T β RⅠ表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用.     

反义转化生长因子βⅠ型受体表达质粒对实验性肝纤维化的影响

目的 观察反义转化生长因子βⅠ型受体(TβR工)表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法 运用重组DNA技术构建反义TβRⅠ真核细胞表达质粒,经与糖化多聚赖氨酸偶联后,采用尾静脉注射将其导入猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化模型体内;通过Northern印迹、RT-PCR、Western印迹及免疫组化等方法检测外源导入质粒在肝组织中的表达,并通过检测血清TGFβ1浓度以及肝组织羟脯氨酸测定,Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化与Van Gieson染色观察反义TβRⅠ质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果 反义TβRⅠ表达质粒可在肝组织中获得确切表达,其表达可抑制TGFβ1表达(P<0.05),降低羟脯氨酸含量(P<0.01),减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积(P<0.01),并促进肝脏病理形态一定程度的改善(P<0.01)。结论 反义TβRⅠ表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用。     

不同剂量不同载体不同途径的肝再生增强因子重组质粒抗大鼠肝纤维化疗效比较

目的 筛选肝再生增强因子重组质粒基因治疗时较优的载体、途径和剂量及三者的最佳组合.方法 制备肝纤维化大鼠模型,L9(33)正交设计分组,用3种不同的载体(裸基因、脂质体、多聚物)携带不同量(50、100、200μg/kg)的肝再生增强因子重组质粒,采用3种给药途径(肌肉注射、静脉注射、腹腔注射)对模型大鼠进行干预,通过肝组织病理学、肝纤4项等指标来判断疗效并进行对照.结果剂量因素:200μg/kg组纤维化半定量计分和肝纤4项综合得分明显低于50μg/kg组和100μg/kg组,但50μg/kg组和100μg/kg组的结果无显著性差异.载体因素:裸基因组、脂质体组和多聚赖氨酸组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异.脂质体组和多聚赖氨酸组的肝纤4项综合得分均明显低于裸基因组.途径因素:肌肉注射组、静脉注射组和腹腔注射组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异.腹腔注射组的肝纤4项综合得分明显高于肌肉注射组和静脉注射组.结论 200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效优于100μg/kg和50μg/kg;由脂质体携带DNA和由多聚物携带DNA的疗效明显优于裸DNA.肌肉注射和静脉注射的疗效明显优于腹腔注射.由脂质体或多聚物携带、静脉或肌肉注射200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒,能取得较好的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效.     

反义转化生长因子βI型受体表达质粒对实验性肝纤维化的影响

目的 观察反主转化生长因子βI型受体（TβRI）表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法 运用重组DNA技术构建反义TβRI真核细胞表达质粒,经与糖化多聚赖氨酸偶联后,采用尾静脉注射将其导入猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化模型体内;通过Northern印迹、RT－PCR、Western印迹及免疫组化等方法检测外源导入质粒在肝组织中的表达,并通过检测血清TGFβ1浓度以及肝组织羟脯氨酸测定,I、Ⅲ型胶原免疫组化与Van Gieson染色观察反义TβRI质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果 反义TβRI表达质粒可在肝组织中获得确切表达,其表达可抑制TGFβ1表达（P＜0．05）,降低羟脯氨酸含量（P＜0．01）,减少I、Ⅲ型胶原的沉积（P＜0．01）,并促进肝脏病理形态一定程度的改善（P＜0．01）。结论 反义TβRI表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用。     

非病毒载体基因复合物经胆道分支导入活体肝脏局部表达的实验研究

目的经胆道分支逆行导入非病毒载体基因复合物,观察目的基因在正常及急性损害大鼠局部肝脏的定量定位表达。方法运用D-氨基半乳糖制作大鼠急性肝损害模型;非病毒载体基因复合物polylysine-molossin／DNA／fusogenic经胆管分支分别将包含萤火虫荧光素基因质粒pGL3及包含大肠埃希氏菌β半乳糖苷酶基因质粒CMVβ逆行导人大鼠局部肝脏,定量检测荧光素酶和定位检测β半乳糖苷酶在肝脏的表达。结果荧光素酶基因在正常大鼠肝脏极少表达,在急性肝脏损害恢复期（造模后第4—7天）表达水平显著增加（P〈0．05）,在造模后第9天表达水平与正常组无显著差别。大肠埃希氏菌β半乳糖苷酶定位检测见急性肝损害大鼠肝脏内显著表达,正常大鼠肝脏几乎无表达,其中可见较多肝细胞表达。基因导入可引起血清ALT、AST水平升高,血清白蛋白水平略下降,但基因表达与肝功能酶生化指标水平及变化无明显相关。组织学改变不显著。结论非病毒载体基因复合物导入急性损害肝脏局部能获得较好表达,且无明显加重肝脏损害,该项方法为肝脏基因治疗的实验研究提供了良好的技术平台。     

乳糖化修饰纳米基因载体的肝靶向性研究

Objective:To compare the targeting effects of lactosaminated alginate(AlgNP), polyethylene glycol-coated hydroxyapatite-poly-L-lysine nanoparticles (PLL-PCHNP)and relative nonlactosaminated ones load-ed with exogenous gene on liver via peripheral intravenous route. Methods: Preparation of AlgNP based on control ofgelification phenomenon of algiante by calcium ions and HA-PLLNP with collosol-gel method, both further modi-fied with lactosaminated-poly-L-lysine synthesized by reductive lactosamination. We used pEGFP_(Cl) as the re-     

脂质体的乳糖化修饰及其肝脏靶向性研究

目的探讨乳糖化白蛋白－脂质体交联物（简称交联物）作为肝脏靶向性药物载体的可行性。方法应用生物化学技 术合成交联物并对大鼠进行体内实验,了解交联物在动物肝脏的聚集量以及预先注射乳糖化白蛋白对交联物肝脏聚集 性的抑制作用;比较交联物、普通脂质体分别包裹的 α－干扰素及游离 α－干扰素在 ２．２．１５细胞中的抗乙型肝炎病毒效 应。结果交联物在肝脏的聚集量是脾脏的２倍以上,是其他脏器的４－９倍;预先注射乳糖化白蛋白后交联物的肝脏聚 集性减弱,与脾脏聚集量无显著差异;交联物包裹干扰素后抗乙肝病毒效应较普通脂质体包裹的干扰素及游离干扰素 显著提高,相当于普通脂质体干扰素１／４剂量、游离干扰素１／８剂量的抗病毒效应。结论文联物通过去唾液酸糖蛋白受 体实现肝脏聚集性,可望成为理想的肝脏靶向性药物载体。     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。     

脂质体在脑靶向给药系统中的研究进展

血脑屏障是阻碍药物进入大脑的主要因素,血脑屏障上皮细胞间的紧密连接使药物很难渗透入脑,从而显著增加了临床药物治疗颅内疾病的难度。连接抗体的脂质体或免疫脂质体可作为特定的药物载体将药物分子包裹并靶向运输到相应组织或器官内。本文将总结如何应用这种技术将药物转运通过血脑屏障,及其临床应用前景。     

pEgr1-TRAIL重组质粒联合电离辐射对乳腺癌MCF-7细胞死亡受体通路相关基因和蛋白表达的影响

目的: 将Egr1-TRAIL重组质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞且加X线照射,探讨MCF-7细胞中死亡受体通路相关基因和蛋白表达的变化。方法: 将MCF-7细胞分为对照组、空质粒组、pEgr1-TRAIL质粒组、4.0GyX射线组、空质粒+4.0GyX射线组和pEgr1-TRAIL+4.0GyX射线组。Real-timePCR法检测各组MCF-7细胞中DR4、caspase-9和caspase-6mRNA表达水平;Western blotting法检测各组MCF-7细胞中DR4、caspase-9和caspase-6蛋白相对表达水平。结果: 经4.0GyX射线照射后4h,与对照组比较,各组MCF-7细胞中DR4、caspase-9和caspase-6mRNA表达水平升高(P<0.01),8h达最高值,之后开始降低,到24h恢复到照射前水平;各组MCF-7细胞中DR4、caspase-9和caspase-6mRNA表达由高到低的顺序为pEgr1-TRAIL+4.0GyX射线组> 空质粒+4.0GyX射线组> pEgr1-TRAIL质粒组> 空质粒组> 4.0GyX射线组> 对照组,其中pEgr1-TRAIL+4.0GyX射线组MCF-7细胞中DR4、caspase-9和caspase-6mRNA表达水平明显高于其他各组(P<0.01)。MCF-7细胞中DR4、caspase-9和caspase-6蛋白在照射后6h开始表达,12h达高峰,48h后细胞中DR4、caspase-9和caspase-6蛋白表达水平仍高于6h时蛋白表达水平。与对照组比较,其他各组MCF-7细胞中蛋白相对表达水平由高到低的顺序为pEgr1-TRAIL+4.0GyX射线组> 空质粒+4.0GyX射线组> 4.0GyX射线组> pEgr1-TRAIL质粒组> 空质粒组> 对照组,其中pEgr1-TRAIL+4.0GyX射线组MCF-7细胞中蛋白相对表达水平明显高于其他各组。结论: pEgr1-TRAIL重组质粒联合放疗对MCF-7细胞具有杀伤和诱导凋亡的作用,其效果优于单纯质粒或单纯照射。     

Harm Reduction - Good Practice in Asia. The Integration of Harm Reduction into Abstinence-based Therapeutic Communities

Muscle atrophy may occur in aging skeletal muscles, neurodegenerative syndromes,disease related cachexia and spaceflight.1,2 It is characterized by a loss of body mass, mainly skeletal muscles. Metabolic abnormalities develop in various chronic diseases and lead to progressive catabolism with decrements in the skeletal musculature that result in muscle atrophy.2prevent cell death and restore muscle function.4 Circulating and muscular IGF-1 levels are frequently reduced in catabolic states.5 …     

Chk1和Chk2高表达人胃癌BGC823细胞的建立与鉴定

细胞周期检测点Chkl和Chk2在参与G2/M期起着重要作用,本研究构建Chk1/2的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌BGC823细胞,进一步证明Chk1/2高表达对BGC823细胞G2/M期的影响。根据NCBI GenBank Chk1/2基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点。从人胃癌细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序对重组质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染BGC823细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot检测表达产物。结果显示,菌落特异性PCR表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,经测序与NCBIBLAST分析证实为Chk1和Chk2基因。稳定转染空载体pcDNA3.1 的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的BGC823细胞,经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在BGC823细胞中的表达较对照组与空载体组明显增加(P<0.05)。流式细胞术检测显示,Chk1转染组G2/M细胞较对照组与空载体组明显增加 (P<0.05),而Chk2转染组G2/M细胞无明显差异 (P>0.05)。上述结果表明,成功构建pcDNA3.1/Chk1与pcDNA3.1/Chk2真核表达载体和Chk1与Chk2高表达的BGC823细胞,Chk1高表达可阻滞BGC823细胞于G2/M。     

内脏脂肪素在大鼠非酒精性脂肪性肝病模型中的变化及作用

目的 观察高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)形成过程中肝组织内脏脂肪素(visfatin)mRNA及蛋白的表达变化,探讨visfatin在NAFLD形成过程中的可能作用及意义.方法 高脂饮食建立NAFLD大鼠模型.用RT-PCR及western blot方法检测对照组(C组)及脂肪肝组(F组)大鼠第4、8、12周visfatin表达变化.结果 与对照组相比,高脂饲养脂肪肝组犬鼠肝组织中visfatin基因和蛋白的表达,从第4周开始增加,第12周时升高最显著(P＜0.01),与脂肪肝发展进程一致.结论 visfatin表达变化与NAFLD的形成密切相关.