抗人结肠癌杂交瘤细胞系的建立及单克隆抗体特性研究

本研究利用手术中取得的新鲜结肠癌组织免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，制得５株能持续、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系。其中ＨＣ６株杂交瘤细胞经过１８０ｄ连续培养，单克隆抗体ＭＣ６分泌稳定、选择性强、效价高。免疫组化检测发现，ＭＣ６相应抗原在结肠癌组织及结肠癌细胞系呈高度表达（９０～１００％），显著高于其它癌组织、癌旁组织、正常粘膜及癌细胞系（０～４４．４％）；中度以上染色者占阳性总数的８０％以上；主要分布于细胞膜上。除癌细胞膜和胞浆呈阳性反应外，腺腔内粘液亦可见不同程度的着色，表明ＭＣ６相应抗原是一种在结肠癌细胞膜上占优势的抗原，并可脱落至腺腔。此单克隆抗体的成功研制为发现新的结肠癌生化标志，结肠癌的早期诊断及术后病情的监测提供了可能性。     

三氧化二砷诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡的细胞生物学研究

目的：观察三氧化二砷（As2O3)对结肠癌LoVo细胞体外生长的影响,方法：选用不同剂量As2O3处理LoVo细胞后,通过光镜,电镜,MTT法,AO／EB荧光染色法和流式细胞术研究AsO3对LoVo细胞生长的影响,结果：As2O3具有抑制Lo-Vo细胞生长和其凋亡的作用,这种作用主要在低浓度（0．5－2．0μmol/L)产生,而在高浓度（5．0－10．0μmol/L)可引起细胞死亡,结论：As2O3有明显抑制LoVo细胞生长的作用,并诱导细胞凋亡,其作用机制尚不清楚。     

人子宫内膜癌细胞系的建立及其生物学特性研究

目的：建立人子宫内膜癌细胞系，为子宫内膜癌体外实验提供研究材料。 方法： 将人子宫内膜癌手术标本移植于BALB/C（nu/nu）裸鼠皮下，成瘤后对移植瘤原代培养，进行传代。 结果： 建立子宫内膜癌细胞系，取名EAC，成功传代至51代.该细胞系生长快，稳定传代，形态学特征符合腺上皮恶性肿瘤细胞特征。染色体检查为超二倍体。雌孕激素受体检查阴性。P53、MDM2表达阴性。致瘤率100%，移植瘤病理学特征与原细胞系相似。 结论： 成功建立人子宫内膜癌细胞系，为开展人类子宫内膜癌基础和临床研究提供了理想实用的模型。     

耐5-氟尿嘧啶的人结肠癌HT-29/5-FU细胞株的建立及其生物学特性

目的建立耐5-氟尿嘧啶人结肠癌细胞株(HT-29/5-FU)并观察其生物学特性。方法采用5-FU持续接触浓度递增法诱导;观察细胞形态变化和克隆形成率;MTT法测定生长曲线和药物敏感性;Western blot法分析胸苷酸合成酶(TS)、二氢嘧啶脱氢酶(DPD)的表达情况;流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果 HT-29/5-FU的耐药指数为3.59;与HT-29细胞相比,HT-29/5-FU细胞形态发生改变、生长缓慢、克隆形成率降低,TS和DPD高表达;S期细胞比例增多,更能耐受5-FU诱导的细胞凋亡。结论 HT-29/5-FU细胞株生物学性状的改变可能是5-FU化疗耐药机制的重要组成部分,有助于阐明肿瘤潜在耐药机制和逆转肿瘤耐药。     

新的结肠癌相关抗原MC3—Ag的纯化及鉴定

作者利用饱和硫酸铵沉淀和ＤＥＡＥ５２离子层析柱纯化本中心自制结肠癌单克隆抗体ＭＣ３，以此为配基与Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ偶联，经免疫亲和层析从自制可溶性结肠癌抽提液中纯化出一种新的肠癌肿瘤相关抗原ＭＣ３－Ａｇ。其特性分析表明，ＭＣ３－Ａｇ可为高碘酸氧化或强佥水解，而对胰蛋白酶、神经氨酸酶、去糖酯混合液及弱佥处理不敏感，提示其决定族可能位于Ｎ糖苷键型糖蛋白糖链上。ＳＤＳ－ＰＡＣＥ弱及免疫印迹分析表明     

人结肠癌细胞系SP细胞microRNA表达谱的初步分析

 目的：探讨结肠癌侧群（SP）细胞在结肠癌多药耐药性中的作用及其microRNA生物标志。方法：结肠癌SP细胞的分选采用流式细胞术,细胞活力的测定采用MTT法,microRNA表达谱的检测采用microRNA芯片,microRNA表达的验证采用实时荧光定量PCR。结果：（1）HCT-15、HT-29及LoVo结肠癌细胞系中SP细胞的比例分别为16.75%、13.02%及9.52%。（2） 化疗药（5-氟尿嘧啶、草酸铂及阿霉素）对3种结肠癌细胞系SP细胞的 IC50均明显高于对非SP细胞的IC50（P<0.05）。（3）microRNA芯片检测表明miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552在3种结肠癌细胞系的SP细胞中表达均上调,实时荧光定量PCR亦证实此结果。结论：miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552在结肠癌细胞系的SP细胞中表达上调,有可能成为结肠癌SP细胞的潜在microRNA生物标志。     

不同转移特性瘤细胞系的筛选及其生物学特性

目的：探讨与肿瘤转移相关的某些生物学特性。方法：将小鼠乳腺癌Ｃａ７６１－ＦＰ８／Ｌ和Ｃａ７６１－ＦＬ１０／Ｌ经体内筛选得到细胞系Ｃａ７６１－Ｐ５Ｂ和Ｃａ７６１＝Ｌ６Ｂ，并观察其瘤细胞与凝集反应、靶器官组织条件培养基对瘤细胞真挚化作用等，结果：Ｃａ７６１－Ｐ５Ｂ具有高肺转移、低淋巴结转移特性，Ｃａ７６１－Ｌ５Ｂ具有低肺、低淋巴结转移特性。两个瘤细胞系的细胞表面的糖基表达，对条件培养的趋化反应不同。结     

8株人黑色素瘤细胞系的建立及其生物学特性研究

目的：从人黑色素瘤组织建立一系列黑色素瘤细胞系，命名为黑色素瘤细胞系1-8号（HME1-8），并研究鉴定其体外细胞生物学与免疫学特性。方法：取黑色素瘤组织进行组织块培养法，待长满90%汇合面后消化传代培养，并进行形态学、生长动力学、免疫学及致瘤性等生物学特性研究。结果：该系列黑色素瘤细胞系已在体外培养生存1-2年，传60-100余代，其生物学特性显示：①这些细胞系体外生长的倍增时间为34.2-59.5h；②软琼脂集落形成率平均值在8.6%-26.2%之间；③接种至裸鼠后具有较高的致瘤性；④染色体核型分析为非整倍体，众数为64-117条；⑤ 透射电镜下可观察到细胞含丰富的核糖体及黑色素颗粒；⑥免疫组化分析显示细胞浆内含大量阳性棕色黑色素颗粒；⑦肿瘤抗原检测显示8株黑色素瘤细胞系的Melan-A抗原阳性率为75%, MAGE-1阳性率为50%, MAGE-2阳性率为37.5%，MAGE-3阳性率为62.5%。结论：8株黑色素瘤细胞系经体外长期培养后已永生化，形成了连续传代细胞系，具有明显的黑色素瘤细胞恶性表型特征。     

在人结肠癌组织中发现原癌基因Ha—ras点突变

据文献报道,在人类结肠癌组织中约半数可检测到原癌基因ras的点突变,其中以Ki-ras第12位密码子点突变为主,第13、61位密码子也有较高频率点突变发生。N-ras基因的点突变也时有发生。但是,迄今有关人     

亚硒酸钠诱导结直肠癌SW480细胞系凋亡

目的探讨亚硒酸钠诱导结直肠癌SW480细胞凋亡的信号通路。方法将SW480细胞分为三组,分别进行亚硒酸钠、Mn TMPy P以及两者联用处理;用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧;Western blot方法检测细胞信号通路JNK和ATF-2的磷酸化,以及c-Myc、c-Jun、c-Fos、cyclin D1、cyclin A2、Bcl-2等相关蛋白表达;流式细胞术检测SW480细胞凋亡率。结果亚硒酸钠可使SW480细胞产生活性氧;抑制JNK和ATF-2的磷酸化(P0.05),下调c-Myc、c-Jun、c-Fos、cyclin D1、cyclin A2、Bcl-2的表达诱导SW480细胞凋亡(P0.05);用活性氧抑制剂Mn TMPy P可减轻亚硒酸钠所致的上述变化(P0.05)。结论亚硒酸钠可通过产生活性氧,抑制JNK和ATF-2的磷酸化,下调c-Myc、c-Jun、c-Fos、cyclin D1、cyclin A2、Bcl-2的表达,促进SW480细胞的凋亡。     

HAS-2沉默抑制大肠癌细胞上皮间质转化

目的本研究主要探讨HAS-2沉默前后对大肠癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响。方法分别用Realtime PCR及Western blot方法检测HAS-2 siRNA转染前后E-cadherin、Vimentin、Slug、Snail mRNA、蛋白表达水平变化,用免疫荧光法观察HAS-2 siRNA转染前后E-Cadherin、Vimentin表达的变化。结果 E-Cadherin蛋白和mRNA在大肠癌细胞的表达水平在HAS-2 siRNA转染组比阴性对照组明显上调(0.05),而Vimentin蛋白和mRNA,Snail mRNA and Slug蛋白在大肠癌细胞的表达水平在HAS-2 siRNA转染组表达水平比阴性对照组明显下调(0.05)。结论 HAS-2沉默对大肠癌细胞EMT有抑制作用。     

Twist1在结直肠癌多药耐药中的作用机制

目的探讨Twist1在结直肠癌多药耐药中的作用机制。方法建立人结直肠癌耐奥沙利铂细胞株(SW620/OxR),构建带G418抗性的Twist1-shRNA质粒转染SW620/OxR细胞作为实验组,同时,设置转染带G418抗性阴性对照质粒的SW620/OxR细胞作为阴性对照组,并在转染成功后用G418筛选建立稳定转染细胞株。采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测SW620/OxR细胞中Twist1基因和蛋白的表达,采用流式细胞术间接法检测细胞中Twist1、p-STAT3、P-gp、Survivin蛋白变化,Western blot法检测两组细胞Twistl、STAT3、p-STAT3蛋白表达变化。结果 Twist1-shRNA干扰质粒能够明显降低SW620/OxR细胞Twist1 mRNA及蛋白水平。且实验组的E-cadherin表达水平明显降低,vimentin表达水平明显升高。采用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡,阴性对照组细胞凋亡率为5.08%,实验组则明显增高至30.69%。流式细胞术间接法检测实验组中Pgp、Survivin、p-STAT3及Twist1阳性率分别为5.25%、1.93%、2.51%、3.58%,阴性对照组中P-gp、Survivin、p-STAT3及Twist1阳性率分别增加至21.98%、22.36%、19.42%、53.68%,二者差异有统计学意义(P0.01)。实验组Twist1、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量明显低于阴性对照组,差异有统计学意义(P0.01)。结论 Twist1可能是结直肠癌多药耐药机制中的关键因子,其可能通过逆向调控STAT3信号通路发挥作用。     

不同转移潜能鼻咽癌细胞株的差异膜蛋白质组研究

目的:采用定量蛋白质组学技术筛选鼻咽癌转移相关的膜蛋白质。方法:在富集高转移鼻咽癌细胞株5–8F和不转移鼻咽癌细胞株6–10B膜蛋白质的基础上,采用稳定同位素18O标记结合串联质谱技术比较两株细胞膜蛋白质组的差异,采用Western印迹对差异表达膜蛋白质EphA2的表达水平进行验证,采用生物信息学方法对差异蛋白质进行GO(gene oncology)功能聚类和全基因组及代谢途径数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路分析。结果:鉴定了31个5–8F与6–10B细胞的差异膜蛋白,其中25个蛋白质在5–8F中表达上调、6个蛋白质表达下调,Western印迹技术验证了差异膜蛋白质EphA2的表达。生物信息分析显示,差异膜蛋白的功能主要涉及细胞黏附、受体再循环和细胞连接等生物学过程,并参与了14个KEGG通路,其中许多通路涉及细胞黏附、细胞连接以及细胞运动。结论:31个差异膜蛋白质可能在鼻咽癌转移过程中发挥重要作用,为进一步研究鼻咽癌转移的分子机制提供了新线索。     

重组人肿瘤坏死因子与阿霉素抗人结肠癌细胞株（SW480）的序贯作用研究

目的 评价rHuTNF和阿霉素抗人结肠癌细胞株的序贯作用。方法 采用克隆生成试验（Hamburger-Salmon法）,研究rHuTNF和DOX序贯作用于SW480细胞后的抗增殖效果。结果 对结肠癌细胞系SW480,存在DOX至rHuTNF序贯抗增殖作用;除反序贯给药情况外,出现显著的协同作用。结论 在DOX存在情况下,TNF的抗瘤作用增强,从而支持DOX可干扰细胞保护机制以使瘤细胞对TNF细胞毒作用更为敏感的理论。     

Transcriptional profiling identifies genes induced by hepatocyte-derived extracellular matrix in metastatic human colorectal cancer cell lines

The milieu of the liver, and in particular hepatocyte-derived extracellular matrix (hECM), is a critical factor regulating development of liver metastases of colorectal cancer (CRC) cells. The present study has investigated genes altered by hECM in CRC cells and particularly by heparan sulfate chains of hepatocyte proteoglycans. Gene profiling analysis shows that after 2 days on hECM, 226 genes are up-regulated more than 2-fold in strongly metastatic SM cells, including genes involved in growth arrest and apoptosis, signal transduction, cell migration, proliferation, communication and angiogenesis, with activation of the erbB signaling network and p53 effectors. Genes down-regulated by hECM include genes involved in lipogenesis and the S phase of the cell cycle. Further studies exploring the kinetics of gene expression after 4 and 7 days culture on hECM show induction of EGF family members and of stem cell markers. In particular, hECM, but not collagen, increases mRNA expression of HB-EGF and colon stem cell marker leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 (LGR5). Expression of these genes is not induced by hECM depleted of the heparan sulfate chains of proteoglycans. Lastly, a specific cell population positive for cancer stem cell (CSC) markers LGR5, epCAM and CD133, but negative for CD44, appears after 7 days culture on hECM, a population which is reduced by 50 % in cells grown on heparan sulfated-depleted hECM. Collectively, the data suggest that hECM induces growth factors and receptors regulating proliferation of metastatic CRC in the liver and offers a growth advantage for specific populations expressing CSC markers.     

钙释放激活钙通道调节分子1促进结肠癌细胞系SW480的增殖

目的 探讨钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)对结肠癌细胞系SW480增殖的影响及其机制.方法 以ORAI1干扰慢病毒感染SW480细胞,分别用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞中ORAI1mRNA和蛋白的表达,通过MTT法、集落形成实验和倍增时间检测细胞的增殖,流式细胞仪检测其周期,激光共聚焦显微镜检测细胞钙内流(SOCE),Western blot法检测细胞中ERK1/2、p-ERK1/2和CyclinD1蛋白表达.结果 SW480转染ORAI1干扰慢病毒72 h后,可见明显的荧光表达;干扰组较空病毒组和对照组,ORAI1的表达降低(P＜0.01)、细胞生长减慢(P＜0.05)、集落形成能力减弱(P＜0.01)、倍增时间延长(P＜0.01)、G1期细胞比例增高(P＜0.05)、SOCE内流峰值降低(P＜0.05)、p-ERK1/2和CyclinD1的蛋白表达量降低(P＜0.01).结论 ORAI1可能通过SOCE调节胞内Ca2+浓度,并进一步通过MAPK信号通路促进SW480细胞的增殖.     

骨桥蛋白在不同大肠癌细胞株中的转移相关功能研究

目的：探索骨桥蛋白（OPN）在大肠癌转移中的相关功能。 方法:分别构建OPN反义和正义真核表达质粒后，转染入Colo205和SW480大肠癌细胞株。经鉴定后，进一步运用流式细胞仪、免疫组化、同质和异质黏附等技术检测转染细胞的转移相关功能变化。结果:OPN高表达的大肠癌细胞，CD44表达量增强，E-cadherin的表达减弱；细胞之间同质黏附减弱，细胞侵袭运动能力增强，细胞与ECV304细胞之间的异质黏附作用增强。均证明了OPN与侵袭转移的密切相关性。结论:提示OPN影响大肠癌细胞同质黏附和异质黏附能力的作用可能是大肠癌肝转移发生发展的相关机制之一。     

CD44 regulates cell migration in human colon cancer cells via Lyn kinase and AKT phosphorylation

Colon cancer is among the leading causes of cancer death in North America. CD44, an adhesion and antiapoptotic molecule is overexpressed in colon cancer. Cofilin is involved in the directional motility of cells. In the present study, we looked at how CD44 might modulate cell migration in human colon cancer via cofilin. We used a human colon cancer cell line, HT29, which expresses CD44, HT29 where CD44 expression was knocked down by siRNA, SW620, a human colon cancer cell line which does not express CD44, stably transfected exons of CD44 in SW620 cells and the colon from CD44 knockout and wild-type mouse. Western blot analysis of siRNA CD44 lysates showed increased level of AKT phosphorylation and decreased level of cofilin expression. Similar results were also observed with SW620 cells and CD44 knockout mouse colon lysates. Experiments using the AKT phosphorylation inhibitor LY294002 indicate that AKT phosphorylation downregulates cofilin. Immunoprecipitation studies showed CD44 complex formation with Lyn, providing an essential link between CD44 and AKT phosphorylation. LY294002 also stabilized Lyn from phosphorylated AKT, suggesting an interaction between Lyn and AKT phosphorylation. Immunocytochemistry showed that cofilin and Lyn expression were downregulated in siRNA CD44 cells and CD44 knockout mouse colon. siRNA CD44 cells had significantly less migration compared to HT29 vector. Given the well-defined roles of CD44, phosphorylated AKT in apoptosis and cancer, these results indicate that CD44-induced cell migration is dependent on its complex formation with Lyn and its consequent regulation of AKT phosphorylation and cofilin expression.     

Cytoskeletal stiffness, friction, and fluidity of cancer cell lines with different metastatic potential

We quantified mechanical properties of cancer cells differing in metastatic potential. These cells included normal and H-ras-transformed NIH3T3 fibroblast cells, normal and oncoprotein-overexpressing MCF10A breast cancer cells, and weakly and strongly metastatic cancer cell line pairs originating from human cancers of the skin (A375P and A375SM cells), kidney (SN12C and SN12PM6 cells), prostate (PC3M and PC3MLN4 cells), and bladder (253J and 253JB5 cells). Using magnetic twisting cytometry, cytoskeletal stiffness (g′) and internal friction (g″) were measured over a wide frequency range. The dependencies of g′ and g″ upon frequency were used to determine the power law exponent x which is a direct measure of cytoskeletal fluidity and quantifies where the cytoskeleton resides along the spectrum of solid-like (x = 1) to fluid-like (x = 2) states. Cytoskeletal fluidity x increased following transformation by H-ras oncogene expression in NIH3T3 cells, overexpression of ErbB2 and 14-3-3-ζ in MCF10A cells, and implantation and growth of PC3M and 253J cells in the prostate and bladder, respectively. Each of these perturbations that had previously been shown to enhance cancer cell motility and invasion are shown here to shift the cytoskeleton towards a more fluid-like state. In contrast, strongly metastatic A375SM and SN12PM6 cells that disseminate by lodging in the microcirculation of peripheral organs had smaller x than did their weakly metastatic cell line pairs A375P and SN12C, respectively. Thus, enhanced hematological dissemination was associated with decreased x and a shift towards a more solid-like cytoskeleton. Taken together, these results are consistent with the notion that adaptations known to enhance metastatic ability in cancer cell lines define a spectrum of fluid-like versus solid-like states, and the position of the cancer cell within this spectrum may be a determinant of cancer progression.