半枝莲多糖对肝癌细胞SMMC7721生长抑制及机制的研究

【目的】研究半枝莲多糖(Scutellaria barbata polysaccharides,SBP)对肝癌细胞SMMC7721生长的抑制及相关机制。【方法】将不同浓度SBP作用于SMMC7721肝癌细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测半枝莲多糖对肝癌细胞SMMC7721生长增殖的抑制作用;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2)与转录因子E2F1 mRNA表达;蛋白印迹法(Western blot)检测CDK2与E2F1蛋白表达。【结果】SBP对肝癌细胞SMMC7721具有明显的生长抑制作用,其中10、2.5μg/mL SBP组作用显著,均可使CDK2与E2F1 mRNA和蛋白表达下调。【结论】SBP对肝癌细胞SMMC7721具有增殖抑制作用,其机制可能与CDK2和E2F1表达下降有关。     

E2F4对CDK2和CyclinA在肝癌细胞系中的转录调控特异性研究

目的研究E2F4对细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和细胞周期素A(CyclinA)在肝癌细胞系中的转录调控活性。方法扩增并克隆不同片段长度的CDK2和CyclinA启动子序列,E2F4表达质粒序列,转染肝癌细胞系(HepG2、QGY1007),双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性,实时定量反转录-聚合酶链反应检测肝癌细胞系中CDK2和CyclinA mRNA的表达水平。结果双荧光报告系统、实时定量反转录-聚合酶链反应显示,在肝癌细胞系中转染E2F4表达质粒组CDK2和CyclinA启动子活性明显低于未转染E2F4表达质粒组,CDK2和CyclinA mRNA的表达水平降低。结论E2F4在肝癌细胞系中可以抑制CDK2和CyclinA的转录活性。     

CDK2干扰RNA对人肝癌细胞HepG_2细胞周期和增殖的影响

目的:探讨CDK2 siRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞CDK2 mRNA表达及其对HepG2细胞周期和增殖的影响.方法:利用脂质体转染法将特异性的携带绿色荧光蛋白的CDK2干扰RNA的重组质粒PGenesil-1-CDK2导入HepG2细胞,同时设立阴性对照空载体转染组PGenesil-1-HK.G418筛选稳定表达细胞株扩增培养.并用倒置荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术(FCM),分别检测转染后的HepG2细胞CDK2 mRNA和细胞周期的变化,噻唑蓝(MTT)法检测癌细胞生长增殖率.结果:经1mo的G418筛选得到稳定表达细胞株,与阴性对照组及空白对照组相比,转染组CDK2 mRNA 水平明显下降,细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生阻滞.结论:RNA干扰技术可明显抑制CDK2基因的表达,引起 HepG2细胞周期阻滞及肿瘤细胞生长抑制作用,为CDK2介导的肿瘤基因沉默疗法提供实验依据.     

人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞DNA MTase基因mRNA表达的影响

目的：观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721内源性DNA MTase基因mRNA的表达的影响。方法：将将建的包含正、反义DNA MTase基因片段的真核表达载体用脂质体法将其转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用RT－PCR法观察DNA MTase基因mRNA表达变化。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实证用脂质体法成功将重组载体转染入细胞：RT－PCR法检测DNA MTase基因mRNA表达，显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞中DNA MTase基因mRNA表达下调。结论：人DNA MTase基因反义基因转染是一种有效，可靠的抑制肝癌细胞系SMMC－7721DNA MTase基因表达的方法。它为更多了解DNA MTase在肝癌发生的作用提供了帮助。     

MTA1靶向RNA干扰对人肝癌HepG2细胞生物学行为影响的研究

目的 观察转移相关基因1(MTA1)特异性siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 体外构建2个MTA1特异性siRNA表达载体(pRNAi-1、pRNAi-2),实验分为脂质体对照、空质粒转染对照及MTA1 siRNA重组质粒转染组,转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量RT-PCR检测MTA1 mRNA表达情况,检验其对细胞的RNA干扰效果;采用MTT法分析其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测其对细胞周期的影响.结果 测序表明MTA1干扰序列完全正确;pRNAi-1与pRNAi-2表达质粒有效抑制肝癌细胞株HepG2细胞中MTA1的表达,MTT 法检测结果显示转染重组质粒组细胞体外生长的抑制率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01);流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01).结论 成功构建了MTA1干扰真核表达载体,重组MTA1特异性siRNA质粒可抑制肝癌细胞中MTA1的表达,并抑制肝癌细胞生长,促进其凋亡.     

鼠源性血管抑素cDNA在人肝癌细胞SMMC-7721中的稳定表达及意义

目的 将血管抑素基因转染入人肝癌细胞SMMC－7721中,观察其表达效果衣其对细胞本身的影响,并探讨血管抑素治疗动物种植性肿瘤的效果。方法 将鼠源性血管抑素基因插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建重组质粒,用HindⅢ和XbaⅠ双酶切及基因测序进行鉴定。然后用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-mAST转染入人肝癌细胞SMMC－7721中,并行RT－PCR鉴定和Western-blot检测其表达效果。结果 鼠血管抑素基因成功克隆人真核表达载体pcDNA3.1( )中;经脂质体法转染入SMMC－7721细胞并获稳定表达;转染血管抑素和未转染血管抑素的SMMC－7721细胞生长速度无明显差异。结论 鼠血管抑素基因在人肝癌细胞SMMC－7721中可获稳定表达,但对细胞本身生长无明显抑制作用。     

HPV16E7通过调控 miR-29a-CDK6信号通路 促进肿瘤细胞增殖

摘要:目的 探究人乳头瘤病毒16E7(HPV16E7)通过调控细胞内 miR-29a表达促进细胞增殖的分子机制,从 miRNA 的视角探讨高危型 HPV 的致癌机制。方法 将 HPV16E7基因构建到真核表达载体pcDNA3.1(-),将重组质 粒及空载质粒分别转 染 人 前 列 腺 癌 细 胞 PC3;通 过 半 定 量 RT-PCR 检 测 细 胞 周 期 相 关 基 因 及 miR-29a潜 在 靶 基 因 CDK6、HBP1的表达水平,通过荧光素酶报告实验确定 miR-29a的靶基因;将 miR-29amimic及inhibitor分别瞬时转染 PC3-E7和 PC3-3.1细胞,Westernblot检测 CDK6蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期分布。结果 与对照组相比,克 隆细胞株 PC3-E7中 CDK4、CDK6、CyclinE2、E2F1等细胞周期相关调节因子及 miR-29a的潜在靶基因 HBP1、CDK6等 表达均有不同程度的上调(均P<0.01);而 PC3-E7细胞中 CDK6蛋白表达水平亦明显高于对照组(P<0.01);miR-29a 通过靶向3'-UTR区域调控 CDK6基因转录和蛋白表达,E7高表达后下调了 miR-29a的表达水平,使得 CDK6表达升 高,而加速细胞周期 G1期向S期进展。上调 miR-29a后可以抑制 CDK6的表达,并调控下游细胞周期,部分逆转 E7的 促增殖效应。结论 miR-29a与 CDK6mRNA3'UTR结合并下调其表达,从而抑制细胞的增殖,E7-miR-29a-CDK6信 号通路可能是高危型 HPV 致细胞发生恶性增殖的重要途径。     

siRNA介导的NF-κB P65沉默诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡

目的 研究siRNA介导的NF-κBP65沉默诱导肝癌细胞凋亡相关机制。方法实验以肝癌SMMC772l细胞株为材料,分为空白对照（Con）、脂质体对照（LP）以及siRNA干扰实验（siRNA）3组。以体外转录法合成dsRNA,并用脂质体转染SMMC7721细胞株;Westernblotting检测NF．KBP65表达水平,MTT检测细胞增殖情况,Annexin V-PI法检测细胞凋亡,免疫组化检测Bcl-2和Bax表达。结果与Con和LP组相比,siRNA具有抑制SMMC7721细胞NF-κBP65表达的作用,NF-κBP65表达抑制率分别达到64．74％和34．52％。siRNA明显抑制SMMC．7721细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,晚期凋亡细胞分别是Con组和LP组的8倍和7倍。siRNA引起Bcl-2表达下调,而Bax表达上调。结论siRNA可以有效抑制NF-κBP65蛋白表达,并通过调节Bcl-2和Bax诱导SMMC7721细胞的凋亡。     

胰岛素样生长因子结合蛋白7表达质粒的构建及其瞬时转染对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响

目的 采用TA克隆的方法构建IGFBP7表达载体,考察IGFBP7过表达对SMMC7721细胞生存活力的影响.方法 RT-PCR法调取IGFBP7表达基因,构建pMD19-T Simple-IGFP7载体,测序鉴定后与pIRES2-ZsGreen1质粒进行拼接构建表达质粒;随后表达质粒转染SMMC7721细胞,RTFQ-PCR测定SMMC7721细胞中IGFBP7 mRNA水平,MTT检测IGFBP7表达质粒转染对SMMC7721细胞增殖的影响.结果 IGFBP7 cDNA设计长度为840 bp,电泳结果可在750～1 000bp观察到清晰单一条带,表明成功调取IGFBP7基因;pMD19-TS-IGFBP7载体和pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7表达质粒测序结果正确,表明表达质粒构建成功;RTFQ-PCR结果显示IGFBP7转染组细胞IGFBP7 mRNA水平显著升高;MTT结果显示IGFBP7转染组细胞增殖明显下降.结论 成功用TA克隆的方法构建了IGFBP7表达载体,IGFBP7的过表达能显著抑制SMMC7721细胞增殖.     

SPARCL1基因对肝癌SMMC-7721细胞增殖与凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨富含半胱氨酸酸性分泌型糖蛋白类似物1(secreted protein acidic and rich in cysteines like 1,SPARCL1)基因对肝癌SMMC 7721细胞增殖与凋亡的影响。方法: 将肝癌SMMC 7721细胞随机分为5组,即空白对照组,pIRES2 ZsGreen组,pIRES2 ZsGreen SPARCL1组,阴性 siRNA组和SPARCL1 siRNA组,空白对照组不转染,其余4组分别转染pIRES2 ZsGreen空质粒、pIRES2 ZsGreen SPARCL1、阴性 siRNA及SPARCL1 siRNA;蛋白质印迹法检测SPARCL1蛋白表达,同时联合荧光显微镜检测转染效果;MTT法检测各组细胞增殖能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。 结果： 蛋白质印迹和荧光镜结果同时证实转染效果良好。MTT结果显示5组细胞抑制率差异有统计学意义(F=55.45,P＜0.01),pIRES2 ZsGreen SPARCL1组增殖抑制率明显高于其余4组(P＜0.05);SPARCL1 siRNA组细胞增殖抑制率低于其余4组(P＜0.05)。流式细胞结果显示pIRES2 ZsGreen SPARCL1组凋亡率明显高于其余4组 (P<0.05);SPARCL1 siRNA组凋亡率明显低于其余4组(P＜0.05)。结论： 过表达SPARCL1抑制肝癌细胞SMMC 7721生长和促进凋亡,沉默SPARCL1则反之。     

甲状腺乳头状癌C—erbB—2,P53和PCNA的表达及其临床意义

目的：探讨甲状腺乳头状癌组织学分型、淋巴结转移与C-erbB-2蛋白、P53蛋白、PCNA表达的关系,为临床判断其恶性程度和预后提供参考。方法：参照1988年WHO分类方法,对40例甲状腺乳头状癌（其中包括已发生颈淋巴结转移各20例）进行组织学分型和C-erbB-2蛋白、P53蛋白及PCNA免疫组化染色。结果：已发生颈淋巴结转移组C-erbB-2蛋白、P53蛋白和PCNA表达的阳性率均高于未发生颈淋巴结转移组,且差异有显著性（P＜0．01）,组织学分型中微小型C-erbB-2蛋白、P53蛋白及PCNA表达阳性率均低于包膜型、滤泡型,且统计学差异有显著性（P＜0．01）,而包膜型与滤泡型之间差异无显著性（P＞0．05）。结论：将组织学分型与C-erbB-2蛋白、P53蛋白及PCNA免疫组化相结合是判断甲状腺头状癌恶性程度及预后可靠指标。     

大鼠提睾肌神经损伤后Bcl-2、Bax和P53在血管平滑肌细胞和内皮细胞的表达

目的 研究大鼠提睾肌神经损伤后血管平滑肌细胞和内皮细胞的Bcl-2、Bax及P53表达和意义。方法 以免疫组织化学SP法,对大鼠提睾肌神经损伤后的血管平滑肌细胞和内皮细胞的Bcl-2、Bax及P53表达进行研究。结果 支配提睾肌的神经损伤后,Bcl-2、Bax和P53均有表达。在平滑肌细胞中,Bcl-2的表达明显强于Bax和P53,而在内皮细胞Bax和P53的表达强于Bel-2。结论 大鼠提睾肌损伤后平滑肌细胞有增殖现象,而内皮细胞则可能出现过度凋亡,上述改变可能对微循环产生不利影响。     

环氧合酶-2在子宫内膜异位症子宫内膜组织中的表达

目的：研究环氧合酶-2（COX-2）在子宫内膜异位症（内异症）在位子宫内膜组织和异位子宫内膜组织中的表达及意义。方法：采用免疫组织化学方法检测30例卵巢内异症在位内膜、10例卵巢巧克力囊肿壁异位内膜及27例正常子宫内膜中COX-2的分布和表达。结果：COX-2在3组子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞中均可见表达。COX-2在正常对照组内膜和卵巢内异症组在位内膜腺上皮细胞中的表达均是分泌期高于增生期（P<0.05)，而在间质细胞中的表达分泌期与增生期比较无统计学差异（P>0.05)。COX-2在卵巢内异症组在位和异位内膜中的表达均高于对照组（P<0.05），而内异症患者在位和异位内膜中COX-2的表达则无统计学意义（P>0.05）。结论：COX-2在卵巢内异症在位和异位内膜中表达增高，可能与卵巢内异症的病理异常有关。     

人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白表达载体的构建及其表达

目的 构建并表达了人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP（scHLAA-A2）融合蛋白表达载体．为进一步制备HLA-A2四聚体及其功能研究奠定了基础。方法 应用重叠延伸PCR（overlap-PCR）对编码HI，A-A2的cDNA序列进行一个碱基的同义突变．并将β2m和HLA-A2胞外段亚单位两段编码序列的cDNA通过一疏水性多肽接头（Gly．Ser）。的DNA序列进行前后拼接．并利用引物所带的BSP编码序列．构建单链β2m-HLA-A2-BSP融合基因．将测序正确的β2m-HLA-A2-BSP融合基因插入原核表达载体pET-22b中．转化BL21（DE3）细菌．SDS-PAGE检测其表达．融合蛋白于体外抗原肽存在条件下稀释复性后由Western blot鉴定其空间构象。结果 经DNA序列分析表明：同义突变与预期结果一致．β2m和HLA-A2-BSP、linker的连接顺序、方向及序列完全正确．表达载体转化BL21（DE3）细菌后可表达β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白．SDS-PAGE显示该融合蛋白分子量为45kD．与理论值一致．将融合蛋白与特异性抗原肽在体外进行稀释复性后经Western blot鉴定表明该复合物能与HLA-1类分子特异性结合的单克隆抗体W6／32结合。结论 人可溶性单链β2m-HLA-A2-BSP融合蛋白的构建及其表达获得成功．经体外复性可获得HLA-1类分子天然构象。     

宫颈癌中JAK2／STAT3信号通道介导bax、bcl-2的表达

目的探讨JAK2/STAT3信号通道的激活及其介导bax/bcl-2在宫颈癌中的表达作用。方法选取本院2011-2014年宫颈癌患者40例,CINⅠ级组28例,CINⅡ/Ⅲ级组12例;选择正常宫颈15例为对照组。病理切片采用免疫组织化学方法测定P-JAK2、P-STAT3、bax、bcl-2的表达。结果1）对照组未见P-JAK2、PSTAT3蛋白表达;与对照组比较,CINⅠ级组及CINⅡ/Ⅲ级组表达增多（P〈0.05）;与CINⅠ级组比较,CINⅡ/Ⅲ级组表达增多（P〈0.05）。2）对照组可见少量bax、bcl-2蛋白表达;与对照组比较,CINⅠ级组及CINⅡ/Ⅲ级组表达增多（P〈0.05）;与CINⅠ级组比较,CINⅡ/Ⅲ级组的bax/bcl-2比率降低（P〈0.05）。3）CINⅠ级组和CINⅡ/Ⅲ级组通道蛋白P-JAK2、P-STAT3与bax/bcl-2比率呈正相关（P〈0.05）。结论宫颈癌患者JAK2/STAT3信号通道激活,可能与上调bax/bcl-2的表达和调节细胞凋亡有关。     

MMP-2、TIMP-2在内毒素诱导性葡萄膜炎中的表达

目的　探讨基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )及其组织型抑制剂 (TIMP 2 )在内毒素诱导性葡萄膜炎 (EIU)模型中的表达及意义。方法　 2 0 0 μg伤寒杆菌内毒素注射于SD大鼠双后足垫 ,建立EIU模型。用免疫组织化学方法检测MMP 2、TIMP 2在内毒素注射后不同时间点 (0、 6、 12、 18、 2 4、 4 8、 72、 96h和 7d)的表达。结果　内毒素注射后 6h开始出现炎症 ,于 2 4h炎症达到高峰 ,以后逐渐减轻 ,7d时基本消退。虹膜、睫状体的上皮细胞和渗出的炎性细胞表达MMP 2和TIMP 2。MMP 2在 6h表达开始增高 ,18～ 2 4h达高峰 ,以后逐渐下降。TIMP 2于 12h出现表达 ,4 8h达高峰 ,以后逐渐下降。TIMP 2和MMP 2平均吸光度值的比值与炎症程度呈负相关。结论　MMP 2是与炎症反应相关的调节因子 ,其过量表达参与葡萄膜炎的发病。减低MMP 2的活性或降低MMP 2 /TIMP 2的比值可能为治疗葡萄膜炎的新思路。     

Ang-2及Tie-2在宫颈癌组织中的表达及临床意义

目的探讨血管生成素-2（Ang-2）及其受体内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体（Tie-2）在宫颈癌组织中发生、发展和临床病理学特征的关系。方法采用免疫组织化学、RT-PCR及Westernblot分别检测Ang-2及Tie-2在60例正常宫颈及宫颈癌组织中的组织定位、基因差异表达及蛋白差异表达;采用Spearman法分析Ang-2及Tie-2的表达相关性。结果宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2的阳性表达率明显高于正常宫颈组织,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Ang-2及Tie-2在淋巴结发生转移或临床分期Ⅲ~Ⅳ级的患者中的表达明显高于未发生淋巴结转移或临床分期Ⅰ~Ⅱ级的患者（均P＜0.05）。宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2mRNA及蛋白表达水平均明显高于正常宫颈组织,差异均有统计学意义（均P＜0.01）。Tie-2与Ang-2在宫颈癌组织中的表达呈正相关(r=0.8479,P＜0.01)。结论Ang-2及Tie-2的表达水平与宫颈癌临床分期和有无淋巴结转移密切相关,且Ang-2、Tie-2mRNA及蛋白在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织,Ang-2及Tie-2可能在宫颈癌发生、发展过程中发挥重要作用。     

食管癌组织中Mad2蛋白的表达

目的 探讨食管癌组织中有丝分裂检验点调控蛋白Mad2的表达。方法 采用免疫组化SP法检测92例食管癌组织和83例正常食管黏膜中Mad2蛋白的表达。结果 Mad2蛋白在食管癌组织中的表达阳性率为71.74%（66/92）,与食管正常黏膜中的表达阳性率85.54%（71/83）相比,差异有显著性（P〈0.05）。与肿瘤组织分化程度呈负相关（P〈0.005）。与有无淋巴结转移无相关性（P〉0.05）。结论 Mad2蛋白在食管癌的发生发展过程中起到了重要作用,其检测有助于食管癌恶性程度的评价。     

环氧化酶2在肾癌中表达的意义

目的:研究肾癌组织中环氧化酶2(COX-2)蛋白的表达,探讨COX-2表达与肾癌可能的相关性.方法:应用免疫组织化学S-P法,对46例肾癌及其25例癌旁组织COX-2蛋白表达进行检测.结果:COX-2在46例肾癌组织中的表达阳性百分比为71.74%,癌旁组织中为32.00%.肾癌组织中COX-2表达与癌旁组织相比差异具有统计学意义(P＜0.01);结论:COX-2在肾癌组织中表达明显增高,与肾癌的发生、发展可能相关,有可能作为肾癌诊断的辅助指标之一.     

环氧化酶2在肺癌组织中的表达

目的 研究环氧化酶2（cyclooxygenase-2. Cox-2）在肺癌的表达。方法 应用免疫组织化学方法和Westcrn blot方法检测58例肺癌组织标本中Cox-2的表达情况。结果Cox-2在肺癌组织中阳性表达率为48%（28/58）。显著表达率为41%（24/58）；其在肺腺癌组织中的显著表达率为72%（18/25）。在肺鳞癌组织中的显著表达率为25%（5/20）。结论 Cox-2在肺癌组织中表达显著增高，其显著表达可能与肺癌的发生，发展有关。