小鼠胚胎干细胞培养条件的探索

目的: 探讨小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的培养特点及生物学特性,为ES细胞的应用研究奠定基础.方法: 小鼠胚胎成纤维细胞原代培养,3～5代的细胞作为饲养层细胞培养ES细胞.另在无饲养层细胞、明胶包被培养皿、培养液中含白血病抑制因子条件下培养小鼠ES细胞,观察2种情况下ES细胞的生长情况.结果: 小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,ES细胞在2种条件下均能呈克隆状生长,且保持未分化状态,碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性.结论: 2种条件下ES细胞均能良好生长.     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

小鼠胚胎干细胞饲养层制备条件的研究

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于分离克隆胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞).方法:取妊娠13.5～14.5d的胎鼠,采用组织消化法结合组织块培养法分离、培养小鼠成纤维细胞;MTT法测定细胞生长曲线,结合倒置显微镜观察筛选小鼠成纤维细胞饲养层的最佳种植密度;MTT法筛选丝裂霉素c作用的最佳浓度和时间.取妊娠3.5d的小鼠囊胚在经丝裂霉素C处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞生长情况.结果:组织消化法结合组织块培养法是分离培养小鼠成纤维细胞的较好的方法;1 × 105～2×105个/ml种植密度适于饲养层铺板;丝裂霉素c 10μg/ml作用3.5h或20μg/ml作用2.5h能抑制成纤维细胞增殖,细胞至少在7d内维持稳定的水平;妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成Es集落.结论:制备的胎鼠成纤维细胞饲养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长.     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作

目的：建立ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系，用于胚胎干细胞建系及研究。方法：选取不同胎龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞，制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理，以细胞形态、生长曲线、囊胚种植情况为饲养层评价指标。结果：ICR小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄12．5～14．5d进行原代细胞分离；12．5d为最佳分离时间；13．5和14．5d分离的细胞需在3代以后使用；6代以前细胞可用于饲养层制作；20mg/L丝裂霉素C作用2．5h可达到较好的处理效果。结论：ICR小鼠可用来分离、培养胚胎成纤维细胞，用于胚胎干细胞饲养层的制作。     

用饲养层分离胚胎干细胞集落的实验初探

目的 用饲养层分离胚胎干细胞集落。方法 用胚龄为13~14 d的小鼠胚胎分离原代成纤维细胞，制成饲养层，用于囊胚的培养。结果 小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）贴壁能力较好，增殖快，易铺层。囊胚和内细胞团（ICM）在饲养层上贴壁生长良好，当培养4~5 d时，其增殖率为16/28（57%）。在ICM离散48 h后，各种胚胎干细胞（ES）集落开始出现。此种集落经碱性磷酸酶染色成阳性。结论 用饲养层分离胚胎干细胞获得初步成功。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制

目的 建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系，用于分离和克隆胚胎干细胞研究。方法 取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞，观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响，以及丝裂霉素C对细胞增殖的抑制作用；细胞增殖的数量用MTT法测定。结果 分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12．5—14．5d；20℃-25℃时，用0．25％胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min；可在培养3—6d后进行传代。细胞冻存于-80℃3-4个月，复苏后能正常传代。丝裂霉素C抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg/10^5细胞，作用2-4h，可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d内不增殖也不死亡。结论 在合适条件下，小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养，并能多次传代和冻存；经丝裂霉素C处理后增殖受抑制，可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。     

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备条件的研究

目的：建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层最佳分离培养及丝裂霉素C(MMC)处理的方法,用于培养胚胎干细胞。方法：取不同胎龄的胎鼠分离原代成纤维细胞,观察不同胎龄和培养、分离条件对细胞增殖的影响;观察不同浓度和不同作用时间下MMC对细胞增殖的抑制作用。用MTT法测定细胞增殖的数量。取妊娠3．5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果：制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄是12．5～14．5d：室温条件下,0．25％胰蛋白酶消化时间最好在3～5min之内：原代细胞培养2～4d后即可传代,MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是20μg/ml,2～4h,成纤维细胞饲养层可以维持10d。囊胚在饲养层上能发育成典型的“鸟巢”状干细胞集落。结论：从12．5～14．5d胎龄小鼠胚胎分离培养的胚胎成纤维细胞质量最佳,经20μg／ml MMC处理2～4h后,可以作为饲养层用于胚胎干细胞的分离克隆。     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

小鼠胚胎干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的 探索小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ES cell）体外分化为神经前体细胞（Neural precursor cells,NPC）的无血清培养条件,比较人胚胎成纤维细胞（Human embryonic fibroblasts,HEF）与小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）对小鼠ES细胞生长的作用。方法 在MEF或HEF饲养层上培养ES细胞,培养液中含白血病抑制因子。采用无血清方法培养NPC,免疫组化方法检测巢蛋白（Nestin）,用硝基四氮啖蓝/5-溴-4-氯-吲哚基磷酸（NBT/BCIP）显色检测碱性磷酸酶。结果 无血清培养可以获得86%的NPC。HEF与MEF-样能维持ES未分化状态。结论 无血清培养方法有利于ES细胞向NPC分化,HEF可用于小鼠ES细胞的培养,而且比MEF优越。     

胎鼠牙胚细胞体外培养研究

目的 摸索正常胎鼠牙胚细胞离体培养所需条件，为进一步将其作为牙组织工程种子细胞奠定基础。方法 体视显微镜下取17d龄胎鼠下颌第一磨牙牙胚，胶原酶／分离酶消化，以含10％胎牛血清(FCS)的DMEM为培养基进行原代培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长特点，MTT法测定细胞活性绘制生长曲线，取原代培养4～9d的细胞进行组织化学和免疫组织化学染色。结果 倒置显微镜下观察，培养细胞在24h内贴壁，约7～9d生长连成片状。细胞有多角形、大而扁平梭形和长梭形几种形态。生长曲线表明：培养细胞在前3天生长缓慢，第4天呈对数生长，第7天达高峰。免疫组化结果表明：培养细胞来源于两种组织。结论 采用酶消化培养法，用胶原做基质饲养层，含10％FCS的低糖DMEM作为培养基，能将胎鼠牙胚细胞培养成活，并维持其细胞学特征。     

胚胎干细胞向肝细胞定向诱导分化的体外实验研究

目的 探讨胚胎干细胞体外定向诱导分化为肝细胞的条件和机制。方法 选用Balb／c小鼠胚胎干细胞,经过拟胚体发育分化5d后开始定向诱导培养,将拟胚体转入白明胶处理的培养板中贴壁生长,在不同时间段分别在细胞培养基中添加酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、肝细胞生长因子(HGF)等细胞生长因子进行肝细胞定向诱导。细胞分化过程的形态学变化用倒置显微镜追踪观察;用放免法对细胞培养上清中抗小鼠甲胎蛋白(AFP)和抗小鼠白蛋白(ALB)进行动态检测,用免疫细胞化学法检测肝细胞分化标记物AFP,ALB,CK8,CK18,并计算其阳性表达率(肝细胞分化率)。结果 胚胎干细胞在重组小鼠白血病抑制因子(LIF)存在的情况下保持未分化生长状态,撤去LIF后很快发育为拟胚体并继续分化。在第8天检测到上清中AFP出现,浓度为3．4n/ml,ALB在第11天开始检测到,浓度为0．2μg／ml,随培养时间延长,AFP和ALB浓度逐渐增加。第8天分化细胞开始出现AFP阳性,第10天出现CK8、CK18阳性,第11天出现ALB阳性,阳性细胞结构符合正常肝细胞结构特点。计算分化细胞中ALB阳性细胞率,得到肝细胞的分化率为30％。结论 胚胎干细胞经过拟胚体发育阶段,在特定培养条件和aFGF、HGF、等生长因子的作用下,可定向分化为肝细胞,这种细胞分化系统有望成为肝细胞替代疗法中的新型肝细胞来源。     

Hepatic differentiation from embryonic stem cells in vitro

Objective To investigate an method for hepatic differentiation from embryonic stem cells (ES cells) in vitro and the resulting differentiation ratio, in order to develop a procedure for producing a new type of hepatocyte for hepatocyte replacement therapy in the treament of liver failure.Methods ES cells from Balb/C mice were cultured and maintained in an undifferentiated state in gelatin-coated dishes using Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) containing 1000 U/ml leukemia inhibitory factor (LIF). Then, LIF was withdrawn from the DMEM to allow the ES cells to develop into embryonic bodies (EBs). EBs were plated onto tissue culture dishes, and growth factors such as acidicfibroblast growth factor (aFGF) and hepatocyte growth factor (HGF) were added to the medium to promote directional differentiation. The course of development and differentiation was observed dynamically using an inversion microscope. The expression of hepatic proteins, such as α-fetoprotein (AFP), albumin (ALB), cytokeratin 8 (CK8), cytokeratin 18 (CK18), in cytoplasm was analyzed by immunocytochemistry (ICC). The concentration of ALB in the medium was determined dynamically by radioimmunoassay (RIA). Results ES cells replicated as clones, without differentiating, in DMEM containing LIF. They developed into EBs in medium without LIF. Our ICC assay showed that differentiating cells did not express hepatic proteins, such as AFP, ALB, CK8, and CK18 until day 7, day 9, day 11, and day 11, respectively (up to 2 days later when growth factors are not present). The concentration of AFP in the medium was first detected on day 8, at a concentration of 3.4 ng/ml, and increased to 22.8 ng/ml by day 15. The concentration of ALB in the medium was 0.2 μg/ml on day 11, and increased to 2.2 μg/ml by day 15. ALB-positive cells under ICC manifest morphological structures were consistent with normal mouse hepatocytes. The differentiation ratio of hepatocytes in the ES cell differentiation system was 30％ on day 15 (significantly lower without the presence of growth factors).Conclusions ES cells can differentiate into mature hepatocytes. Growth factors, such as aFGF and HGF, can enhance this differentiation and produce sufficient numbers of functional hepatocytes. This method may be a reliable new way of differentiating ES cells into hepatocytes for use in replacement therapy in the treament of liver failure.     

分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因素

目的　研究不同培养条件分离和克隆小鼠ES细胞集落的效率。方法　以PMEF饲养层、NIH3T3细胞饲养层或培养液中加入LIF为培养条件 ,分离和克隆昆明小鼠ES细胞集落 ,比较其效率。结果　饲养层的培养条件明显优于培养液中加入LIF的培养条件 ;有饲养层的培养条件下 ,桑椹胚的ES细胞集落出现率显著低于囊胚 ;两种饲养层培养囊胚 ,其ES细胞集落的出现率差异无显著性。结论　以PMEF或NIH3T3细胞作饲养层 ,培养昆明小鼠的囊胚 ,适时离散ICM ,是比较理想的分离ES细胞集落的方法。     

胚胎干细胞向胆管上皮细胞定向分化的体外实验研究

目的探讨胚胎干细胞（ES细胞）体外定向分化为胆管上皮细胞（BE细胞）的诱导条件和分化规律。方法选用小鼠ES细胞,首先进行拟胚体分化,然后在培养系统中按不同时间段分别添加转化生长因子（TGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、肝细胞生长因子（HGF）和上皮生长因子（EGF）等,使ES细胞向BE细胞方向分化。用免疫细胞化学等方法检测BE细胞标记物细胞角蛋白7（CK7）、细胞角蛋白19（CK19）,γ-谷胺酰转肽酶（GGT）的表达,观察其表达时间和空间分布规律。结果ES细胞分化第10天,在拟胚体细胞分化群落中出现一种环状结构并有CK7和GGT表达,分化第13天时有CK19表达,三者的表达都随培养时间延长而增强;光镜下阳性细胞结构符合立方上皮细胞形态学特点。结论ES细胞在特定培养条件和细胞生长因子的作用下,可以定向分化为BE细胞并可以形成类胆管样结构。     

Development of neural precursor cells from mouse embryonic stem cells

Embryonicstemcells(EScells)arederivedfromtotipotentcellsofearlyembryoandpossessunlimited,undifferentiatedproliferationinvitro[1].EScellshavetheinherentcapacityofdifferentiatingintoallcelltypesofthenervoussystemasdemonstratedbytheex-perimentthatchimericmicewereformedfromem-bryosinwhichEScellsaretransplantedintotheinnercellmass[2].ThesuccessfulestablishmentofhumanEScelllineindicatedprofoundimplicationthatEScellsmayprovideavirtuallyunlimiteddonorsourcefortransplantation[3]. Threepaperspublish…     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子（LIF）的关系。方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养。扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志（CD9、SSEA1和Flk-1）的表达情况。分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达。将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力。Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率。结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1。残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志。残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤。单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力。结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长，细胞排列紧密，呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系

目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(iPS细胞)?方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体pCAG-pLIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-pLIF细胞)?通过RT-PCR?qPCR?Western blot等方法检测STO-pLIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-pLIF细胞作为饲养层,培养大鼠iPS细胞?通过生长曲线检测?碱性磷酸酶染色?干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-pLIF细胞饲养层在大鼠iPS细胞培养方面的功能?结果:STO-pLIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P < 0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠iPS细胞在形态?多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠iPS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠iPS存在差异(P < 0.05)?结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-pLIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠iPS细胞培养中具有一定优势?