靶向性表皮生长因子受体siRNA表达载体的构建和表达

目的构建靶向性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)表达载体并在TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系表达。方法在人EGFR细胞外区受体结合结构域和细胞内区酪氨酸激酶结构域各选择1个siRNA靶序列、进行了psiRNA—NeoG2表达载体的构建，进而以反义EGFR表达载体P—anti—hEGFR为对照进行了脂质体介导的TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用免疫荧光和蛋白印迹检测EGFR的表达。结果成功构建以psiRNA—NeoG2为载体的siRNA表达质粒，并分别使其在稳定转染TJ905细胞后EGFR表达下调90％和92％；反义EGFR表达载体P—anti—hEGFR使EGFR表达下调82％。结论靶向EGFR的siRNA表达载体可以特异性地抑制EGFR的表达，可以成为胶质瘤靶向性EGFR基因治疗的一种新策略。     

shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默

目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpin RNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF1)基因的沉默效果.方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1.以人HIF1 cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1.新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变.结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降.结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义.     

钙转运蛋白基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建针对钙转运蛋白（CaT1）特异性干扰RNA（siRNA）及其表达载体，并检测其对CaT1基因的干扰作用。方法：设计CaT1靶向的发夹状siRNA，合成两条互补的寡核苷酸链，退火后连接人pSilencer3．1-H1载体，转化扩增后进行序列测定。用脂质体转染法转染人类胃癌细胞BGC，通过RT-PCR检测CaT1基因表达水平的变化。结果：酶切鉴定与DNA测序分析证明CaT1基因的siRNA载体构建正确，RT-PCR结果表明CaT1基因的表达水平明显降低。结论：成功地构建了针对CaT1基因的siRNA载体，转染细胞后可抑制CaT1基因表达。     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

真核表达载体pEGFP-claudin-1的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达.方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴定并测序.通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建了含有claudin-1 ORF的真核表达质粒pEGFP-claudin-1,转染293T细胞后,经荧光可见细胞膜有EGFP-claudin-1 融合蛋白的表达,Western blot检测发现有相对分子质量(Mr)49 000的蛋白条带.结论:成功地构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中表达,为研究claudin-1的功能奠定了基础.     

Cyr61基因siRNA表达载体的构建及沉默作用研究

目的:构建Cyr61靶向siRNA重组表达载体,为探讨抑制Cyr61基因表达对机械通气所致肺损伤的研究奠定基础。方法:根据GenBank数据库提供的Cyr61基因核苷酸序列,选择设计3条能转录siRNA的DNA序列,命名Cyr61-1 siRNA,Cyr61-2 siRNA,Cyr61-3 siRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照。据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil1.1载体,转化扩增后进行序列测定。4种重组表达载体转染肺癌A549细胞,逆转录RT-PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测Cyr61的表达。结果:经酶切鉴定和测序结果证实Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功,它对大肠癌细胞Cyr61 mRNA和蛋白的表达抑制率分别为60.54%和52.97%。结论:Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功并能显著抑制Cyr61基因的表达。     

Siglec-1小干扰慢病毒载体的构建和干扰效率验证

目的 构建小干扰唾液酸黏附素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 1,Siglec-1)的慢病毒载体,并体外筛选出具有干扰效果的病毒载体.方法 利用软件设计3条Siglec-1 siRNA片段,并克隆到慢病毒pGCSIL-GFP质粒载体,再与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞,培养48 h后,收集并浓缩富含慢病毒颗粒的细胞上清液.逐孔稀释法测定慢病毒滴度并转导原代培养的骨髓巨噬细胞(BMM),流式细胞术和实时荧光定量PCR筛选具有干扰效果的病毒载体.结果 成功构建3个vshRNA质粒载体和一个阴性对照质粒载体,并经测序验证序列正确.包装的慢病毒滴度介于1×108 ～ 1×109 TU/ml之间,适合体外转导及体内试验.体外转导BMM筛选出Lv-1能靶向抑制Siglec-1表达.结论 成功构建并筛选出具有体外干扰效果的小干扰Siglec-1慢病毒载体,为体内应用该病毒载体进行基因敲除实验奠定了基础.     

HLCDG1基因siRNA表达质粒的构建及其对A549细胞周期和增殖的影响

目的:本研究旨在应用RNA干扰技术，诱导转基因肺癌细胞HLCDG1基因沉默并观察其对肺癌细胞周期和增殖的影响。 方法:构建HLCDG1基因短小干扰双链RNA表达载体，筛选HLCDG1基因表达沉默的肺癌细胞株并应用MTT和流式细胞仪分析这一肺癌细胞株增殖和细胞周期分布状况。 结果:根据siRNA表达载体的设计原则，构建了能在哺乳动物细胞稳定表达的siRNA载体5个（4个位点匹配实验组和1个位点错配对照组），依次命名为pHL-si-1、pHL-si-2、pHL-si-3、pHL-si-4 和 pHL-si-c。上述载体分别与表达HLCDG1的重组体pcDNA3.1(+)/HLCDG1共转染A549细胞，筛选到一株共转染pHL-si-1载体和pcDNA3.1(+)/HLCDG1重组体的A549细胞，它几无HLCDG1基因表达，这株细胞暂命名为A549-HLCDG1-si-1。MTT和流式细胞仪分析表明，A549-HLCDG1-si-1细胞增殖能力明显提高，进入S期和G2+M期增多，滞留G1期减少。 结论:采用RNAi技术特异阻断HLCDG1基因表达，验证了HLCDG1基因对A549肺癌细胞有生长抑制作用。     

胰岛-脑1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建并鉴定表达胰岛-脑1(Islet-Brain 1,IB1)基因的真核细胞表达质粒.方法 从人胰岛细胞瘤提取总RNA,根据IB1 cDNA文库的序列利用RT-PCR扩增IB1基因.将此基因插人带有绿荧光的真核表达载体pEGFP-N1的EcoR1/KpnI酶切位点区域,携带IB1基因的真核表达质粒转染到胰岛细胞系(RINm5F),最后通过G418筛选获得稳定的携带IB1基因的胰岛细胞系.利用倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪、Western blot鉴定的质粒及转染的细胞系.结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析为840 bp的分子(IB1 AA1-280),测序分析证明与Genbank IB1 cDNA具有相同的序列.用EcoR I和Kpn I消化可见两条条带,Western blot分析证明IB1基因在RINm5F细胞表达.结论 成功构建了pEGFP-N1-IB1真核表达载体,转染到胰岛细胞系并稳定表达.     

沉默c-myc基因对Jiyoye细胞增殖与凋亡的影响

目的 运用RNA干扰（RNAi）技术,探讨经慢病毒载体介导的小干扰RNA（siRNA）转染Jiyoye细胞对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,以期为靶向c-myc基因的白血病和恶性淋巴瘤基因治疗提供体外实验依据。方法 设计、合成一对针对c-myc基因的c-myc-3寡聚核苷酸链和一对阴性对照c-myc- neg寡聚核苷酸链。退火,然后连接到pLVX干扰载体上,包装,慢病毒介导转染人Jiyoye细胞株。转染后培养72 h,流式细胞术检测各组细胞转染率,pLVX-c-myc-3转染Jiyoye细胞,MTT法检测细胞增殖;Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化吡啶（FITC/PI）双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 ①转染72 h后,流式细胞术鉴定阳性细胞比例,c-myc-neg组与c-myc-3组比较,差异无统计学意义（P 〉 0.05）[（54.3 ± 4.2） % vs（52.8 ± 2.9） %];两组细胞平均荧光强度差异、细胞转染率差异无统计学意义。②转染168 h生长曲线显示,转染pLVX-c-myc实验组细胞生长缓慢,与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。转染pLVX-c-myc 72 h后,实验组细胞抑制率为（46.40 ± 1.41） %,阴性对照组细胞抑制率为（17.03 ± 1.32） %,差异均有统计学意义（P 〈 0.05）。③转染pLVX-c-myc 72 h后,实验组早期凋亡细胞比例（25.6 ± 4.2） %,阴性对照组早期凋亡细胞（15.1 ± 4.2） %,空白对照组早期凋亡细胞为（12.7 ± 1.8） %,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。实验组晚期凋亡细胞比例（11.5 ± 4.7） %,阴性对照组为（9.3 ± 4.7） %,空白对照组为（8.14 ± 2.8） %,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。结论 设计合成构建的干扰序列pLVX-c-myc-3,可沉默c-myc基因,抑制Jiyoye细胞增殖,诱导细胞凋亡,为进一步探讨沉默c-myc基因在白血病和淋巴瘤靶向治疗中的作用提供了实验依据。     

SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。     

应用siRNA抑制K562细胞中c-Myc基因的表达

目的利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制白血病细胞系K562细胞中c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在K562细胞中的作用提供一个新的方法。方法设计c鄄Myc基因特异性小分子干扰RNA,用体外转录方法合成c鄄Myc基因的小分子干扰RNA并转染K562细胞,培养48h后,收集细胞,应用实时荧光定量RT鄄PCR和westernblot方法检测转染细胞中c鄄Myc基因mRNA水平和蛋白表达量的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性。结果转染siRNA后,与对照组相比,实验组c鄄MycmRNA水平和蛋白表达量明显降低,抑制率分别为82.16%和74.0%,MTT法表明实验组的增殖速率明显低于对照组的增殖速率。结论在K562细胞中存在RNA干扰的机制,特异性siRNA能够有效的抑制c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在肿瘤细胞中的调节途径提供了一个新的方法。     

Bcl-2 siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的: 构建bcl-2特异性siRNA真核细胞表达载体，并初步观察其对膀胱癌细胞生长的影响。方法： 根据GenBank 提供的bcl-2 cDNA序列，设计双链小干扰RNA（siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA 序列，并与含U6启动子的pGenesil-1质粒定向连接，构建真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染T24细胞，采用半定量RT-PCR观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响；用MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用。结果: 构建了bcl-2 siRNA的真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555，并经限制性内切酶酶切和DNA 测序证实与设计完全一致。转染T24细胞72 h后，RT-PCR显示bcl〖STBX〗-2〖STBZ〗基因表达下调接近80％；MTT发现T24细胞的体外生长受到明显抑制。结论: bcl-2的特异性siRNA真核细胞表达载体成功构建，有效沉默 bcl-2在膀胱癌细胞中的表达，抑制了癌细胞的生长。