利用抑制性消减杂交技术构建太空诱变宫颈癌细胞cDNA消减文库

目的利用抑制性消减杂交技术构建太空诱变宫颈癌细胞的消减文库,为进一步从基因表达水平研究空间特殊环境影响肿瘤细胞生物学行为改变的分子机制奠定基础。方法采用SuperSMART和SSH技术,以太空诱变的宫颈癌48A9细胞株作为Tester,地面正常对照组宫颈癌细胞株作为Driver,分离太空诱变的宫颈癌48A9细胞中差异表达的基因片段;连接T载体,转化宿主菌,构建太空诱变的宫颈癌48A9细胞cDNA抑制性消减文库。结果经蓝白筛选后随机挑取300个阳性克隆,以接头1和2R内侧序列为引物进行菌液PCR扩增鉴定阳性克隆,结果显示其中288个克隆有插入片段,阳性率为96％,大小分布在0．2—1．0kb间。结论本实验利用抑制性消减杂交技术成功的构建了高质量的太空诱变宫颈癌细胞消减文库,为进一步从基因水平阐明太空特殊环境对肿瘤细胞生物学行为改变的分子机制奠定了基础。     

黄胸鼠微卫星分子标记的筛选

目的研究黄胸鼠不同地理区域种群的遗传差异,用磁珠富集法筛选其微卫星位点。方法将黄胸鼠基因组DNA用限制性内切酶消化后的小片段与接头连接,再用生物素标记的(AC)15重复序列探针与酶切片段杂交,应用链霉素亲和磁珠捕获300～600bp含有微卫星序列的DNA片段,通过载体转化到JM109感受态细胞中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库,测序后设计引物并筛选。结果本次实验从约900个转化子中获得304个阳性克隆,对其中140个进行测序,并成功设计黄胸鼠微卫星引物13对。结论筛选出的13对微卫星引物多态性高,能稳定扩增出目标条带,可用于种群遗传研究。     

正常细胞与镉转化细胞抑制消减cDNA文库构建

目的 构建正常人支气管上皮细胞(16HBE)与氯化镉诱导转化16HBE细胞间差异表达基因的消减cDNA文库。方法 以16HBE为驱动子,氯化镉诱导转化16HBE细胞为检测子,应用抑制性消减杂交(SSH)方法构建cDNA文库,经2次消减杂交和2次PCR后,将巢式PCR产物插入载体,随机挑选克隆进行鉴定。结果 得到纯度高及完整性好的总RNA和mRNA,并扩增出良好的双链cDNA,cDNA与接头的连接效率＞25%,最终使差异表达基因得到富集;经蓝白菌落筛选,获得1 200余个白色阳性克隆;随机挑选50个白色克隆进行PCR扩增,显示96%克隆均有100~600 bp的插入片段,这些片段可能是差异表达基因cDNA片段,提示用SSH法及T/A克隆技术有效构建了两细胞株间差异表达基因的消减cDNA文库。结论 成功创建正常16HBE细胞与镉转化16HBE细胞差异表达基因消减cDNA文库。     

马红球菌酵母双杂交基因组文库的构建

目的构建马红球菌酵母双杂交基因组文库,为研究马红球菌的致病机理创造条件。方法将马红球菌的基因组DNA部分酶切,克隆到酵母双杂交系统的AD载体中,再检测文库的独立克隆数和插入序列的大小以确定文库的质量。结果获得1×106独立克隆数的基因组文库,插入片段的平均大小为2.3 kb。结论酵母双杂交基因组文库的构建,为进一步研究马红球菌的致病机制打下基础。     

乙肝病毒共价闭合环状DNA标准品制备及鉴定

目的通过构建乙肝病毒(HBV)重组质粒来制备共价闭合环状DNA(cccDNA),为cccDNA定量检测提供合适的标准品。方法选择本院就诊的2名慢性乙肝患者,采取蛋白酶K消化法提取其血清病毒DNA,运用高保真聚合酶扩增HBV DNA,然后将扩增片段插入克隆载体构建HBV重组质粒。以重组质粒为模板制备环状DNA,经测序鉴定和PCR定量检测。结果 HBV DNA全长序列被成功扩增,并顺利构建重组质粒。2个重组质粒经内切酶消化均能得到预期的HBV DNA片段(约3.2 kb)和载体DNA片段(约2.7 kb);经测序鉴定,2个质粒分别为HBV B和C基因型,其插入序列保真性好,错配率低,每kb分别为1.24 bp和1.56 bp;以重组质粒为模板制备的2个环状DNA长度均约为2.1 kb,测序证实为HBV cccDNA;经定量检测,其纯度高,浓度分别为1.05×10~(10)IU/ml和6.19×10~9IU/ml。结论利用重组质粒方式制备的HBV cccDNA具有纯度高、获取量大等优点,可作为cccDNA定量检测和方法性能验证的标准品。     

艾滋病患者马尔尼菲青霉菌优势株酵母相全长cDNA文库的构建和初步分析

目的 构建广东地区艾滋病患者马尔尼菲青霉菌(PM)优势株酵母相全长cDNA文库,筛选UniGene和全长基因,为PM的功能基因组学研究和致病机制的探讨奠定基础.方法 应用CloneMiner cDNA construction kit提取广东地区艾滋病患者PM优势株酵母相mRNA,反转录成cDNA后通过BP重组方法克隆进pDONR222载体制备成Uncut型cDNA文库,然后利用基因组DNA饱和杂交原理,对Uncut型cDNA文库进行均一化处理,构建均一化cDNA文库.针对均一化文库,随机挑取2000个克隆子进行双向测序,并进行生物信息学分析,筛选UniGene和全长基因.结果 Uncut型cDNA文库总克隆数为1.16×107 cfu/mL,重组率95%,平均插入片段长度＞1 kb;均一化文库总克隆数为1.18×106 cfu/mL,重组率95%,平均插入片段长度＞1 kb.测序获得1945条基因片段长度＞1 kb的序列,归并获得1360个UniGene,632个全长基因.结论 所构建的艾滋病患者PM优势株全长cDNA文库质量较好,采用的技术路线获取全长基因建立基因表达谱的效率较高,可以很好满足下一步实验需要.     

志贺菌诱导耐多药相关基因抑制性消减杂交法筛选

目的应用抑制性消减杂交技术研究志贺菌诱导耐多药株与其敏感株之间差异基因,筛选耐多药相关基因,探讨基因表达差异与志贺菌诱导耐多药的相关性。方法以志贺菌诱导耐多药株DNA为检测子(tester),以其敏感株DNA为驱赶子(driver),构建DNA消减文库,采用PCR鉴定及斑点杂交进行筛选,并随机挑取阳性克隆测序,所得结果在GenBank中做同源性比较分析。结果成功构建了志贺菌诱导耐多药株的特异性DNA消减杂交文库;选取部分阳性克隆进行杂交筛选,获得12个诱导耐多药差异片段,对其中6个基因片段经克隆测序并与GenBank数据库进行初步比对,3个未知基因可能为新基因,3个已知基因分别为16S rRNA 核糖体基因、预测的rep蛋白质(解螺旋酶)、位点特异性Ⅰ型脱氧核糖核酸酶(Hsds)等相关基因。结论志贺菌耐多药是多基因参与的复杂过程,筛选的新基因片段为进一步克隆其全长基因进而研究其功能打下基础。     

日本血吸虫成虫cDNA表达文库的构建及鉴定

目的　通过构建日本血吸虫成虫 c DNA表达文库 ,免疫筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。　方法　采用 TRIZOL试剂提取日本血吸虫成虫总 RNA,Oligotex m RNA Midi Kit分离 m RNA,并用 Stratagene的建库试剂盒构建日本血吸虫 c DNA表达文库。　结果　构建的日本血吸虫成虫 c DNA表达文库容量为 2× 10 6 pfu/ ml,扩增后文库的滴度为 1.4× 10 7pfu/ ml。文库的重组率达到 96%以上 ,插入片段平均长度为 1.4kb。　结论　本文库可望用于日本血吸虫疫苗候选基因及诊断抗原分子的筛选     

假结核耶氏菌质粒DNA电穿孔转化试验

本文首次报道了假结核耶氏菌的电穿孔转化技术。将编码鼠疫菌素的9.5kb的质粒克隆入pBR328的PstI位点,构建了质粒pJGX20。使用pJGX20,在电压为1300V、1400V,电容为25μF,电击时间为48~52微秒,使用10%甘油为电穿孔缓冲液,可获得每微克DNA 10⁸的转化子。pJGX20的鼠疫菌素基因,在假结核耶氏菌中得到良好表达。     

脉冲场凝胶电泳对肠球菌的分子检测与同源性分析

目的对40株肠球菌进行分子同源性检测分析,探讨脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrothoresis, PFGE)在分子流行病学方面的价值. 方法应用PFGE对40株分离自住院患者的肠球菌进行同源性分析. 结果 40株肠球菌经脉冲场凝胶电泳在30～500 kb之间显示12～18条大小不同的DNA片段;40株肠球菌表现出大小不一的同源性:3对肠球菌100%同源,来自同一病房的4对肠球菌分别为78.27%、72.73%、72.73%、80.01%同源;来自不同病房两对肠球菌分别为80.01%、77.78%同源,其余菌株则显示了较低的同源性或者无同源性. 结论 40株肠球菌未见同一克隆的暴发流行;PFGE是细菌分子流行病学分析的理想方法.     

金葡菌野生株肠毒素B基因克隆及分子特征

目的克隆金黄色葡萄球菌野生株S407030肠毒素B（SEB）基因，并分析其分子特征。方法根据Genebank中金黄色葡萄球菌S6株肠毒素B基因设计1对引物，采用PCR法从金黄色葡萄球菌野生株S407030基因组中扩增目的基因，将目的片段与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB，并转化E．coli DH5 α；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法作序列测定分析，并以ExPasy Proteoic Tools蛋白分析软件预测其编码SEB蛋白的二级结构。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约705bp的基因片段，所构建的阳性克隆重组子PCR及双酶切鉴定与预期结果一致；测序结果表明，克隆的SEB基因含705个碱基，与S6株序列相比无碱基的插入或缺失，同源性为98．4％；存在11个碱基变异，其中7个为无义突变，4个为有义突变（突变位点位于第364，699．899．988位，编码氨基酸变化分别为：Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser、Met→Leu）；所预测的2菌株SEB蛋白的二级结掏基本相同。结论本实验成功克隆了金葡菌野生株S407030SEB基因，其在不同菌株间相对保守；由SEB基因点突变引起的个别氨基酸的改变对SEB生物活性与毒力的影响有待进一步研究。     

南通地区食源性沙门菌多重耐药性与整合子的相关性研究

目的通过对南通地区食源性沙门菌整合子的检测及耐药性分析,初步探讨整合子、基因盒与耐药性的相关性。方法采用纸片扩散法(kirby-bauer)对67株食源性沙门菌进行耐药性分析,从中选取多重耐药性菌株,提取纯化不同菌株共有的质粒,应用PCR法扩增整合子并进行分类;随机选取1例PCR产物进行DNA测序。结果 67株南通地区食源性沙门菌中31.3%具有多重耐药性;Ⅰ类整合子阳性14株,未发现Ⅱ类、Ⅲ类整合子;10株沙门菌携带质粒,质粒数目为1个~3个,大小为0.5 kb~4 kb;Gen Bank数据库BLAST软件分析1例PCR产物(1.5 kb片段)含有3个开放阅读框,分别与dfr A1、sat2和aad A1耐药基因盒对应。结论南通地区食源性沙门菌对氨苄西林、环丙沙星和哌拉西林等药物出现较高的耐药性;耐药基因可由Ⅰ类整合子携带,并可通过接合试验发生转移,这对细菌多重耐药性的产生和传播转移起到非常重要的作用。     

视网膜母细胞瘤的基因分析

视网膜母细胞瘤是一种遗传性恶性肿瘤,应用 Rb 易感基因的 cDNA片段进行产前诊断是防止该病发生的有效途径。本文应用分子杂交技术,以两个克隆的 Rb cDNA 为探针,检测了两个 Rb 病人及其父母的 DNA,发现其中一个病人的 Rb 基因含有1kb 的缺失,为进一步开展 Rb 的产前诊断打下基础。     

镍转化人胚肺细胞中差异表达基因的克隆

目的 分析并克降镍转化细胞与对照组细胞中差异表达的基因,以期了解镍化合物诱发癌６变的分子机制。方法 应用差异显示ＰＣＲ方法分离对照和转化细胞间具有关 表达的基因,用ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ方法将差异基因片段克隆到质粒中,循环测序,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析。结果 从转化与对照细胞中分离并克隆到多个差异基因片段,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析表明其中２个为确定的差异表达基因（暂称之为ＭＳ５１５一ＩＣ８２）。测序后与     

构建用于相关基因筛选的微囊藻产毒株基因组文库

目的：构建含有微囊藻毒素（MC）表达相关基因的基因组文库,用于分离MC相关基因或鉴别MC表达藻株,方法：使用MC产毒株NIES－90,获取基因组DNA,酶切制备片段,克隆到质粒pUC18中,转化JM109构成基因组文库,结果：建成容量覆盖蓝绿藻基因组10倍以上,插入片段介于200－700bp的NIES－90基因组文库,其中获得至少一段序列具有NIES－90特异性,可能为MC相关基因,结论：构建文库成功,可用于后续MC特异性基因研究。     

重组人促红细胞生成素四环素调控真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定含有四环素调控的pTRE顺式作用元件的质粒型载体pTRE2hyg-rhEPO。方法设计含BamHⅠ和ClaⅠ酶切位点的hEPO基因引物，采用RT-PCR法从含有rhEPO基因的CHO细胞中克隆hEPO基因片段，亚克隆至pTRE2hyg真核表达载体。转化感受态大肠杆菌Tbp10，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经RT-PCR能扩增出604bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论成功构建了重组人EPO四环素调控真核表达载体pTRE2hyg-rhEPO。     

猪囊尾蚴cDNA文库的免疫学筛选和新基因的发现

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选免疫学阳性蛋白的编码基因,为临床猪囊尾蚴患者的免疫学诊断提供特异的重组抗原。方法用脑囊尾蚴病人血清免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库,阳性克隆经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的DNA片段,并将其克隆入PMD-18T质粒载体中,测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性分析。结果血清免疫学筛选后,从猪囊尾蚴cDNA文库中挑取了4个阳性斑,PCR后4个片段大小约在200～1800bp,3个大的片段测序结果经分析表明均含有完整开放阅读框,同源序列分析结果显示获得的3个基因片段与GenBank中已知的猪囊尾蚴蛋白基因无同源性。结论本试验中所发现的基因均是猪囊尾蚴新基因,为进一步基因克隆、表达和鉴定等研究奠定了基础。     

固体垃圾和渗沥液中总DNA提取及微生物多样性分析

基于对生活垃圾及其渗沥液提取总DNA方法的评价,采用ARDRA和RISA分析固体垃圾和渗沥液的生物多样性.通过总DNA浓度、纯度、片段分布情况、PCR扩增等指标评价,找出效果较好的提取方法,该法从固体垃圾和渗沥液中均获得了高质量的总DNA,DNA分子片段在23 kb左右,且样品不需经过纯化可以直接进行PCR扩增;ARDRA和RISA分析显示固体垃圾比渗沥液具有更丰富的微生物多样性.     

猬迭宫绦虫幼虫含重复序列的cDNA的分子克隆

目的 从分子水平研究猬迭宫绦虫幼虫－裂虫蚴的某些蛋白抗原的基因结构。方法 用鼠抗裂头蚴多克隆抗体筛选裂头蚴cDNA库，筛选出的阳性克隆，经亚克隆，测序后，分析其一级结构特点。以克隆出的cDNA作探针进行Northern杂交实验，检测mRNA的长度。结果 从cDNA库中筛选出两个克隆（长度分别是366bp和458bp）。两个克隆的5'端都没有起始密码，3'端都没有Poly(A)，但是其中一个克隆的poly（A）信号。两个克隆都有一个由123个核苷酸组成的重复单位，其中只有一个核苷酸不同。重复单位编码的41个氨基酸内有一个糖基位点，中性氨基酸占41．46％。Northern杂交结果显示，裂头蚴从1．5kb到4kb处有多个很强的杂交带，而成虫没有杂交带。结论 裂头蚴体内含有丰富的由重复单位的组成的分子量大小不同的抗原。     

鲍氏不动杆菌中整合子流行调查现状及耐药基因分析

目的探讨医院感染鲍氏不动杆菌中整合子流行现状以及耐药基因情况,以期提高治疗效果。方法对2010年12月-2013年1月的125株鲍氏不动杆菌进行回顾性分析,采用纸片扩散法测定药敏情况,用PCR联合限制性片段长度多态性(RFLP)进行整合子筛查和分类,用PCR法扩增整合子可变区,联合RFLP和DNA测序技术分析整合子携带的耐药基因。结果 125株鲍氏不动杆菌检出整合子73株,检出率为58.4%,而在扩增PCR方面,73例整合子阳性中有69株Ⅰ类整合子可变区扩增为阳性,扩增片段为72个,大小0.15~2.9kb;在耐药基因方面,除了对亚胺培南、美罗培南、头孢西丁敏感性较高外,对青霉素类、氨基糖苷类和β-内酰胺类抗菌药物耐药性高。结论医院感染鲍氏不动杆菌中的整合子主要以Ⅰ类整合子,其与鲍氏不动杆菌的耐药和多药耐药存在关联性,鲍氏不动杆菌整合子主要携带的是氨基糖苷类耐药基因。