RNA干扰抑制胃癌VEGF表达的实验研究

在诸多促血管生成因子中,VEGF的作用最强,在肿瘤血管生成的各个环节均有重要作用,且能特异性地作用于血管内皮细胞的有丝分裂原,故抑制VEGF表达是当前抗肿瘤血管生成的最重要策略.本研究采用DNA载体细胞内表达小片段干扰RNA技术(small interfering RNA,siRNA),构建干扰质粒psiRNA-VEGF并观察其抑制人胃腺癌细胞(MGC-803)VEGF表达的效果.     

肺癌A549细胞中RNAi抑制MeCP2表达的实验研究

目的:探讨RNA干扰下调MeCP2基因后对人肺癌A549细胞RASSF1A和C/EBPα基因表达及细胞增殖能力的影响. 方法:根据MeCP2的碱基序列设计并合成短发夹RNA(shRNA),构建质粒表达载体,用阳离子脂质体法体外转染A549细胞,筛选出稳定转染的细胞株,RT-PCR法检测MeCP2抑制效果及RASSF1A和C/EBPα表达,MTT法检测转染后细胞增殖能力.结果:成功构建了靶向MeCP2的真核表达载体pSilencer- MeCP2/Ⅰ和pSilencer- MeCP2/Ⅱ,与空白组和阴性组相比,pSilencer- MeCP2/Ⅰ和pSilencer- MeCP2/Ⅱ组均可有效抑制MeCP2基因mRNA的表达,抑制率分别为47.6%和70.3%.且在上述两组中 C/EBPα表达分别上调约115%和135%、细胞增殖能力明显减弱,与空白组和阴性组比较差异具有统计学意义(P<0.05),而RASSF1A的表达在各组细胞中未见明显变化(P>0.05).结论:肺癌A549细胞中MeCP2基因的表达可被RNA干扰载体有效抑制,进而导致细胞中部分与增殖和凋亡相关基因的表达改变,细胞增殖能力减弱.     

siRNA干扰对Hela细胞株VEGF表达的影响

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)siRNA干扰对宫颈癌Hela细胞株VEGF的影响。方法:设计合成VEGFsiRNA1、2、3号链,体外脂质体介导转染宫颈癌Hela细胞株,半定量RT-PCR及Western blot分析转染效果。结果:转染VEGF siRNA1、2号链后,宫颈癌Hela细胞株VEGFmRNA表达明显下降,但是VEGF蛋白水平下降不明显。结论:VEGF siRNA转染宫颈癌Hela细胞株可下调细胞中VEGFmRNA的表达,不同的siRNA下调mRNA效率不同。作为基因沉默的一个重要工具,siRNA干扰有望成为治疗宫颈癌一种新方法。     

VEGF反义RNA 抑制裸鼠体内食管癌细胞生长的实验研究

 目的 探讨VEGF反义RNA对食管癌细胞在裸鼠体内生长的影响。方法 观察转染VEGF反义RNA的食管癌细胞TE-1在裸鼠体内成瘤性；应用免疫组化法、RT—PCR法检测移植瘤组织中VEGF蛋白及mRNA表达和MVD；用流式细胞仪和透射电镜检测细胞凋亡情况。结果 转染VEGF反义RNA的TE-1细胞在裸鼠体内肿瘤形成的潜伏期明显延长，所形成肿瘤的重量和体积小于对照组及空载体组。肿瘤组织中VEGF蛋白和mRNA的表达降低，MVD降低；肿瘤细胞发生明显的凋亡形态学改变；G0／G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少，细胞增殖能力降低。结论 VEGF反义RNA能抑制裸鼠体内TE-1细胞的生长，减少肿瘤内血管的生成，增加细胞凋亡；为食管癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

肺癌A549细胞中RNAi抑制MeCP2表达的实验研究

目的：探讨RNA干扰下调MeCP2基因后对人肺癌A549细胞RASSF1A和C/EBPα基因表达及细胞增殖能力的影响。方法：根据MeCP2的碱基序列设计并合成短发夹RNA（shRNA）,构建质粒表达载体,用阳离子脂质体法体外转染A549细胞,筛选出稳定转染的细胞株,RT-PCR法检测MeCP2抑制效果及RASSF1A和C/EBPα表达,MTT法检测转染后细胞增殖能力。结果：成功构建了靶向MeCP2的真核表达载体pSilencer-MeCP2/Ⅰ和pSilencer-MeCP2/Ⅱ,与空白组和阴性组相比,pSilencer-MeCP2/Ⅰ和pSilencer-MeCP2/Ⅱ组均可有效抑制MeCP2基因mRNA的表达,抑制率分别为47.6%和70.3%。且在上述两组中C/EBPα表达分别上调约115%和135%、细胞增殖能力明显减弱,与空白组和阴性组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）,而RASSF1A的表达在各组细胞中未见明显变化（P〉0.05）。结论：肺癌A549细胞中MeCP2基因的表达可被RNA干扰载体有效抑制,进而导致细胞中部分与增殖和凋亡相关基因的表达改变,细胞增殖能力减弱。     

DLX4 RNAi抑制绒癌细胞黏附、侵袭能力的实验研究

背景与目的:绒毛膜癌是一种高度恶性的肿瘤,早期即可发生远处侵袭转移,但其机制目前尚不明确。DLX4是新近发现的同源异型盒转录因子,其异常表达与乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤密切相关。本实验拟在既往发现DLX4在绒癌细胞株JEG-3中呈现高表达的基础上,通过RNA干扰(RNAinterference,RNAi)抑制JEG-3中DLX4的表达,探讨DLX4对绒癌细胞黏附、运动及侵袭能力的影响。方法:构建DLX4特异性的siRNA和阴性对照siRNA,脂质体转染绒癌JEG-3细胞,G418抗性筛选高表达阳性克隆;Western blot检测RNAi效果;分别用细胞-基质黏附实验、Transwell小室和Matrigel基质侵袭实验检测细胞黏附、运动和侵袭能力的变化。结果:DLX4 siRNA特异并有效的抑制了JEG-3细胞中DLX4的表达;转染DLX4 siRNA组(JEG-3 siDLX4)的细胞与细胞外基质的黏附率为(30.6±4.2)%,显著低于未转染组(JEG-3 nontransfection)的(57.2±4.0)%和转染了阴性对照siRNA组(JEG-3scDLX4)的(51.6±3.9)%(分别为P<0.01和P<0.05);体外细胞运动和侵袭实验结果显示,JEG-3 siDLX4组的穿膜细胞数分别为(31±3)和(21±4)个/高倍镜,显著低于JEG-3 nontransfection组的(68±5)和(64±4)个/高倍镜以及JEG-3 siDLX4组的(70±4)和(67±5)个/高倍镜(P<0.01),而后两组细胞间黏附、运动和侵袭能力方面差异均无显著性(P>0.05)。结论:RNAi阻断DLX4的表达,能够抑制绒癌细胞的黏附侵袭能力,为进一步研究绒癌侵袭转移的机制提供了思路。     

RNAi沉默喉鳞癌Hep-2细胞株VEGF-C mRNA基因表达的实验研究

目的构建针对喉鳞癌细胞株Hep-2中血管内皮生长因子C（vascular endothelial growthfactor C,VEGF—C）的siRNA表达载体,研究载体介导的RNAi技术对喉鳞癌细胞株Hep-2中VEGF—CmRNA表达的抑制作用。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以VEGF-C为靶基因,同时随机组合出一条对照序列,分别合成2对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成互补DNA双链,克隆入siRNA表达载体pSuper—neo中,转化鉴定后进行PCR和DNA序列测定。用脂质体介导转染入喉鳞癌Hep-2细胞株,采用RT—PCR方法检测细胞VEGF—C基因mRNA水平的变化。结果成功构建发卡样VEGF—CsiRNA真核表达载体;转染VEGF—C靶向siRNA（pSuper—neo—siV1）的Hep-2细胞,VEGF—C基因的表达水平较无关对照组pSuper—neo—siV2和转染空载体pSuper—neo的对照组显著下降。结论成功构建载体介导的VEGF—C靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制Hep-2细胞中VEGF—CmRNA表达。     

RNAi抑制食管癌细胞Eca-109中OGT的表达研究

目的：研究RNAi表达载体对食管癌细胞Eca一109中OGT基因表达的抑制作用。方法：构建针对OGT基因的干扰载体,用质粒转染食管癌细胞Eca-109,RT—PCR分析干扰载体对OGT基因的抑制情况,Westernblot分析干扰后OGT蛋白的表达情况。结果：OGT基因在食管癌细胞Eca-109中高表达,三个干扰序列中瞬时转染干扰载体RNAi—OGTB—Ecal09的干扰效率最高,可达80％。稳转干扰OGT蛋白水平抑制率65．21％,与对照组相比有统计学意义（P〈0．05）,O—GlcNAc水平下降（RL2反映）率37．5％,与对照组相比有统计学意义（P〈0.05）。结论：用RNAi表达载体可以有效抑制食管癌细胞Eca-109中OGT基因的表达。     

慢病毒载体介导RNAi稳定抑制VASH1表达对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡影响的体外研究

目的 探讨运用慢病毒载体介导的RNA干扰技术抑制血管生成抑制因子1（VASH1）的表达对人脑胶质瘤U-87MG细胞增殖和凋亡的影响。方法 应用pGCL-GFP质粒构建针对VASH1的慢病毒shRNA载体,转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度的慢病毒转染人脑胶质瘤U-87MG细胞;通过RT-PCR和Western blot评价其对U-87MG细胞内VASH1表达的影响;用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察U-87MG细胞增殖活性的改变;用流式细胞仪（FCM）检测U-87MG细胞凋亡的变化。结果 与转染阴性对照组和空白组相比,转染pGCL-GFP-VASH1慢病毒载体的U-87MG细胞VASH1的mRNA 蛋白表达水平明显降低（P<0.01）;细胞的增殖活性显著上调（P<0.01）,细胞凋亡明显减少（P<0.01）。结论 VASH1 shRNA慢病毒载体可抑制VASH1在人脑胶质瘤U-87MG细胞中的表达,并增加肿瘤细胞的增殖活性,抑制细胞凋亡。     

低氧诱导因子-1αRNAi表达质粒对卵巢癌细胞影响的实验研究

目的：探讨人HIF-1α短发夹 （sh） RNA表达质粒对卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因的表达及对紫杉醇敏感性的影响。方法： 构建HIF-1α （sh） RNA表达质粒, 脂质体法转染, RT-PCR和Western blot检测癌细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测癌细胞对紫杉醇的敏感性。结果： 转染质粒48 h后, H质粒转染组SKOV3细胞紫杉醇作用24 h的IC50值明显降低 （P<0.05）, 同时P-糖蛋白表达水平显著降低, 差异有统计学意义 （F=7.24, P=0.01）。结论： 针对HIF-1α的RNAi表达质粒可下调低氧培养的卵巢癌细胞SKOV3 HIF-1α基因mRNA和蛋白及P-gp的表达, 从而提高癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

5-Aza-dC对胰腺癌细胞系Panc-1中TFPI-2基因甲基化水平及表达的影响

目的探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-A2a-dc)对胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）甲基化水平及基因表达的影响。方法用不同浓度5-Aza-dC处理胰腺癌细胞系Panc-1。用甲基化特异性PCR（MS-PCR）,反转录聚合酶链（RT-PCR）及蛋白印迹实验（Western blot）检测药物处理前后Panc-1细胞TFPI-2基因的甲基化状态,mRNA及蛋白表达的改变。结果MSP检测Panc-1细胞TFPI-2基因药物作用后异常甲基化得到逆转,RT-PCR检测到不同浓度5-Aza-dC处理后TFPI-2基因mRNA重新表达,相对表达量分别为（0.211±0.087）,（0.327±0.068）,（0.609±0.017）,Western blot检测TFPI-2基因蛋白重新表达,相对表达量分别为（0.429±0.121）,（0.675±0.044）,（1.132±0.124）,以上作用呈时间、剂量依赖性（P<0.05）,差异具有统计学意义。结论胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因TFPI-2启动子高甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5-Aza-dC能够较成功的逆转胰腺癌细胞Panc-1中TFPI-2基因的高甲基化状态,并能恢复TFPI-2基因的mRNA及蛋白重新表达。     

ERK1/2-Sp1信号通路对肺癌细胞VEGF的调控作用

背景与目的:了解ERK1/2-Sp1信号通路对肺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)基因的调控作用.材料与方法:采用激酶特异抑制剂PD98059抑制ERK1/2的活性,Western blot检测ERK1/2的表达.RNA干扰技术沉默Sp1基因,Mercury信号通路系统检测Sp1的转录活性.RT-PCR检测VEGF和Sp1基因的变化. 结果:ERK1/2激酶的活性几乎可被150μmol/L PD98059完全抑制,ERK1/2激酶活性下调伴随VEGF的表达下降.PD98059下调Sp1转录因子的活性.Sp1基因沉默后VEGF的表达量下调. 结论:在肺癌细胞中存在ERK1/2-Sp1-VEGF信号通路,ERK1/2激酶调控VEGF的表达可能部分依赖于转录因子Sp1的活性.     

即时荧光定量PCR检测吉西他滨诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡通路关键基因ASK1的高表达

目的 检测抗癌药吉西他滨（gemcitabine）诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡的关键基因ASK1的高表达。方法 应用即时荧光定量PCR技术检测50．33μg／mL吉西他滨作用于胰腺癌Panc-1细胞48h后凋亡基因ASK1表达的变化。结果 吉西他滨作用于胰腺癌Panc-1细胞48h后凋亡基因ASK1高表达,比值为2．64E-02／1．25E-02=2．112,与基因芯片结果2．107622018非常接近。结论 吉西他滨诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡,ASK1高表达。     

MTA1、VEGF在化疗后骨肉瘤中的表达及其意义

目的 研究化疗后骨肉瘤组织中残存肿瘤细胞MTA1、VEGF的表达在骨肉瘤发生、发展中的作用及其与预后的相关性.方法 应用免疫组化技术检测36例化疗后骨肉瘤组织残存肿瘤细胞中MTA1、VEGF的表达,应用统计学方法分析二者与预后的关系.结果 化疗后残存肿瘤细胞MTA1、VEGF的阳性表达率分别为55.56%(20/36)、44.44%(16/36),统计学分析显示与患者的预后有相关性,二者联合表达的患者预后更差.结论 化疗后骨肉瘤中残存肿瘤细胞MTA1、VEGF阳性表达的患者预后差,同时检测有助于评价患者预后.     

基因芯片技术筛选Gemcitabine诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡相关基因的研究

目的研究抗癌药吉斯他滨（Gemcitabine）诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡的相关基因。方法应用基因芯片技术检测50．33μg／mL Gemcitabine作用于胰腺癌Panc-1细胞48h后凋亡基因表达的变化。结果Gemcitabine抑制细胞表达14种凋亡相关基因，包括IRF-4、Scotin、14．3．3gamma、PDE4、GRPS、TID1、AFP、STAT5、Sox-4、c-Rel、MYCN、Htt、CatD、Gd。相反，gemcitabine促进了3种凋亡相关基因的表达，包括CyclinB1、ASK1、AKT2。结论Gemcitabine诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡通过非依赖caspase ASK1途径。     

上皮性卵巢癌中VEGF、sFlt1的表达及临床意义

目的:探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其可溶性受体sFlt1在上皮性卵巢肿瘤患者血清、腹水、瘤液中的表达及其临床意义。方法:采用ELISA法检测34例上皮性卵巢癌患者血清、腹水、瘤液中VEGF及sFlt1的表达。结果:1)卵巢癌组术前血清VEGF明显升高,早期已显著升高,其作为区别良恶性卵巢肿瘤的标志物,灵敏度为76.5%,特异度为75.0%,阳性预测值为75.4%,阴性预测值为76.1%。2)卵巢癌组术前血清sFlt1显著降低,VEGF/sFlt1比值较对照组增长近10倍。腹水、瘤液中VEGF及sFlt1均明显高于相应的血清水平。结论:卵巢癌患者处于严重的血管生成失衡状态。术前血清VEGF是较好的血清标志物,对早期卵巢癌的辅助诊断有一定价值;术后血清观察VEGF、sFlt1变化有利于进一步监测卵巢癌病情发展。     

Id1对结肠癌HT-29细胞VEGF表达及增殖的影响

目的探讨分化抑制因子１(inhibitor of differentiation-1,Id1)对结肠癌HT-29细胞VEGF表达的影响及Id1在结肠癌细胞增殖中的作用。方法HT-29转染Id1表达质粒及Id-1干扰序列后,采用RT-PCR方法和Western blot法检测VEGF mRNA和蛋白的表达,MTT法检测各组细胞增殖情况。结果 Id1过表达能显著上调VEGF mRNA和蛋白表达(P<0.01),促进细胞的生长(P<0.01);Id1抑制后能显著下调VEGFmRNA和蛋白表达(P<0.01),减缓细胞的生长(P<0.01)。结论在结肠癌HT-29细胞中Id1为VEGF的上游基因,Id1可通过正性调控VEGF影响结肠癌细胞增殖。     

Expression of VEGF and its receptor genes in intracranial schwannomas

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is considered to be a major regulator of angiogenesis in various brain tumors. In this study, we determined the expression levels of VEGF, and vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-1 and -2 mRNA in 46 intracranial schwannomas by quantitative real-time PCR, and correlated these with various clinical factors or other molecular markers. We found that these tumors expressed significant amounts of VEGF mRNA in comparison with other brain tumors, including malignant gliomas and meningiomas. In addition, we performed immunohistochemical studies for VEGF and VEGFR-1, and confirmed that these tumors prominently express these proteins. The expression levels of VEGF and VEGFR-1 mRNA in recurrent tumors were higher than those in primary tumors. When we divided patients into two groups according to VEGF mRNA expression in the tumor, there was no significant difference in patient age, gender, or cranial nerves of origin between groups; however, the tumor volume tended to be larger in the high VEGF group than in the low VEGF group. The levels of VEGFR-1 mRNA and neurofibromatosis-2 mRNA in the high VEGF group were significantly greater than those in the low VEGF group. Levels of VEGFR-2 mRNA and DNA topoisomerase IIα mRNA, and the MIB-1 labeling index in the high VEGF group were slightly higher than those in the low VEGF group; however, the difference was not statistically significant. Based on these observations, the significance of VEGF and its receptor genes in intracranial schwannomas is discussed.     

人肝细胞癌VEGF及受体的表达与临床病理的关系

目的:分析VEGF及其受体flt-1/flk-1蛋白表达与肝细胞癌临床病理的关系.方法:应用ABC免疫组化染色法,检测60例肝细胞癌中VEGF、flk-1、flt-1蛋白表达情况,并分析它们与肝细胞癌临床病理的关系.结果:60例肝细胞癌组织中VEGF、flk-1、flt-1蛋白的阳性表达率分别为81.3%、88.3%、80.0%,均明显高于正常肝组织(P＜0.05);并且VEGF蛋白表达与肿瘤的病理分级、有无包膜、瘤栓、直径大小均有相关性.结论:VEGF蛋白表达水平越高,细胞恶性程度及侵袭、转移能力越强,并且VEGF与flt-1/flk-1在肿瘤形成过程中具有协同作用.