人骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及成骨分化

背景：国内外对骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导分化研究手段、测定指标均不够全面。 目的：建立并完善一整套人骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定方法,探讨其体外成骨分化能力。 方法：采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面表型。传至第3代时更换成骨诱导培养基进行成骨分化诱导。 结果与结论：人骨髓间充质干细胞生长旺盛,传代后增殖旺盛,第3代骨髓间充质干细胞表面表型CD44、CD73、CD90表达阳性,CD34表达阴性。诱导后的成骨细胞碱性磷酸酶活性增加,Gomori、Von kossa、茜素红染色均阳性。RT-PCR检测诱导后细胞有Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白及骨连接蛋白基因的表达,证明了人骨髓间充质干细胞成功向成骨方向分化。表明实验建立了一整套稳定、成熟的骨髓间充质干细胞分离、培养、扩增方案。     

骨髓间充质干细胞与不同基质修饰的纳米晶胶原基骨体外生物相容性研究

研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导培养后与不同基质修饰的纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen,nHAC)的生物相容性,为骨组织工程提供一种新型复合支架材料。SD大鼠MSCs经成骨诱导培养、扩增,进行成骨细胞表征后,种植与支架材料体外复合培养。实验分为4组:实验组A,纤维蛋白(FB)和纤维连接蛋白(FN)修饰的纳米晶胶原基骨((FB FN)-nHAC);实验组B,纤维蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FB-nHAC);实验组C,纤维连接蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FN-nHAC);对照组D,单纯的纳米晶胶原基骨(nHAC)。通过检测支架材料的细胞黏附率、不同时间点(3、7、10、14d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶活性以及扫描电镜观察细胞在材料上的生长状况,比较分析不同支架材料与细胞生物相容性差异。大鼠MSCs经诱导培养14d后,碱性磷酸酶细胞化学染色、I型胶原免疫荧光染色及矿化沉积茜素红染色均为阳性;细胞与支架材料黏附率A组最高为74.4%;支架材料中细胞数量均随培养时间延长而增长,且A组细胞数增加较快,与相同时相点其他各组材料中细胞数差异有显著性(P<0.05);各时相点细胞碱性磷酸酶活性表达A组最高,差异亦有显著性(P<0.05)。电镜观察发现4组材料上均有细胞生长,但A组的细胞生长状况明显好于其他组。大鼠MSCs经成骨诱导培养,可表达成骨细胞表型,(FB FN)-nHAC在体外实验中表现出与细胞优良的生物相容性,可作为较理想的新型复合支架应用于骨组织工程。     

定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞

目的建立体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为成骨细胞的模型,为将MSC3用作骨组织工程的种子细胞奠定基础。方法用成骨添加剂（地塞米松10^-8mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol／L、维生素C50mg/L）定向诱导传代大鼠骨髓MSCs分化为成骨细胞,通过形态学、生长曲线、免疫细胞化学及碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞。结果诱导组具有成骨细胞的形态和生长特点,增殖相对缓慢,但与对照组间的差异没有统计学意义（P〉0．05）,碱性磷酸酶活性增强。结论建立了体外定向诱导大鼠骨髓MSCs向成骨细胞转化的模型,成骨添加剂不影响细胞的增殖,可迅速大量获得种子细胞。     

成人脂肪间充质干细胞的定向成骨诱导

背景：脂肪分离可获得大量的间充质干细胞并成功向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化。 目的：建立成人脂肪间充质干细胞体外分离培养、成骨分化方法,并探讨脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景。 方法：通过胶原酶消化法从成人脂肪中分离间充质干细胞,进行体外培养,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,成骨诱导液诱导干细胞向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶,骨桥蛋白表达变化。 结果与结论：利用脂肪抽吸液成功培养出脂肪间充质干细胞,且能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞仪检测证实有特定的间充质干细胞表面标记物表达;成骨诱导脂肪间充质干细胞后呈典型的成骨细胞形态;碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色后可见钙结节形成,成骨诱导培养0,3,7,14,21,28 d,RT-PCR定量检测结果证实碱性磷酸酶、骨桥蛋白阳性表达。说明用酶消化法可以从人脂肪中分离得到脂肪间充质干细胞;脂肪间充质干细胞可向骨细胞诱导分化,阳性表达骨桥蛋白,碱性磷酸酶,是一种优良的骨组织工程的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

透明质酸钠可作为成骨诱导后骨髓间充质干细胞的载体

目的:研究透明质酸钠作为组织工程骨支架的可行性.方法:体外培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),在成骨诱导剂地塞米松等的诱导下,向成骨细胞转化,并使之与透明质酸钠凝胶复合,通过倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察细胞贴附情况.结果:地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,碱性磷酸酶表达明显增高,并表达Ⅰ型胶原.体外复合培养10 h,成骨细胞即开始于透明质酸钠凝胶中伸展生长,复合培养7 d,成骨细胞在凝胶中分化增殖,分泌细胞外基质.结论:适当浓度成骨诱导剂可成功地将兔MSCs向成骨细胞诱导,透明质酸钠是骨组织工程的良好载体.     

豚鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景：利用骨髓间充质干细胞的取材灵活性及快捷性,对已掌握的培养技术及成骨诱导进一步探索性研究。 目的：通过建立豚鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养法,探讨豚鼠骨髓间充质干细胞表型特征以及多项分化潜能。 方法：利用贴壁培养法分离纯化豚鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,流式细胞分析检测细胞表面分子CD29、CD44、CD45的表达。分别采用成骨诱导培养液和成脂诱导培养液定向诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化。 结果与结论：原代分离的骨髓间充质干细胞在接种后96 h贴壁,细胞形态为椭圆形,多角形及短梭形,8 d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化,细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,而且生长速率加快。流式细胞检测 CD29、CD44阳性率分别为95.7%和65.7%。不同诱导剂定向诱导后,经油红O、茜素红S、碱性磷酸酶染色、免疫组织化学Ι型胶原酶鉴定,P3代骨髓间充质干细胞分别向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果表明,通过贴壁筛选方法,体外分离培养的豚鼠骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力,并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导

目的分离培养绿色荧光蛋白(GFP)小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并成骨诱导分化。方法密度梯度离心法分离GFP小鼠MSCs，体外传代扩增，条件培养基成骨方向诱导，利用荧光显微镜、HE染色、细胞化学和免疫组织化学方法进行观察。结果MSCs在传代和诱导分化过程中稳定表达GFP，经成骨方向诱导10d后，出现大量碱性磷酸酶和骨钙素染色阳性细胞。结论成功分离了GFP小鼠MSCs，并体外向成骨方向诱导分化。     

纳米晶胶原基骨/血管内皮生长因子缓释支架对人骨髓间充质干细胞体外粘附增殖的影响

研制纳米晶胶原基骨(nHAC)/血管内皮生长因子(VEGF)缓释支架,了解VEGF体外缓释效果及对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)成骨诱导后粘附、增殖的影响,为骨组织工程寻求一种新型复合支架材料.利用生物学方法将VEGF负载于nHAC,制备具有VEGF缓释效果的复合支架;hMSCs经体外培养、扩增、成骨诱导后种植于VEGF缓释支架上行体外增殖.分为四组:实验组A:nHAC、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、肝索(heparin,HP)和VEGF(nHAC-FN-HP-VEGF);对照组B:nHAC、FN和VEGF(nHAC-FN-VEGF);对照组C,nHAC、HP和VEGF(nHAC-HP-VEGF);对照组D:nHAC和VEGF(nHAC-VEGF).通过检测支架材料上VEGF的释放量和持续时间,及种植细胞后细胞的黏附率、不同时间点(3、7、10、14 d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶活性以及扫描电镜观察细胞在材料上的生长状况,比较分析不同复合支架材料对细胞粘附、增殖的影响.人第三代MSCs 经诱导培养14 d后,碱性磷酸酶细胞化学染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色均为阳性;实验组A的VEGF缓释量最高,持续时间最长(可达14 d),细胞黏附率最高,为61.8%;各组支架中的细胞数量均随培养时间延长而增长,实验组A的细胞数增加较快,与相同时间点其他各组材料中细胞数差异有显著性(P<0.05);各时间点细胞碱性磷酸酶活性表达实验组最高,差异亦有显著性(P<0.05).电镜打描发现4组材料上均有细胞生长,实验组A的细胞增殖、分化状况明显好于其他组.hMSCs经诱导培养后可具有成骨细胞特性,hHAC-FN-HP-VEGF缓释支架具有较好的VEGF缓释效果,能显著提高细胞的粘附和增殖,可作为较理想的新型复合支架应用于骨组织工程.     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。 目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。 方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von Kossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。 结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

流动优化骨髓间充质干细胞的分化状况

背景：间充质干细胞在成体动物骨髓中含量极低。 目的：观察成年大鼠骨髓间充质干细胞经生理范围流动切应力作用后,其体外生长规律、增殖及定向分化为成骨细胞及脂肪细胞的能力。 方法：在体外取得SD大鼠骨髓原代间充质干细胞,利用平板流室系统加载1 Pa切应力,对其进行培养及扩增,并分别向成骨细胞及脂肪细胞定向诱导。 结果与结论：原代间充质干细胞为长梭形或多角形,集落样生长;经流动加载并传代后细胞生长速度加快,不以集落方式生长,而是均匀分布。细胞体积明显增大,多数为长梭形或多角形;生长曲线显示各代细胞有类似的生长规律;激光共聚焦显微镜显示CD44和CD90阳性,CD31及CD45阴性;向成骨细胞及脂肪细胞诱导14 d后,Von Kossa染色及油红O染色均为阳性,流动优化后骨髓间充质干细胞保持了体外大量增殖及多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨内生长以及成骨潜能

背景：纳米晶胶原基骨修复材料是根据仿生原理制备的纳米骨框架材料,其微结构和成分两方面都与天然骨有相似性 ,具有良好的生物相容性。 目的：研究兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度,以及构建组织工程骨的可行性。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞,体外培养、纯化,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养,第3,7,20天后激光共聚焦和扫描电镜观察二者复合程度。 结果与结论：骨髓间充质干细胞和纳米晶胶原基骨修复材料复合良好,共聚焦显微镜和环境扫描电镜观察均可见细胞生长;纳米晶胶原基骨修复材料能够作为良好的支架,它能使骨髓间充质干细胞在其内稳定生长。提示骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨修复材料内能很好的生长,并且具有成骨潜能。     

兔BMSCs体外培养及其向成骨细胞分化的实验研究

目的　探讨培养兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化,为骨组织工程研究提供种子细胞。方法　取 2月龄新西兰大耳白兔,麻醉后取骨髓,直接进行原代培养,传代后观察其生长特性,绘制生长曲线并加诱导液使其 向成骨细胞方向分化,并分别用钙钴法检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测钙结节,免疫组化染色检测Ⅰ型胶原,透 射电镜观察胞质中钙质成分。结果　原代培养中出现大量细胞克隆,传代后细胞呈旋涡状密集生长,加入诱导液 后细胞形态发生改变并向成骨细胞分化,胞质内见有呈黑色的碱性磷酸酶颗粒和Ⅰ型胶原反应产物,并见有多个 细胞形成的钙化结节,电镜下观察到胞质中含有许多基质小泡,几天内成骨细胞数可达1×106/L。结论　培养兔 骨髓基质干可向成骨细胞方向分化,作为骨组织工程的种子细胞。     

Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells

Recellularization of whole decellularized lung scaffolds provides a novel approach for generating functional lung tissue ex vivo for subsequent clinical transplantation. To explore the potential utility of stem and progenitor cells in this model, we investigated recellularization of decellularized whole mouse lungs after intratracheal inoculation of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs). The decellularized lungs maintained structural features of native lungs, including intact vasculature, ability to undergo ventilation, and an extracellular matrix (ECM) scaffold consisting primarily of collagens I and IV, laminin, and fibronectin. However, even in the absence of intact cells or nuclei, a number of cell-associated (non-ECM) proteins were detected using mass spectroscopy, western blots, and immunohistochemistry. MSCs initially homed and engrafted to regions enriched in types I and IV collagen, laminin, and fibronectin, and subsequently proliferated and migrated toward regions enriched in types I and IV collagen and laminin but not provisional matrix (fibronectin). MSCs cultured for up to 1 month in either basal MSC medium or in a small airways growth media (SAGM) localized in both parenchymal and airway regions and demonstrated several different morphologies. However, while MSCs cultured in basal medium increased in number, MSCs cultured in SAGM decreased in number over 1 month. Under both media conditions, the MSCs predominantly expressed genes consistent with mesenchymal and osteoblast phenotype. Despite a transient expression of the lung precursor TTF-1, no other airway or alveolar genes or vascular genes were expressed. These studies highlight the power of whole decellularized lung scaffolds to study functional recellularization with MSCs and other cells.     

Bone marrow stromal cells as targets for gene therapy

The bone marrow (BM) is composed of the non-adherent hematopoietic and adherent stromal cell compartment. This adherent BM stromal cell fraction contains pluripotent mesenchymal stem cells (MSCs) and differentiated mesenchymal BM stromal cells. The MSCs self-renew by proliferation while maintaining their stem-cell phenotype and give rise to the differentiated stromal cells which belong to the osteogenic, chondrogenic, adipogenic, myogenic and fibroblastic lineages. A more primitive adherent stem cell was recently identified, the multipotent adult progenitor cell (MAPC) or mesodermal progenitor cell, which co-purifies with MSCs. These MAPCs differentiate into MSCs, endothelial, epithelial and even hematopoietic cells. BM stroma cells, including the primitive pluripotent MSCs and MAPCs, are attractive targets for cell and gene therapy. The BM stromal cell population and its multipotent stem cells can be engineered to secrete a series of different proteins in vitro and in vivo that could potentially treat a variety of serum protein deficiencies and other genetic or acquired diseases, including bone, cartilage and BM stromal disorders or even cancer.     

天然脑活素定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的： 探讨天然脑活素（NC）诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法: 取6-8周龄SD大鼠,无菌获取胫骨和股骨骨髓,全骨髓贴壁筛选法分离培养并纯化大鼠MSCs,应用天然脑活素诱导MSCs向神经元分化。倒置相差显微镜追踪比较观察分化过程中细胞形态的变化,免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测神经元特异性标志物：巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。免疫细胞化学检测细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果：经全骨髓贴壁筛选法获得了纯度较高（90%以上）的大鼠MSCs,天然脑活素含药血清诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,分别从mRNA和蛋白水平上证实诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和nestin,不表达神经胶质细胞标记物GFAP。诱导分化后细胞MAP-2的表达明显。结论：天然脑活素可诱导MSCs向神经元样细胞的定向分化。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。 目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。 方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子β1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA的表达。 结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96.97%的细胞表达CD44、13.72%的细胞表达CD45,第2代有99.11%的细胞表达CD44、8.54%的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

骨髓间充质干细胞体外增殖及分化过程中Notch信号的表达变化

目的研究Notch信号系统对骨髓间充质干细胞的增殖与分化的调控作用。方法用密度梯度离心法分离培养犬骨髓间充质干细胞,观察其增殖及传代情况,并进行成骨、成软骨及成心肌细胞诱导,Western blot检测细胞增殖及分化过程中Notch信号蛋白的表达。结果骨髓间充质干细胞呈梭形、旋涡样生长,增殖及传代能力强,可在体外形成钙结节,分化为软骨细胞,免疫组化示心肌细胞标志物的表达。Western blot显示在增殖过程中可见Notch信号蛋白的表达,为1.00±0.13,当分化为骨细胞及心肌细胞时,其表达上调,分别为1.20±0.14及1.70±0.17,与增殖的干细胞相比有明显差异(P<0.05)。结论 Notch信号系统对骨髓间充质干细胞的增殖及分化起重要的调控作用。     

骨髓间质干细胞在扩张型心肌病微环境中的分化研究

目的：探讨骨髓间质干细胞（MSCs）自体移植后在扩张型心肌病（DCM）微环境中分化为心肌细胞和血管内皮细胞的可行性。 方法： 用健康日本大耳白兔分离培养MSCs，盐酸阿霉素耳缘静脉注射复制兔DCM模型，将5溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记的MSCs移植到扩张型心肌病心肌内,4周后观察移植细胞的增殖分化情况。 结果： 细胞移植4周后，可以在实验组心肌内找到BrdU标记的阳性细胞，且一部分表现为心肌特异性肌钙蛋白T（troponin T）染色阳性，一部分Ⅷ因子相关抗原染色阳性并参与形成新生血管，对照组中没有发现。 结论： MSCs自体移植到扩张型心肌病后可以分化为心肌细胞和血管内皮细胞。     

姜黄素调控大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景：姜黄素能明显降低破骨细胞的骨重吸收,诱导破骨细胞凋亡,抑制破骨细胞形成。 目的：观察不同浓度姜黄素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。 方法：采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代后采用成骨培养基进行成骨诱导,在诱导前3 d于诱导培养基中分别加入0(对照),10,15 μmol/L姜黄素。 结果与结论：接种培养7 d,倒置显微镜下可见分散的骨髓间充质干细胞小集落,集落细胞呈放射状生长。随培养时间延长,细胞集落增大,细胞形态为长梭形。加入成骨培养基7 d后细胞形态逐渐由长梭形变为多角形,随成骨诱导时间延长形态变化更加明显。加入不同浓度姜黄素后骨髓间充质干细胞增殖无变化。姜黄素呈剂量依赖性促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性及Runx-2、血红素单加氧酶1的表达。提示姜黄素能有效促进大鼠骨髓间充质干细胞早期成骨分化,其机制可能与提高干细胞血红素单加氧酶1的表达有关。     

犬骨髓间充质干细胞定向分化为内皮细胞的研究

应用密度梯度离心法分离狗骨髓间充质干细胞,建立诱导分化内皮细胞的方法及条件。密度梯度离心法分离狗骨髓间充质干细胞后,在体外经血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、内皮细胞生长因子(Endothelial growth factor,EGF)等诱导后,分化形成内皮样细胞。结果表明:光镜下细胞单层融合生长,呈铺路石样形态,单个核位于中央。电镜下可见到Weibel-Palade小体,在细胞胞浆vWF染色阳性。骨髓间质干细胞,在体外可诱导分化成内皮细胞。