晚期氧化蛋白产物调节人肾小管上皮细胞自噬的研究

目的 探讨晚期氧化蛋白产物(AOPPs)对人肾小管上皮细胞(HK-2)自噬的影响.方法 AOPPs刺激HK-2细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和p62的表达;Western blot检测p38 MAPK通路的激活;加入p38 MAPK抑制剂(SB203580)与AOPPs共处理,观察自噬的改变,加入自噬诱导剂雷帕霉素与AOPPs共处理,并用RT-qPCR和Western blot检测细胞周期抑制蛋白p27的表达,用BCA法检测细胞总蛋白,观察细胞肥大的改变.结果 AOPPs下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1,上调p62的表达,并激活p38 MAPK通路;与AOPPs单独处理组相比,SB203580与AOPPs共处理组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin升高而p62降低;雷帕霉素与AOPPs共处理组p27的表达和细胞总蛋白下调.结论 AOPPs通过激活p38 MAPK通路抑制HK-2细胞自噬,自噬抑制参与HK-2细胞肥大.     

自噬-溶酶体系统在慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌萎缩中的作用机制

目的探讨自噬-溶酶体系统在慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)大鼠骨骼肌萎缩中的作用机制。方法采用单纯熏香烟法复制慢阻肺大鼠动物模型。采用Real time PCR,Western blot技术检测大鼠趾长伸肌中FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的mRNA及蛋白表达,探讨自噬-溶酶体系统在慢阻肺大鼠骨骼肌萎缩中的作用机制,进一步探索骨骼肌萎缩的机制。用透射电镜观察对照组和实验组大鼠趾长伸肌组织切片及肺组织切片中的变化。结果 Real time PCR分析结果显示,实验组大鼠趾长伸肌组织中FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62、Atg5的mRNA表达实验组显著高于对照组(P均0.05,其中Bnip3两组对照P均0.01)。两组大鼠MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的mRNA表达比较差异无统计学意义(P0.05)。Western blot分析结果显示,实验组大鼠趾长伸肌组织中FOXO转录因子以及自噬相关基因Bnip3、Beclin1、p62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5的蛋白表达慢阻肺组显著高于对照组(P均0.05,其中Bnip3,MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1两组对照P均0.01)。透射电镜下,相比于对照组,实验组大鼠趾长伸肌胞浆内自噬溶酶体增多,肺组织切片中发现肺组织纤维化和炎症细胞增多。结论实验组大鼠趾长伸肌组织内自噬-溶酶体系统被激活,可能是骨骼肌萎缩的机制之一。     

黄芪多糖对慢性疲劳小鼠骨骼肌线粒体功能的影响及作用机制

目的 观察黄芪多糖(APS)对慢性疲劳小鼠骨骼肌线粒体功能的影响及作用机制.方法 采用力竭性游泳方法构建慢性疲劳模型,将40只BALB/c小鼠随机分为空白对照组(SED组)、模型组(EXE组)、黄芪多糖对照组(SED+APS组)、黄芪多糖干预组(EXE+APS组).SED组:给予生理盐水灌胃,予以静坐;EXE组:给予生理盐水灌胃,予以力竭性运动;SED+APS组:给予APS灌胃,予以静坐处理;EXE+APS组:给予APS灌胃,予以力竭性运动.测试小鼠运动耐力,检测血清及骨骼肌内丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酯(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)水平,Western blot法检测PGC-1α、MnSOD、p53、Atg7、LC3、p62水平,qRT-PCR法检测骨骼肌内Mfn-1、Mfn-2、Opa-1、Drp-1、Fis-1蛋白mRNA水平.结果 与EXE组相比,EXE+APS组的运动耐力及前肢握力均明显提高(P<0.05,P<0.01),且小鼠运动耐力与血清LDH、MDA及骨骼肌MDA呈负相关(P<0.05),与血清GPx呈正相关(P<0.05);与EXE组相比,EXE+APS组骨骼肌中的氧化应激相关蛋白MnSOD和p53水平下降(P<0.05),线粒体起源相关蛋白PGC-1α表达升高(P<0.01),自噬相关蛋白Atg7和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平下降(P<0.05,P<0.01)、p62表达水平升高(P<0.05);与EXE组相比,EXE+APS组Mnf-1和Mnf-2 mRNA的表达水平升高(P<0.05),而Drp-1 mRNA的表达水平则下降(P<0.05).结论 黄芪多糖可提高慢性疲劳小鼠的运动耐力,其分子机制与降低组织内氧化应激水平,改善骨骼肌线粒体自噬、起源及线粒体融合-分裂有关.     

慢性缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬及其机制

目的 观察慢性缺氧对小鼠心肌细胞自噬水平的影响,并初步探讨AMPKα2敲除对该过程的作用.方法 采用野生型与AMPKα2-/-雄性C57小鼠均分为野生型常氧组、野生型缺氧组、敲除型常氧组和敲除型缺氧组(n=10).常氧组于空气环境中饲养,缺氧组于10％ O2的低氧舱内饲养.4周后野生型小鼠取静脉血标本,测红细胞及血红蛋白水平;取心脏标本用Western blot检测AMPKα2及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与p62的变化,用免疫荧光染色法检测心肌冰冻切片LC3变化.敲除型小鼠取心脏标本用Western blot检测心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值变化.结果 ①野生型小鼠中,与常氧组比较,缺氧组红细胞与血红蛋白水平显著增加[红细胞:(9.33 ±0.15)×1012/L vs(12.78±0.66)×1012/L,P ＜0.05;血红蛋白:(135 ±3)g/L vs (192 ±4)g/L,P＜0.05];②野生型小鼠中,与常氧组相比,缺氧组心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增加[(0.49 ±0.29) vs(1.70 ±0.24),P＜0.05];p62表达明显降低[(1.32±0.57) vs (0.71 ±0.19),P＜0.05];免疫荧光结果显示,缺氧组心肌组织LC3荧光较常氧组增多;③在常氧条件下,与野生型小鼠比较,AMPKα2-/-小鼠心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,但差异无统计学意义[(0.78 ±0.08) vs (0.73 ±0.34),P＞0.05];在缺氧条件下,与野生型小鼠比较,AMPKα2-/-小鼠心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低[(2.08±0.72) vs (1.01 ±0.21),P＜0.05];④野生型小鼠中,与常氧组比较,缺氧组AMPKα2蛋白表达水平并无显著增加[(1.14±0.13) vs(1.25±0.19),P＞0.05].结论 慢性缺氧可能通过AMPKα2依赖的途径增强心肌细胞自噬,该自噬可能是心肌细胞对慢性缺氧的适应机制.     

Tob1通过诱导自噬抑制肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖促进细胞凋亡的机制研究

目的：探讨Tob1对肾上腺皮质癌细胞自噬的作用及其影响。方法：将体外培养的SW-13细胞分为对照组、空载质粒转染组以及pcDNA3.1-Tob1质粒转染组。实时荧光定量PCR检测各组细胞中Tob1的mRNA表达。Western blot检测Tob1以及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin 1的表达。LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。随后在转染pcDNA3.1-Tob1质粒的SW-13细胞中加入自噬抑制剂3-MA处理,CCK-8检测细胞增殖,Tunel检测细胞凋亡。结果：pcDNA3.1-Tob1质粒转染显著上调SW-13细胞中Tob1的mRNA和蛋白表达,提升LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1水平,降低p62蛋白表达,并显著提升细胞自噬水平(P<0.05)。与对照组相比,pcDNA3.1-Tob1组SW-13细胞增殖降低,细胞凋亡增加;与pcDNA3.1-Tob1组相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA组细胞增殖提升,细胞凋亡降低(P<0.05)。结论：Tob1能够通过激活细胞自噬降低人皮质癌细胞SW-13增殖并促进其凋亡。     

小鼠骨髓间充质干细胞自噬与衰老的关系

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）自噬与衰老的关系。方法 通过体外分离培 养年轻组小鼠（8 周龄）和老年组小鼠（18 个月龄）BM-MSCs,流式细胞术检测细胞表型,TUNEL 染色检 测细胞凋亡,ELISA 试剂盒检测BM-MSCs 分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF 的表达,Western blot 检 测自噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62 及信号通路蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、 mTOR 的表达。结果 与年轻组比较,老年组BM-MSCs 凋亡增加（P <0.05）,分泌功能下降（P <0.05）,自 噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5 表达水平下降（P <0.05）,相反p62 蛋白表达水平升高 （P <0.05）,自噬信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR 表达升高。结论 老年小鼠BM-MSCs 凋亡增加,自噬活性及旁分泌功能下降。     

栀子苷对1型糖尿病小鼠心肌损伤的保护作用和机制研究

目的：探究栀子苷对1型糖尿病小鼠心肌损伤的保护作用及可能的机制。方法：将32只C57BL/6J小鼠随机分为4组：对照组、1型糖尿病模型组（STZ组）、25 mg/kg栀子苷给药组（GE25组）、50 mg/kg栀子苷给药组（GE50组）。测定血糖和体重水平,HE和Masson染色检测心肌纤维化,免疫组化检测LC3B、P62、Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）和Ⅲ 型胶原蛋白（Collagen Ⅲ）的表达。体外培养大鼠心肌细胞H9C2,将细胞分为正常组、高糖组、高糖+栀子苷组、高糖+栀子苷+ AMPK抑制剂化合物C（Compound C）组。Western blot检测自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ、P62、Beclin1、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5′?monophosphate ?activated protein kinase,AMPK）、磷酸化AMPK（p?AMPK）、mTOR和p?mTOR及凋亡相关蛋白的表达。结果：与STZ组相比,栀子苷给药组（GE25组和GE50组）体重明显增加（P < 0.01）,血糖显著降低（P < 0.01）,明显减轻心肌结构异常,减少胶原沉积（P < 0.01）;免疫组化和Western blot结果显示,STZ组LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin1和p?AMPK/AMPK的表达水平降低,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、P62、p?mTOR/mTOR、BAX/BCL2和Cleaved?caspase 3/Caspase 3的表达水平升高,栀子苷给药组与之趋势相反。细胞实验中,栀子苷预处理激活AMPK（p?AMPK/AMPK比值升高）和自噬活性（LC3BⅡ/Ⅰ升高,P62的表达降低）,且该效应被AMPK抑制剂阻断。结论：栀子苷能改善1型糖尿病心肌病的心肌损伤,减轻心肌纤维化,其机制可能与激活AMPK介导的细胞自噬有关。     

二氢杨梅素调控自噬抑制氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究

目的观察二氢杨梅素（DMY）对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响,并探讨自噬在其中的作用。方法DMY（0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L）预处理HUVECs 2 h,用100.0 mg/L ox-LDL 继续培养细胞24 h。以辛伐他汀作为阳性对照组。采用噻唑蓝法检测细胞活力,Hoechst33258染色观察细胞核形态,透射电镜观察自噬体,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）、Beclin-1和p62/SQSTM1的表达,观察自噬抑制剂对DMY作用的影响。结果与对照组比较,ox-LDL组细胞的存活率降低（p <0.05）,细胞核呈集中高强度蓝色荧光,固缩致密浓染或碎块状致密浓染,颜色发白,细胞核较小,形态不规则,自噬体和自噬溶酶体数量增加;Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,而p62的表达下调（p <0.05）。与ox-LDL组比较,0.1、1.0和10.0μmol/L DMY预处理组细胞存活率均升高;细胞核荧光强度降低,核固缩致密浓染和碎块状致密浓染减少,形态较规则;1.0 μmol/L DMY 预处理组的自噬体和自噬溶酶体数量增加;Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,而p62 的表达下调（p <0.05）。自噬抑制剂3-MA 部分抵消DMY 抑制ox-LDL诱导的HUVECs 存活率降低（p <0.05）。结论DMY 能抑制ox-LDL诱导的HUVECs 损伤,其机制与诱导自噬有关。     

lncRNA MEG3调控mTOR介导的自噬在糖尿病心肌病中的作用

目的 探究lncRNA MEG3调控mTOR介导的自噬在糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)中的作用。方法构建C57BL/6 DCM小鼠模型,设置正常组和DCM组,心脏超声和Masson染色检测小鼠左心房功能结构变化。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测lncRNA MEG3在小鼠心肌组织中的表达水平,Western blot法检测p62、LC3-Ⅱ、Beclin1、p-mTOR、mTOR表达量。分离C57BL/6小鼠乳鼠心肌细胞,高糖诱导心肌细胞损伤。转染si-NC、si-MEG3后高糖处理,设置为正常组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-MEG3组,RT-qPCR检测lncRNA MEG3在心肌细胞的表达水平,Western blot法检测p62、LC3-Ⅱ、Beclin1、p-mTOR、mTOR、p-ERK、ERK表达量。CCK-8、LDH、ROS、GSH-Px试剂盒检测心肌细胞损伤。结果 DCM小鼠心功能出现异常。与正常组比较,DCM组小鼠心肌细胞p62表达显著升高,LC3-Ⅱ和Beclin1表达显著降低,p-mTOR表达升高。细胞实验中,高糖诱导的心肌细胞比正常组p62表达显著升高,LC3-Ⅱ和Beclin1表达显著降低,p-mTOR和p-ERK表达升高;细胞活力和GSH-Px活性降低,LDH和ROS活性显著升高。下调lncRNA MEG3后,高糖+si-MEG3组逆转了高糖+si-NC组自噬相关蛋白以及细胞损伤指标的变化。结论 下调lncRNA MEG3抑制了ERK/mTOR信号通路的激活,高糖诱导的心肌细胞自噬得以恢复,且糖尿病心肌损伤被缓解。     

不同剂量茶多酚对小鼠血清SOD、MDA水平影响的研究

目的观察不同剂量茶多酚（TP）对小鼠血清SOD、MDA水平的影响。方法将小鼠按体重随机分为四组,每组30只,雌雄各半。各组小鼠分别给予不同剂量茶多酚的饲养处理：1）对照组：普通饲料;2）实验组Ⅰ：TP5mg/kg.bw;3）实验组Ⅱ：TP15mg/kg.bw;4）实验组Ⅲ：TP25mg/kg.bw。于90天时测定小鼠血清SOD、MDA水平。结果与对照组相比,实验组Ⅰ小鼠血清SOD活性增强（P〈0.05）,MDA含量、SOD/MDA变化不显著（P〉0.05）;实验组ⅡSOD活性增强（P〈0.01）,MDA含量变化不显著（P〉0.05）,SOD/MDA升高（P〈0.05）;实验组ⅢSOD活性增强（P〈0.01）,MDA含量下降（P〈0.05）,SOD/MDA升高（P〈0.01）。结论茶多酚可提高小鼠血液抗氧化能力,以血清SOD活性增强为主要表现。     

丹参酮ⅡA通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬抗内皮细胞氧化应激损伤研究

目的基于PI3K/Akt/mTOR自噬信号通路探讨丹参酮ⅡA对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法体外培养EA.hy926细胞,随机分为正常组、模型组、丹参酮ⅡA组、LY294002组、ox-LDL加丹参酮ⅡA组、oxLDL加丹参酮ⅡA加LY294002组。用比色法检测细胞氧化应激损伤丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力,利用倒置荧光显微镜及Naolive 3D cell explorer实时无标记3D显微成像系统检测自噬发生,同时应用免疫印迹(Western Blotting)检测自噬相关蛋白以及PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达情况。结果与正常组相比,模型组MDA含量增高,SOD活力降低,微管相关蛋白1轻链3(LC3)I/II蛋白含量增多(P0.01);丹参酮ⅡA干预后细胞中MDA含量降低,SOD活力增高,LC3-I/LC3-II蛋白含量增多(P0.01)。与正常组相比,模型组PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平明显减少(P0.05或P0.01);与模型组相比,丹参酮ⅡA干预后细胞中PI3K、p-Akt、pmTOR蛋白表达水平明显减少(P0.05或P0.01);与ox-LDL加丹参酮ⅡA组相比,加入PI3K的抑制剂LY294002后细胞中的LC3-I/LC3-II蛋白含量减少,自噬水平减少(P0.01)。结论丹参酮ⅡA可能通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进自噬,对ox-LDL诱导的EA.Hy926细胞氧化应激损伤起到保护作用,进而防治动脉粥样硬化。     

PKG抑制剂KT-5823对宫颈癌HeLa细胞活力、凋亡、自噬的影响

目的:明确宫颈癌HeLa细胞对环鸟苷酸依赖性蛋白激酶（PKG）抑制剂KT-5823的敏感性,探究KT-5823对HeLa细胞活力、凋亡和自噬的影响及机制。方法:使用不同浓度的KT-5823干预HeLa细胞24h,CCK-8、免疫印迹试验分别测定细胞活力、PKG1表达水平,进而确定后续药物刺激浓度。将HeLa细胞分为两组,即DMSO组（对照组）和KT-5823组（实验组）,流式细胞术检测细胞凋亡,GFP-LC3B荧光斑点实验检测自噬斑点形成数量,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测PKG1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、Beclin1mRNA的表达水平,免疫印迹试验检测PKG1、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、自噬相关通路蛋白蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）蛋白的表达水平。增加自噬抑制剂SBI-0206965组观察自噬在此过程中的作用。结果:与对照组相比,实验组在3～100μmol/L刺激浓度下均可导致HeLa细胞活力降低（t=10.23～14.83,均P＜0.05）,PKG1蛋白表达水平逐渐降低（t=10.01～14.17,均P＜0.05）。最终选取3μmol/L为刺激浓度,用于后续研究。与对照组相比,细胞凋亡增加（t=10.78,P=0.004）,荧光自噬斑点数量增加（t=10.12,P=0.0005）,PKG1mRNA、蛋白的表达水平降低（t=13.56,P=0.0002;t=5.461,P=0.0055）、LC3Ⅱ、Beclin1mRNA（t=8.359,P=0.0011;t=5.782,P=0.0044）、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白（t=6.924,P=0.0023;t=11.84,P=0.0003）的表达水平增加,p-Akt/Akt（t=5.194,P=0.0065）、p-mTOR/mTOR（t=12.78,P=0.0002）、Bcl-2/Bax（t=13.79,P=0.0002）的比值降低,Caspase3表达增加（t=9.341,P=0.0007）。与实验组相比,30、50、70、100μmol/L自噬抑制剂SBI-0206965组可增加细胞凋亡（t=7.616,P=0.0016;t=15.43,P=0.0001;t=11.01,P=0.0004;t=15.39,P=0.0001）。结论:PKG抑制剂KT-5823可有效抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡,同时可抑制Akt-mTOR通路诱导细胞发生自噬,且KT-5823诱导的自噬在此过程中起保护性作用,PKG可成为宫颈癌临床治疗的新靶点。     

黄芪联合丹参酮ⅡA对急性骨骼肌损伤康复的影响及其作用机制研究

目的观察黄芪注射液联合丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对急性骨骼肌损伤康复的影响,探讨其相关机制。方法将172例急性骨骼肌损伤患者随机分为治疗组和对照组,对照组采用局部按摩＋康复训练疗法,治疗组在对照组治疗基础上加用黄芪注射液＋丹参酮ⅡA磺酸钠注射液,静脉滴注,1次／d,疗程14d。于治疗前、治疗第3、7、14天测定血清超氧化物岐化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。结果治疗组优良率显著高于对照组（P〈0．05）;治疗后治疗组各时点SOD活性显著高于对照组（P〈0．01）,MDA水平显著低于对照组（P〈0．01）。结论黄芪注射液联合丹参酮ⅡA磺酸钠注射液具有促进急性骨骼肌损伤康复的作用,提高机体抗氧化水平、清除自由基可能是其发挥作用的机制之一。     

p62基因缺失对人脂肪间充质干细胞成脂的促进作用

目的：探讨p62基因缺失对人脂肪间充质干细胞（hADSCs）自噬活性的影响,阐明脂肪分化的分子机制。方法：应用Ⅰ型胶原酶消化法从人大腿皮下脂肪抽吸液中分离培养hADSCs,使用80 μmol·L^-1油酸（OA）联合地塞米松和胰岛素对hADSCs进行成脂诱导;将hADSCs分为对照组和p62基因缺失组,p62基因缺失组hADSCs转染p62 shRNA慢病毒载体,对照组hADSCs转染hADSCs空载体。采用CCK-8实验绘制2组细胞的生长曲线并观察细胞增殖活性变化;应用尼罗红染色观察脂滴的形成（尼罗红脂滴染色阳性细胞数）,Western blotting法检测成脂标志转录因子C/EBPα和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型/微管相关蛋白1轻链3Ⅰ型（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）蛋白表达,磺酰成二胺（MDC）染色检测2组细胞成脂中的自噬活性（MDC染色阳性细胞数）,采用LC3与Mitotracker Red荧光共定位检测2组细胞的线粒体自噬活性,使用环孢菌素A（CsA）分别抑制2组细胞线粒体自噬活性并进行成脂诱导,光镜下计数含脂滴细胞数。结果：分离培养的细胞呈多角形或梭形,传代后细胞呈漩涡状排列;OA诱导hADSCs成脂后,细胞内有大量脂滴形成。CCK-8实验,在培养6 d后p62基因缺失组细胞增殖活性较对照组明显降低（P<0.01）。2组细胞诱导成脂后,与对照组比较,p62基因缺失组hADSCs中尼罗红脂滴染色阳性细胞数增多,C/EBPα蛋白表达水平升高（P<0.01）,MDC染色阳性细胞数明显升高（P<0.05）,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平升高（P<0.01）,细胞中LC3的点状化和颗粒化增多,与线粒体的共定位现象增加。使用CsA抑制线粒体自噬后,光镜下观察,p62基因缺失组含脂滴细胞数降低到与对照组接近的水平。结论：p62基因缺失可通过增强总自噬及线粒体自噬促进hADSCs的成脂。     

和厚朴酚对癫痫小鼠学习记忆能力的改善作用

目的: 探索和厚朴酚对癫痫小鼠学习记忆能力的改善作用并探讨其机制。方法: 5周龄雄性ICR小鼠采用腹腔注射红藻氨酸（38 mg/kg）的方式建立癫痫模型。治疗组小鼠腹腔注射和厚朴酚（3、10、30 mg/kg）10 d。Fluoro-Jade B染色法检测神经元活性;Morris水迷宫和Y迷宫实验观察小鼠学习记忆能力;蛋白质印迹法检测乙酰化超氧化物歧化酶（SOD）、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和P62蛋白表达水平;硫代巴比妥酸法和WST-1法分别测定丙二醛和SOD等氧化应激产物的含量。结果: 与对照组比较,模型组神经元凋亡数量增加,学习记忆能力下降,乙酰化SOD和丙二醛表达量增加,SOD活性下降,LC3-Ⅱ和P62蛋白表达量增加（P < 0.05或P < 0.01）;与模型组比较,和厚朴酚10 mg/kg和30 mg/kg均可减少神经元凋亡数量,改善学习记忆能力,并可逆转癫痫发作所致的丙二醛和SOD乙酰化水平,降低LC3-Ⅱ和P62的表达量（P < 0.05或P < 0.01）,且药物剂量为30 mg/kg时效果更加显著。结论: 和厚朴酚可缓解癫痫发作导致的氧化应激和自噬降解障碍,减少神经元凋亡,从而改善癫痫小鼠的学习记忆能力。     

miR-152通过靶向FGF2抑制肺癌A549细胞系的增殖侵袭

目的:探讨miR-152通过靶向成纤维细胞生长因子2（FGF2）对肺癌A549细胞系的增殖和侵袭的作用机制。方法:通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测正常上皮细胞BEAS-2B和肺癌A549细胞中miR-152和FGF2的表达情况;采用转染技术,分别特异性表达肺癌A549细胞系中miR-152和FGF2基因的表达。将肺癌A549细胞系分为6组:miRNA 空转组（miR-NC组）、miR-152 过表达组（miR-152 mimics组）、miR-152 抑制组（miR-152 inhibitor组）、FGF2过表达空转组（pcDNA3.1-NC组）、FGF2过表达组（pcDNA3.1-FGF2组）和miR-152过表达+FGF2过表达组（miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组）。通过qPCR检测A549细胞系中miR-152和FGF2的表达水平;细胞克隆和Transwell小室实验分别检测A549细胞系的增殖和侵袭能力;采用双荧光报告基因法验证miR-152与FGF2结合情况;Western印迹法检测A549细胞系中FGF2、自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）Ⅱ/Ⅰ、beclin1和p62的表达量。结果:qPCR结果显示,与正常上皮细胞BEAS-2B比较,肺癌A549细胞中miR-152的表达量显著降低（P＜0.01）,而FGF2的表达量显著增加（P＜0.01）。TargetScan生物信息学软件预测显示miR-152与FGF2的3′UTR结合,双荧光报告基因检测结果显示,miR-152与FGF2直接结合。细胞克隆和Transwell小室实验结果显示,与miR-NC组比较,miR-152 mimics组中的A549细胞系的增殖和侵袭能力显著减低（P＜0.05）,miR-152 inhibitor组的增殖和侵袭能力显著增加（P＜0.05）。与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-FGF2组中的A549细胞系的增殖和侵袭能力显著增加（P＜0.05）。与miR-152 mimics组比较,miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组中A549细胞系的增殖和侵袭能力显著增加（P＜0.05）。Western印迹结果显示,与miR-NC组比较,miR-152 mimic组FGF2和p62蛋白表达显著降低（P＜0.05）,但LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1的表达量显著增加（P＜0.05）,而miR-152 inhibitor组结果与之相反。与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-FGF2组FGF2和p62蛋白表达显著增加（P＜0.05）,而LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1的表达量显著降低（P＜0.05）。与miR-152 mimics组比较,miR-152+ pcDNA3.1-FGF2组FGF2和p62蛋白表达显著增加（P＜0.05）,LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。结论:miR-152靶向FGF2抑制肺癌A549细胞系自噬,从而降低增殖侵袭能力,可成为肺癌临床治疗的新靶点。     

异丙肾上腺素诱导的心功能不全中自噬的变化

目的 探讨在异丙肾上腺素诱导的心功能不全中自噬的变化。方法 用异丙肾上腺素腹腔注射法建立小鼠心功能不全模型;小动物超声影像系统检测心功能指标射血分数（ejection fraction,EF）、左室缩短率（fractional short,FS）、舒张早期充盈峰值/房缩期充盈峰值（ratio of early peak flow velocity and atrium peak flow velocity,E/A）和室间隔厚度（interventricular septum,IVS）的变化;尾压法间接检测血流动力学指标——心率（heart rate,HR）、收缩压（systolic blood pressure,SBP）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）和平均动脉压（mean blood pressure,MBP）的变化;心质量体质量比法即心脏质量（heart weight,HW）/体质量（body weight,BW）检测心脏质量指数的变化;Western blotting印迹法检测心脏组织中自噬标志物LC3、p62的变化。结果 与对照组相比,异丙肾上腺素模型组在4周后,小鼠心功能下降,EF下降、FS下降、IVS增加,差异具有统计学意义;同时模型组小鼠HR和DBP低于对照组,差异具有统计学意义;心脏质量指数指标（HW/BW）显示模型组较对照组增高;自噬标志物检测显示,异丙肾上腺素注射1 d和3 d后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,p62蛋白的相对量降低;连续注射4周后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与p62蛋白的相对量恢复至对照组水平。结论 异丙肾上腺素诱导的心功能不全过程中,心肌自噬早期升高,晚期恢复至正常水平。     

利福平通过促进自噬保护帕金森病模型细胞损伤

目的: 探讨利福平对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)多聚体水平的影响及其与细胞自噬的关系。方法: 用不同浓度鱼藤酮、利福平、自噬抑制剂氯喹和自噬促进剂雷帕霉素处理SH-SY5Y细胞,MTT法检测细胞存活率,筛选最佳实验浓度;蛋白质印迹法检测氯喹和雷帕霉素处理后不同时间点细胞内Beclin-1表达水平,确定最佳作用时间;蛋白质印迹法检测鱼藤酮、氯喹和雷帕霉素处理后Beclin-1和α-syn多聚体的表达;将SH-SY5Y细胞分为对照组、鱼藤酮组、利福平+鱼藤酮组和利福平组,流式细胞术检测4组细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测α-syn多聚体及自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62的表达;在上述分组基础上,蛋白质印迹法检测氯喹和雷帕霉素预处理后各组细胞α-syn多聚体的表达。结果： 利福平浓度为150 μmol/L时细胞存活率最高;氯喹、雷帕霉素调节自噬的最佳处理条件分别为10 μmol/L(1 h)、10 nmol/L(2 h);与对照组相比,鱼藤酮、氯喹均能显著增加细胞内α-syn多聚体表达(P均＜0.01),降低Beclin-1表达(P均＜0.05),雷帕霉素能显著提高Beclin-1表达(P＜0.01);与对照组比较,鱼藤酮组细胞凋亡率明显上升(P＜0.05),p62和α-syn多聚体表达增加,Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达明显降低(P均＜0.01);与鱼藤酮组相比,利福平+鱼藤酮组细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),p62和α-syn多聚体表达明显减少,Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达明显升高(P均＜0.01);与利福平+鱼藤酮组比较,氯喹预处理后α-syn多聚体表达明显增加(P＜0.01)。 结论： 利福平能减少鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元凋亡,可能通过促进细胞自噬降低α-syn多聚体表达。